韓雨晴 李星星 郭文軍 張洪銘 孫元鶴 解生旭 席中原 徐雅娟

(1長春中醫(yī)藥大學(xué),吉林 長春 130117;2吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)重點實驗室)

哮喘又稱支氣管哮喘,由基因和環(huán)境共同作用,是一種慢性炎癥疾病,在全球影響約3億人〔1〕。哮喘中老年人約占13%,發(fā)病率和死亡率相對較高,嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量〔2〕。目前治療藥物主要分為皮質(zhì)類固醇、β2受體激動劑、白三烯受體拮抗劑、過敏原免疫療法等,盡管它們可以控制癥狀,但不能影響疾病的進(jìn)程,伴有依從性、耐受性差、副作用等不良影響〔3,4〕。在中醫(yī)中哮喘屬于哮病,為外邪侵犯機(jī)體,表邪不去,邪阻于肺,氣機(jī)不暢,氣不布津,聚集成痰。中醫(yī)藥在治療哮喘中療效確切、副作用小,更適合于老年人〔5～7〕?！督饏T要略》中提出哮病的治療方法,如“咳而上氣,喉中水雞聲,射干麻黃湯主之?！鄙涓陕辄S湯為經(jīng)典名方,由射干、麻黃、細(xì)辛、生姜、大棗、紫菀、半夏、五味子、款冬花組成,主要治療寒飲郁肺所致的咳喘證,具有祛痰抗炎的功效〔8〕。在臨床上可以緩解哮喘癥狀,改善呼吸功能,且安全性好〔9,10〕。本研究建立卵清白蛋白致大鼠哮喘模型,評價射干麻黃湯(SMD)治療哮喘的療效,基于液質(zhì)(LC-MS)的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)研究SMD治療哮喘的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動物、試劑與儀器 動物:72只SPF級SD雄性大鼠,體質(zhì)量150～170 g,平均(160±10)g,購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)2020-0001。質(zhì)量合格證號:2107262-10100133882。藥物與試劑:卵清白蛋白,Sigma公司產(chǎn)品北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司分裝,批號:BOBM10210V。氫氧化鋁,Sigma公司產(chǎn)品,批號:MKCM1237。滅活百日咳桿菌抗原,凍干粉,純度>95%,愛必信(上海)生物科技有限公司,貨號:abs03015。C反應(yīng)蛋白(CRP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒,上海滬峰化工有限公司。醋酸地塞米松片,安徽金太陽生化藥業(yè)有限公司,產(chǎn)品批號:2007222。儀器:Vanquish Duo 超高效液相色譜儀、Q-Ecactive 質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Science);GL-21M 高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);DNM-9602型酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司);ZT-14V2生物組織脫水機(jī)(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司);RM2255切片機(jī)(德國Leica公司);YR-21蘇木素-伊紅(HE)染色機(jī)(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司);YB-6LF包埋機(jī)(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司);YT-7FB攤片機(jī)(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司);BX51顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2SMD的制備 SMD由細(xì)辛、紫菀、麻黃、射干、半夏、五味子、款冬花、生姜和大棗組成。準(zhǔn)確稱量粉碎的藥材,然后用1∶25(W/V)的沸水煎煮2次,1.5 h/次。用紗布過濾后,合并濾液,在70 ℃的真空蒸發(fā)器中濃縮。最后,濾液濃縮為1.743 g原藥材/g提取物。

1.3動物分組、造模與給藥 經(jīng)過7 d的適應(yīng)期,所有大鼠被隨機(jī)分成:對照(NC)組、模型(OVA)組、地塞米松(Dex,0.75 mg/kg)組、低劑量SMD治療(SMD-L,3.275 g/kg)組、中劑量SMD治療(SMD-M,6.55 g/kg)組、高劑量SMD治療(SMD-H,13.1 g/kg)組各12只。采用體內(nèi)注射卵清白蛋白法建立大鼠過敏性哮喘模型。除NC組外所有大鼠在第1天和第8天每只多點注射(四肢內(nèi)側(cè)皮下、腹腔各0.2 ml)致敏液1 ml〔1 ml致敏液含10 mg卵清白蛋白和100 mg氫氧化鋁,由磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解〕,同時腹腔注射滅活百日咳桿菌抗原1 ml(1支抗原用PBS定容至100 ml)。從第15天開始,除NC組外,其余大鼠每天接受2%卵清白蛋白霧化,持續(xù)2 w。NC組在第1天和第8天腹腔注射PBS,然后在第15天用PBS進(jìn)行霧化,持續(xù)2 w。地塞米松和SMD治療組的動物從第15天起在卵清白蛋白霧化前1 h口服地塞米松和SMD,1次/d,共14 d。NC組和OVA組用相同體積的蒸餾水灌胃。

1.4樣本收集與制備 各組大鼠在末次激發(fā)2 h后,腹主動脈采血,室溫靜置1 h后,3 000 r/min離心10 min取血清,用ELISA檢測血清中CRP的含量。取左葉肺放入4%甲醛溶液中,用于HE染色。于末次激發(fā)后,每只大鼠灌胃蒸餾水8 ml,放入代謝籠中,接尿2 h,放置于-80 ℃冰箱儲存。根據(jù)藥效結(jié)果綜合評定,以SMD-M組進(jìn)行代謝組學(xué)研究。將儲存的冷凍尿液樣本在4 ℃解凍,在使用前混合均勻。取200 μl尿樣,以15 000 r/min 在4 ℃離心10 min,取100 μl上清液,加入100 μl水,混合均勻,用于LC-MS分析。使用上述方法制備尿液質(zhì)控樣本(QC),以優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件及方法驗證。

1.5生化指標(biāo)檢測 使用ELISA檢測血清CRP含量。取4%甲醛溶液中左葉肺,固定后常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,HE染色,顯微鏡觀察組織變化。

1.6色譜及質(zhì)譜條件 使用Vanquish Duo超高效液相色譜儀和Q Exactive質(zhì)譜儀對尿液樣品的代謝情況進(jìn)行分析。色譜柱:Hypersil GOLD柱(2.1 mm×50 mm,1.9 μm),柱溫:50 ℃,進(jìn)樣量:2 μl。流動相由含0.1%甲酸的水(A相)和乙腈(B相)組成,以0.4 ml/min的速度進(jìn)行梯度操作: 0.5%B(0～1 min),0.5%→1%B(1～2 min),1%→5%B(2～3 min),5%→15%B(3～8 min),15%→50%B(8～10 min),50%→95%B(10～12 min),95%→0.5%B(12～13 min),0.5%B(13～18 min)。

色譜分離后,被注入Q-Orbitrap MS。數(shù)據(jù)采集分別在正離子和負(fù)離子模式下操作。全掃描分析中質(zhì)量范圍被設(shè)定為100～1 500 m/z,分辨率為35 000。二級的分辨率為17 500,使用數(shù)據(jù)依賴性(ddMS2 Top 15)采集獲得的。ESI源參數(shù)設(shè)置如下:毛細(xì)管電壓設(shè)置為正離子模式3.8 kV、負(fù)離子模式-3.5 kV,鞘內(nèi)氣體流量為60 arb,輔助氣體流量為15 arb,毛細(xì)管溫度為300 ℃。

1.7數(shù)據(jù)處理 將原始譜圖導(dǎo)入Compound Discoverer3.1軟件中進(jìn)行色譜峰的提取、標(biāo)準(zhǔn)化等處理。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到SIMCA-P14.1 軟件進(jìn)行偏最小二乘判別分析(PLS-DA),以投影值(VIP)>1.8進(jìn)行初步篩選。將篩選出來的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到MetaboAnalyst 5.0 以差異倍數(shù)(fold-change)>1.5或<0.66和P<0.05篩選差異代謝物。根據(jù)HMDB和Compound Discoverer數(shù)據(jù)庫結(jié)合二級碎片離子對其進(jìn)行鑒定指認(rèn)。使用OECloud tools進(jìn)行聚類分析,觀察差異代謝物的變化趨勢。被SMD逆轉(zhuǎn)的差異代謝輸入到MetaboAnalyst5.0進(jìn)行通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1生化指標(biāo)結(jié)果 對肺組織進(jìn)行HE染色,NC組肺組織有完整的支氣管黏膜上皮和黏膜肌層,支氣管腔規(guī)則,無腺體增生,炎癥細(xì)胞浸潤少。OVA組肺組織顯示炎癥細(xì)胞嚴(yán)重浸潤至血管周圍和結(jié)締組織,管腔變窄,黏膜增厚。Dex和SMD治療明顯減弱了造模引起的病理變化,見圖1。與NC組〔(8.43±0.84)μg/ml〕相比,OVA組血清中CRP含量〔(10.11±1.41)μg/ml〕明顯升高(P<0.01)。與OVA組相比,Dex組〔(8.62±0.75)μg/ml〕、SMD-H組〔(8.09±0.48)μg/ml〕、SMD-M組〔(8.31±1.03)μg/ml)〕、SMD-L組血清中CRP含量〔(8.52±0.88)μg/ml〕明顯降低(均P<0.01)。

2.2多元統(tǒng)計學(xué)分析 為了確定樣本分析時的穩(wěn)定性,獲得可以重復(fù)的代謝產(chǎn)物,每10針檢測1次QC,對QC樣品進(jìn)行主成分分析(圖2)。QC相聚在一起,表明儀器穩(wěn)定性良好,獲得的數(shù)據(jù)可信賴。

A為正離子模式,B為負(fù)離子模式圖2 QC的PCA得分

對NC組和OVA組進(jìn)行PLS-DA分析,兩組間主成分顯著分開,表明造模后發(fā)生了代謝紊亂。經(jīng)SMD-M治療后,紊亂的代謝物得到糾正(圖3)。

A和C為正離子模式,B和D為負(fù)離子模式圖3 3組尿液PLS-DA得分

2.3差異代謝物的鑒定 經(jīng)非靶向分析,造模后尿液樣本共篩選和鑒定出29個差異代謝物,其中21個被SMD-M逆轉(zhuǎn)調(diào)節(jié),見表1。采用聚類分析法對差異代謝物進(jìn)行分析,直觀地展現(xiàn)差異代謝的變化趨勢,見圖4。

表1 尿液的差異代謝物

圖4 尿液差異代謝物的聚類分析熱圖

2.4代謝通路分析 將SMD-M組逆轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)的差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst5.0進(jìn)行通路富集分析,得到主要的通路為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,酪氨酸代謝,牛磺酸和亞?；撬岽x,泛醌和其他萜類醌生物合成,苯丙氨酸代謝,見圖5。

圖5 通路氣泡

3 討 論

本研究證明,SMD具有抗哮喘作用。對尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析,進(jìn)一步確定SMD的療效。CRP是急性反應(yīng)蛋白之一,血清CRP增加與哮喘嚴(yán)重程度呈正相關(guān),是評價哮喘狀態(tài)的合理依據(jù)〔11〕。這與本研究結(jié)果相一致,表明SMD可以減輕肺部炎癥,發(fā)揮作用。

在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、酪氨酸代謝和苯丙氨酸代謝的3條通路中,酪氨酸由苯丙氨酸在體內(nèi)羥基化產(chǎn)生,是合成激素的重要原料,酪氨酸水平降低,減少激素合成,進(jìn)而影響哮喘〔12〕。據(jù)報道,L-酪氨酸的微生物代謝對過敏性氣道炎癥具有保護(hù)作用,其腸道代謝物-甲酚硫酸鹽選擇性地減少氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子配體20,保護(hù)宿主免受過敏性氣道炎癥〔13〕。造模后酪氨酸含量降低,導(dǎo)致激素合成的減少,給藥后酪氨酸含量增加,表明SMD可能通過增加激素合成和減少氣道炎癥發(fā)揮作用。

?；撬峥纱x為5-L-谷氨酰-?；撬??；撬釣閺V泛存在于哺乳動物體內(nèi)的β自由氨基酸,具有膜穩(wěn)定、維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡、抗炎等作用,是一種細(xì)胞保護(hù)劑。通過監(jiān)測?；撬釋ο嗍髿獾姥装Y的影響,發(fā)現(xiàn)其可以減少嗜酸性粒細(xì)胞的聚集〔14〕,也有研究表現(xiàn),牛磺酸可以通過抑制Toll樣受體(TLR)-4/核因子(NF)-κB途徑,減輕肺部炎癥〔15〕。同時臨床上哮喘患者給予牛磺酸片后,其抑制炎癥介質(zhì)的釋放,緩解了哮喘患者的臨床癥狀〔16〕。在代謝組學(xué)結(jié)果中表明5-L-谷氨酰-?；撬嵩炷：蠛拷档?這與文獻(xiàn)〔17〕報道哮喘患者血清游離氨基酸譜中結(jié)果一致,經(jīng)SMD給藥后其水平得到調(diào)節(jié),進(jìn)而起到平喘的作用。推測SMD可能通過抑制TLR-4/NF-κB途徑發(fā)揮治療哮喘的作用,這為后續(xù)研究提供了新的方向。

綜上,SMD可降低哮喘大鼠的CRP含量,改善肺組織狀態(tài),并通過逆轉(zhuǎn)L-酪氨酸、5-L-谷氨酰-?；撬帷?0-氧代-白三烯B4等代謝產(chǎn)物,調(diào)節(jié)酪氨酸代謝、牛磺酸和亞?；撬岽x,起到平喘的效果。