高文勇 吳瓊瑩 艾艷萍 李姣 魏海棠

(武漢市漢口醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科,湖北 武漢 430012;2康復醫(yī)學科)

多發(fā)性腦梗死(MCI)是指腦內(nèi)有多個因缺血而產(chǎn)生的軟化病死灶,又稱為多發(fā)性腦軟化,可導致患者產(chǎn)生癱瘓、語言障礙、認知障礙、癡呆等不良癥狀,對患者的生命安全及生活質(zhì)量造成不良影響,膠質(zhì)細胞、神經(jīng)細胞等腦組織內(nèi)的炎癥反應是腦梗死期間腦損傷的主要原因之一〔1,2〕。星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的大膠質(zhì)細胞,對腦發(fā)育及神經(jīng)功能至關(guān)重要,腦梗死時星形膠質(zhì)細胞會發(fā)生細胞變性、增殖增強等一系列的病理反應,進而加劇腦損傷〔3,4〕。Toll樣受體(TLR)4是天然免疫受體,可激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB通路,誘導腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎癥因子的表達,在腦缺血再灌注大鼠炎癥反應中發(fā)揮促進作用〔5,6〕。因此探究具有抑制星形膠質(zhì)細胞活性、腦組織炎癥反應的藥物對于治療MCI具有積極作用。地佐辛是一種阿片受體激動、拮抗劑,主要用于術(shù)后鎮(zhèn)痛、消炎等,對乳腺癌改良術(shù)后炎癥介質(zhì)、應激反應具有一定的抑制作用〔7〕,對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能、腦損傷等具有一定的保護作用〔8〕,對大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞活性及遷移能力具有一定的抑制作用〔9〕,因此本研究通過探究地佐辛對MCI大鼠星形膠質(zhì)細胞活性及TLR4/NF-κB通路的影響。

1 資料與方法

1.1動物 40只SD雄性大鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司),SPF級,生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2016-0011,體質(zhì)量250～300 g。所有大鼠于武漢市漢口醫(yī)院動物房中飼養(yǎng),12 h晝夜交替,自由飲食、飲水,溫度約25 ℃,相對濕度約50%,保持動物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。在實驗過程中按照動物使用的“3R”原則給予人道主義關(guān)懷。本研究經(jīng)動物倫理委員會批準同意。

1.2主要試劑及儀器 地佐辛、尼莫地平(CAS號:53648-55-8、66085-59-4)購于上海源葉生物科技有限公司;海藻酸鈉微球血管栓塞劑(北京圣醫(yī)耀科技發(fā)展有限責任公司);大鼠TNF-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號:ml002859、ml037361、ml102828)購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、RIPA組織裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒(貨號:G1120、R0020、PC0020)購于北京索萊寶科技有限公司;兔源神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、TLR4、髓樣分化因子(MyD)88、NF-κB、β-actin抗體(貨號:ab7260、ab217274、ab219413、ab220803、ab8227)購于Abcam公司;低溫高速離心機(美國Sigma公司);包埋機、切片機、染色機、封片機(德國Leica公司);正置熒光顯微鏡、光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司);恒溫水浴箱(上海博訊有限公司);酶標儀(美國Thermo公司);蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3動物模型制備及分組給藥 50只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組(8只)、MCI造模組(32只),MCI大鼠模型的構(gòu)建參考文獻〔10〕中的微球法,將大鼠持仰臥位固定,腹腔注射3.5%的水合氯醛麻醉大鼠,頸部皮膚常規(guī)消毒,于頸部正中做切口,暴露并分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈,結(jié)扎大鼠頸外動脈遠心端,夾閉頸總動脈,用注射器由外動脈向內(nèi)動脈注射0.1 ml的海藻酸鈉微球血管栓塞劑,使栓塞劑由動脈到達腦內(nèi)動脈,形成多發(fā)性腦梗死,松開動脈夾,結(jié)扎頸外動脈近心端,縫合傷口回籠飼養(yǎng),假手術(shù)組由0.1 ml的0.9%氯化鈉注射液代替栓塞劑,其余操作相同。大鼠蘇醒后對其進行神經(jīng)功能缺損評分,分數(shù)為1～3分認為MCI大鼠造模成功。造模期間出現(xiàn)大鼠死亡或不符合條件的現(xiàn)象,及時選取備用大鼠進行MCI模型的構(gòu)建。

將造模成功的MCI大鼠隨機分為模型組、地佐辛低劑量組(尾靜脈注射地佐辛,5 mg/kg)、地佐辛高劑量組(尾靜脈注射地佐辛,10 mg/kg)〔8〕、尼莫地平組(尾靜脈注射尼莫地平2 mg/kg)〔11〕,每組8只,按照各組給藥劑量進行給藥處理,連續(xù)14 d。

1.4各組神經(jīng)功能缺損評分 在給藥第0、7、14天進行神經(jīng)功能缺損評分,評分標準參考〔12〕,0分:無神經(jīng)功能缺損癥狀,1分:不能完全伸展左側(cè)前爪等輕微神經(jīng)功能缺損癥狀,2分:向一側(cè)轉(zhuǎn)圈等中度神經(jīng)功能缺損癥狀,3分:向一側(cè)傾倒等重度神經(jīng)功能缺損癥狀,4分:完全不能行走、意識障礙。

1.5各組腦組織HE染色觀察 將大鼠麻醉處死后取腦組織,每組取3只大鼠腦組織,修剪合適后于組織脫水機中脫水透明處理,將處理過的腦組織包埋于融化的石蠟中,待其凝固后切成厚約4 μm的切片,60 ℃烤片后采用HE染色試劑盒對大鼠腦組織進行HE染色處理,具體操作參考試劑盒中的說明書,封片后于顯微鏡下觀察。

1.6各組大鼠腦組織中星形膠質(zhì)細胞活性測定 星形膠質(zhì)細胞超微結(jié)構(gòu)觀察:取1.5中剩余大鼠腦梗死組織適量(體積約為1 mm3),于4%戊二醛中固定1 h,經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后用鋨酸固定2.5 h,用PBS清洗,經(jīng)梯度乙醇脫水處理,用環(huán)氧樹脂包埋后切成厚度約為60 nm的薄片,經(jīng)檸檬酸鉛、醋酸鈾染色后電鏡下觀察星形膠質(zhì)細胞形態(tài)。

免疫組化法檢測星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP活性:取大鼠腦組織常規(guī)石蠟切片,60 ℃烘片6 h,經(jīng)滴度乙醇脫蠟至水,用檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復,用PBS沖洗3次后滴加10%血清進行封閉處理,加入兔源GFAP抗體,4 ℃過夜,37 ℃復溫,加入羊抗兔二抗,經(jīng)過二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、PBS沖洗后封片、觀察。

1.7各組腦組織中炎癥因子水平測定 取剩余5只大鼠腦組織適量,加入適量生理鹽水用勻漿機制成腦組織勻漿,離心取上清液,根據(jù)TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒說明書進行炎癥因子水平的測定。

1.8各組腦組織TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達檢測 取大鼠腦組織適量,用RIPA組織裂解液提取腦組織中總蛋白質(zhì),離心取上清液,用BCA試劑盒測定其中蛋白質(zhì)水平,將腦組織用蛋白上樣液調(diào)至相同濃度,高溫加熱變性,采用電泳實驗分離蛋白,將分離的蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入8%的脫脂奶扥封閉處理,分別加入兔源TLR4(1∶200)、MyD88(1∶200)、NF-κB(1∶200)、β-actin(1∶5 000)一抗,4 ℃過夜,用TBST漂洗3次,加入辣根過氧化物酶標記的相應二抗,室溫孵育1 h,經(jīng)過顯色、定影后觀察并分析。

1.9統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism8軟件進行方差分析,兩組間比較行LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能缺損評分比較 給藥第0、7、14天,與假手術(shù)組相比,其余各組神經(jīng)功能缺損評分顯著升高(P<0.05);給藥第7、14天,與模型組相比,地佐辛各劑量組及尼莫地平組神經(jīng)功能缺損評分顯著降低(P<0.05),且有一定的劑量依賴效應,與地佐辛各劑量組相比,尼莫地平組神經(jīng)功能缺損評分明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組不同給藥時間神經(jīng)功能缺損評分分)

2.2各組腦組織 假手術(shù)組腦組織無明顯病變,形態(tài)基本正常,神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)清晰,核仁核膜等結(jié)構(gòu)基本正常;模型組腦組織病變明顯,神經(jīng)細胞排列疏松,出現(xiàn)嚴重腫脹、空泡化等現(xiàn)象;與模型組相比,地佐辛各劑量組及尼莫地平組腦組織神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)得到一定緩解,其中尼莫地平效果較好。見圖1。

圖1 各組腦組織(HE染色,×200)

2.3各組腦組織星形膠質(zhì)細胞超微結(jié)構(gòu)及GFAP活性測定 假手術(shù)組腦組織中星形膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)正常,細胞器正常,腦組織中GFAP蛋白表達(0.23±0.03)顯著較低;與假手術(shù)組相比,模型組腦組織中星形膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)異常,出現(xiàn)嚴重腫脹、細胞核染色加深等不良表現(xiàn),腦組織中GFAP蛋白表達(0.67±0.06)顯著升高(P<0.05);與模型組相比,地佐辛低、高劑量組、尼莫地平組腦組織中星形膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)得到一定緩解,腦組織中GFAP蛋白表達(0.29±0.04、0.23±0.03、0.11±0.02)顯著降低(P<0.05),其中尼莫地平效果較好。見圖2、圖3。

圖3 各組腦組織GFAP蛋白表達(免疫組化染色,×200)

2.4各組腦組織炎癥因子水平比較 與假手術(shù)組相比,模型組、地佐辛低、高劑量組、尼莫地平組腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,地佐辛各劑量組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05),且呈現(xiàn)一定的劑量效應關(guān)系;與地佐辛各劑量組相比,尼莫地平組腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組腦組織炎癥因子水平及TLR4/NF-κB通路蛋白表達比較

2.5各組腦組織TLR4/NF-κB通路蛋白表達比較 與假手術(shù)組相比,模型組、地佐辛低、高劑量組、尼莫地平組腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達顯著升高(P<0.05);與模型組相比,地佐辛各劑量組腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達顯著降低(P<0.05),且呈現(xiàn)一定的劑量效應關(guān)系;與地佐辛各劑量組相比,尼莫地平組腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見表2、圖4。

1～5:正常對照組、模型組、地佐辛低劑量組、地佐辛高劑量組、尼莫地平組圖4 各組腦組織TLR4/NF-κB通路蛋白表達

3 討 論

MCI與動脈粥樣硬化、動脈狹窄動脈硬化斑塊脫落等多種疾病密切相關(guān),具有較高的致殘率及復發(fā)率,嚴重影響患者生活質(zhì)量〔13〕。腦缺血后炎癥反應是加劇神經(jīng)功能、腦細胞受損的重要病理環(huán)節(jié)之一,腦壞死區(qū)域TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子釋放、白細胞浸潤、小膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞異常激活均可促進機體炎癥反應,加劇腦損傷〔14,15〕。

地佐辛常用于各大手術(shù)后的鎮(zhèn)痛,同時具有控制術(shù)后炎癥反應及氧化應激反應等作用〔16〕,對于腦缺血再灌注大鼠腦損傷、神經(jīng)元損傷、神經(jīng)功能缺損具有一定的保護作用〔8,17〕。本研究結(jié)果提示,地佐辛具有顯著改善MCI大鼠腦損傷及神經(jīng)功能的作用,但其可能作用機制仍不清晰。

腦梗死后腦組織缺血壞死,腦內(nèi)血管內(nèi)皮細胞嚴重受損,受損部位會產(chǎn)生大量的炎性細胞因子,炎性細胞的聚集及浸潤將會增加缺血區(qū)腦組織的損傷,進而造成不可逆的神經(jīng)功能受損〔18〕。星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的膠質(zhì)細胞,腦梗死后腦部炎癥反應引起星形膠質(zhì)細胞的異常激活,導致星形膠質(zhì)細胞增殖能力增強、細胞肥大,活化的星形膠質(zhì)細胞又會誘導小膠質(zhì)細胞分化與增殖并促進TNF-α、IL-1β等炎癥因子的大量釋放,進而影響神經(jīng)元突觸重建及生長,加劇腦損傷〔19〕。GFAP是星形膠質(zhì)細胞特異性標志物,測定腦組織中GFAP蛋白的表達可側(cè)面反映星形膠質(zhì)細胞活性〔20〕。TLR4/NF-κB通路是重要的炎癥反應通路,在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用,TLR4是重要的天然免疫受體,MyD88為TLR4通路重要的銜接分子,腦損傷后TLR4可誘導NF-κB激活,進而促進腦組織炎癥因子釋放,從而加劇腦損傷,抑制TLR4/NF-κB通路的激活對于抑制腦缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應、改善神經(jīng)功能具有積極的促進作用〔21～23〕。本研究結(jié)果提示,地佐辛可顯著降低MCI大鼠腦部炎癥反應及星形膠質(zhì)細胞活性,對TLR4/NF-κB通路具有一定的抑制作用。