蘇崢，任海朋，依荷芭麗·遲

1濰坊市人民醫(yī)院腫瘤內科，山東 濰坊 261041

2中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所內科，北京 100021

調節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg）是免疫負性調節(jié)細胞，表達CD4 和CD25，在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，也在腫瘤微環(huán)境中扮演抑制角色。減輕或逆轉免疫抑制是抗腫瘤免疫治療的思路之一，多個免疫檢查點抑制劑已成熟應用于臨床；但治療中仍存在耐藥、超進展等問題，聯合應用其他的免疫調節(jié)手段是探索的方向，其中調控Treg 是有前景的治療方法之一。本文將闡述Treg 的特征、功能和作用機制，重點對Treg 在腫瘤免疫治療中的研究進展進行綜述。

1 Treg 的分類和分子標記

Treg 分為內源性和外源性。內源性Treg 絕大部分來源于胸腺，由T 細胞受體/主要組織相容性復合體（T cell receptor/major histocompatibility complex，TCR/MHC）多肽誘導產生；還有一部分來源于外周，由低劑量高親和性同源肽誘導，作用是減輕無害抗原的炎癥反應。外源性Treg 是在外源性抗原刺激下外周T 細胞產生的。CD25 和叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，FOXP3）是Treg 良好的分子標記，FOXP3 更加特異；FOXP3是調節(jié)Treg 發(fā)育的關鍵基因，可以誘導傳統(tǒng)T 細胞（conventional T cell，Tconv）向Treg 轉化[1]，與Treg 轉錄調控、表觀基因修飾有關，還可以通過轉錄后修飾影響Treg功能[2]。Treg 的生成和成熟過程中重要的調節(jié)因子是白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2），當胸腺及外周IL-2 降低時，Treg 成熟障礙，自身免疫性疾病發(fā)生率增高[3]。

2 Treg 發(fā)揮免疫抑制功能的機制

Treg 通過影響抗原呈遞細胞（antigen-presenting cell，APC）及樹突狀細胞（dendritic cell，DC）降低抗原識別的敏感性[4]；通過物理屏障方式[5]以及高表達的淋巴細胞活化基因3（lymphocyte activating 3，LAG3）[6]阻止DC 成熟和抗原呈遞；Treg 持續(xù)表達糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體家族相關蛋白（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor family associated protein，GITR）、細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4），直接抑制效應T 細胞（effector T cell，Teff）的活性[7-8]；并以高親和力與IL-2 結合，耗竭微環(huán)境中的IL-2，阻礙Tconv 的功能維持和成熟[9]。Treg 分泌多種免疫抑制激酶直接殺傷Teff，還能誘導其他T 細胞表達FOXP3，產生更多Treg，稱為傳染性免疫耐受[10]。

3 Treg 與腫瘤免疫的關系

腫瘤細胞、巨噬細胞、DC 等分泌轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、IL-10、CC 趨化因子配體22（CC chemokine ligand 22，CCL22），誘導Treg 向腫瘤局部聚集[11-12]。腫瘤浸潤免疫細胞（tumor infiltrating immune cell，TIC）中Treg 比例明顯增高，包括子宮內膜癌[13]、非小細胞肺癌[14]、肝癌[15]、膀胱癌[16]、胃癌[17]等，升高的比例與較差的預后相關。腫瘤浸潤Treg 高表達多種免疫抑制分子，如CTLA4、程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）、PD-L2、GITR、LAG3、T 細胞免疫球蛋白與黏蛋白家族成員3（T-cell immunoglobulin mucin family member 3，TIM3）、腫瘤壞死因子受體超家族成員4（tumor necrosis factor receptor superfamily member 4，TNFRSF4，又稱OX40）等，具有高度抑制活性[18]。Treg 抑制記憶性CD8+T 細胞的活性，抑制免疫記憶功能[19]，還可以通過細胞間接觸阻止T 細胞跨內皮遷移，影響T 細胞向腫瘤募集[20]。腫瘤細胞利用糖酵解耗竭微環(huán)境中的葡萄糖，并產生乳酸、脂肪酸等代謝產物[21]；其他T 細胞依賴葡萄糖轉運體和有氧糖酵解，增殖和活性受到抑制；而Treg 依賴脂質線粒體氧化和丙酮酸[22]，在脂肪酸聚集的腫瘤微環(huán)境中數量上調。

4 調節(jié)Treg 抗腫瘤的策略和前景

免疫治療是有效的抗腫瘤治療方式。通過調節(jié)Treg 改變機體免疫抑制狀態(tài)，配合現有的治療手段，發(fā)揮直接和間接的抗腫瘤活性將成為免疫治療潛在的靶點之一。調節(jié)Treg 的方法包括減少Treg 數量和抑制Treg 活性等，根據作用機制不同，主要分為以下幾類。

4.1 減少Treg 數量

通過減少Treg 數量恢復抗腫瘤免疫是最早探索的方法。①傳統(tǒng)的化療藥物：低劑量環(huán)磷酰胺（200 mg/m2）、多柔比星（35 mg/m2）、紫杉醇等被證實能夠減少Treg，增加特異性CD8+T 細胞活性；化療藥物發(fā)揮抗腫瘤作用，釋放腫瘤抗原，是聯合免疫治療的良好選擇。但是化療藥物作為免疫激活劑的治療窗較窄，劑量過大會殺傷Teff，導致免疫抑制[23]。②特異性抗體：針對CD25 的抗體地尼白介素可以導致小鼠模型50%以上的Treg 減少，但半衰期較短，Treg 可在短期內恢復，并未改善生存。另一種抗體PC-61半衰期較長，能夠降低65%～70%的Treg，聯合腫瘤疫苗使用可以改善生存，但是剩余30%左右的Treg 還可以發(fā)揮免疫抑制作用，在腫瘤較小時有效率高，較大時療效欠佳[24]。③白喉毒素（diphtheria toxin，DT）：DT 可以消除90%以上表達DT受體的Treg，并且對PC-61消除效果不佳的Treg有效，但要達到消除90%以上Treg的DT 劑量較大，機體難以耐受[25]，在應用中受到限制。④其他抗體：IL-2和caspase 3結合物（IL2-cas）[26]、抗CCR4 免疫毒素[27]等在動物實驗中都可以減少Treg 數量，起到抗腫瘤活性。直接消耗Treg 無法精準消耗腫瘤特異性Treg，而且消耗數量難以控制，過多可能誘發(fā)嚴重的自身免疫性疾病，過少起不到有效抗腫瘤作用。開發(fā)消耗特異性Treg 的方法和穩(wěn)定持久的藥物，改變腫瘤微環(huán)境的同時盡量減少生理性Treg 消耗，是Treg 清除的研究思路之一。

4.2 抑制Treg 的成熟和功能

4.2.1 GITR 抗體GITR 是腫瘤浸潤Treg 穩(wěn)定表達的免疫檢查點，GITR 抗體處理后腫瘤浸潤Treg降低50%以上，并可降低FOXP3 表達，減少IL-10等細胞因子分泌[28]，降低免疫抑制功能，還可以將Treg 轉化為Teff。Treg 可以識別自身抗原，轉化而來的Teff 可以攻擊攜帶自身抗原的腫瘤細胞，這對于低腫瘤突變負荷（tumor mutation burden-low，TMB-Low）和低腫瘤新抗原負荷（tumor neoantigen burden-low，TNB-Low）的“冷腫瘤”意義重大[26]。多個GITR 抗體單藥以及聯合免疫檢查點抑制劑的臨床試驗已經開展。MK4166 聯合帕博利珠單抗用于治療惡性黑色素瘤，客觀有效率（objective response rate，ORR）可達62%[29]。TRX518 單藥或聯合化療、聯合免疫檢查點抑制劑治療的臨床試驗正在開展（NCT01239134、NCT02628574、NCT04021043、NCT02740270、NCT03861403、NCT02598960、NCT04225039）。除此之外，已有4種GITR/CTLA4 雙抗體獲得專利批準，在結腸癌荷瘤小鼠的模型中證實可以通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）導致腫瘤浸潤Treg 耗竭，發(fā)揮抗腫瘤活性；在多個實體腫瘤和血液腫瘤中正在開展相關的研究[30]。

4.2.2 LAG3 抗體LAG3 在Treg 上高度表達，且高表達LAG3 的Treg 有更強的分泌TGF-β、IL-10的功能，具有更強的抑制活性[31]。針對LAG3 單抗的研發(fā)已經較為成熟。RELATIVITY-047 研究表明，惡性黑色素瘤患者接受LAG3 單抗Relatilimab聯合納武利尤單抗對比單藥納武利尤單抗，中位無進展生存期（progression-free survival，PFS）顯著延長（10.1 個月和4.6 個月），總生存期（overall survival，OS）仍在隨訪中。其他的LAG3 單抗（如Fianlimab、TSR-033、RO-7247669、SHR-1802、MGD-013 等）的臨床研究也在進行中，該靶點已成為繼程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）/PD-L1、CTLA4 之后最有潛力的免疫治療靶點之一。

4.2.3 具有Ig 和ITIM 結構域的T 細胞免疫受體（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain，TIGIT）抗體TIGIT是FOXP3 的直接靶基因，促進原始T 細胞向Treg 轉化，增強Treg 特定區(qū)域的脫甲基作用，促進Treg 分泌抑制性細胞因子IL-10 和纖維蛋白原樣蛋白2（fibrinogen like 2，FGL2）[32]。TIGIT 陽性的Treg 具有更強的免疫抑制活性。至少10 余種TIGIT 單抗已被研發(fā)，美國食品藥品管理局已批準Tiragolumab 聯合阿替利珠單抗用于驅動基因陰性PD-L1 高表達的非小細胞肺癌的治療；該藥物用于小細胞肺癌、食管癌、宮頸癌等腫瘤的臨床試驗也在進行中。其他的TIGIT 單抗（如Vibostolimab、BMS-986207、BGB-A1217、EOS-448、HB0030 等）以及PD-1/TIGIT 雙抗體（IBI321）的臨床研究也在進行中。

4.2.4 TIM3 抗體TIM3 在超過50%的腫瘤浸潤Treg 上表達，TIM3 陽性的Treg 表達更高的FOXP3，分泌更多的穿孔素、顆粒酶、IL-10 等效應分子，具有更強的抑制功能，也與更早的淋巴結轉移和更差的預后相關[33-34]。阻斷TIM3通路在多個腫瘤模型中已經取得初步療效，和PD-1 單抗、CTLA4 單抗等聯合應用也取得了協(xié)同作用。免疫檢查點抑制劑耐藥的機制之一是腫瘤微環(huán)境高表達TIM3[35]，因此阻斷該通路可以逆轉免疫檢查點抑制劑耐藥[36]。TIM3 是免疫治療的靶點之一，已開發(fā)出多個針對TIM3 的單抗（如MBG453、TSR-022、BMS-986258、SHR-1702、KL-A292、BGB-A425 等）以及TIM3/PD-1 雙抗、TIM3/PD-L1 小分子雙靶點抑制劑，其單藥以及和免疫檢查點抑制劑聯合用藥的研究正在開展。

4.2.5 抗神經氈蛋白1（neuropilin 1，NRP1）治療NRP1 在腫瘤浸潤Treg 上特異性表達，是血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和腦信號蛋白（Sema）叢狀蛋白的共同受體，對維持Treg 激活和功能有重要意義。急性白血病患者外周血Treg 上NRP1 表達升高，應用Sema3A 拮抗后NRP1 表達降低，Treg 數量減少，白血病細胞凋亡增加[37]。Fc（AAG）-TPP11 是NRP1特異性拮抗劑，可以使NRP1 內化，降低FOXP3 表達，影響Treg 的功能和穩(wěn)定性。在小鼠模型中驗證其抗腫瘤效應與CTLA4 單抗相當[38]。

4.3 通過調控腫瘤微環(huán)境抑制Treg 功能

4.3.1 干擾IL-33 和γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）IL-33/腫瘤發(fā)生抑制因子2（suppression of tumorigenicity 2，ST2）可以通過誘導IL-10 和TGF-β招募Treg 并提高Treg 活性。通過對食管鱗狀細胞癌和喉癌標本的免疫組化分析發(fā)現，腫瘤組織和腫瘤間質中IL-33 表達顯著增高，增高程度與Treg 浸潤平行，與不良預后有關[39-40]。Hatzioannou 等[41]發(fā)現小鼠體內IL-33 缺陷Treg 對腫瘤免疫的抑制作用減弱，敲除IFN-γ可以恢復抑制作用。利用表達IL-33 的病毒樣顆粒主動免疫乳腺癌小鼠可以抑制腫瘤，其機制之一為Treg 減少和IFN-γ表達增高[42]。所以IL-33 和IFN-γ是值得探索的增強腫瘤免疫的治療方法。

4.3.2 抑制TGF-βTGF-β對Treg 的分化成熟和功能維持至關重要。TGF-β受體絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑加洛替尼（Galunisertib）可以下調SMAD家族成員2（SMAD family member 2，SMAD2）磷酸化，阻止經典通路激活，逆轉Treg 對T 細胞的抑制作用，使共培養(yǎng)細胞中CD8+T 細胞和自然殺傷（natural killer，NK）細胞的數量增加[43-44]。在三陰性乳腺癌小鼠模型中應用加洛替尼可以使腫瘤消退，還可以重建免疫記憶功能，增加抗原的傳播[45]。在胰腺癌[46]、膠質瘤[47]、肝癌[48]等腫瘤的臨床研究中證實了加洛替尼的療效。TGF-β受體拮抗劑與免疫檢查點抑制劑具有協(xié)同作用。加洛替尼聯合德瓦魯單抗（NCT2734160）用于治療復發(fā)難治的胰腺癌，疾病控制率（disease control rate，DCR）為25%，中位PFS 為5.72 個月[49]。加洛替尼聯合納武利尤單抗用于治療復發(fā)難治的非小細胞肺癌、肝細胞肝癌的臨床試驗（NCT02423343）正在開展。M7824（MSB0011359C，Bintrafusp-α）是PD-L1 單抗和TGF-β單抗的雙功能融合蛋白，在亞洲人群膽管細胞癌Ⅰ期臨床試驗中，ORR 為20%，中位PFS 和OS分別為2.5個月和12.7個月[50]；M7824用于放療和替莫唑胺治療失敗的膠質母細胞瘤，DCR為22.9%，中位PFS 和OS 分別為1.4 個月和5.3 個月[51]。針對TGF-β的腫瘤疫苗、反義寡核苷酸分子等也在非小細胞肺癌、腎癌、惡性黑色素瘤等研究中取得一定的效果[52]。

4.3.3 抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol3-hydroxy kinase，PI3K）PI3K 抑制劑在惡性黑色素瘤、Lewis 肺癌、胸腺腫瘤等小鼠模型中體現出對Treg 的抑制性[53]。動物實驗發(fā)現，腫瘤疫苗聯合PI3K 抑制劑顯著減少腫瘤微環(huán)境中Treg 的數量，增加疫苗誘導的CD8+T 細胞；PI3K 抑制劑聯合PD-1 單抗可以使PI3K-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）-雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）通路激活的患者獲得較好的治療反應[54]。通過進一步分子分型發(fā)現，針對PI3K 不同亞型（PI3Kα和PI3Kβ）的抑制劑對Treg 和Tconv 的作用不同[55]，研發(fā)特異性針對Treg 的PI3K 抑制劑而不影響Tconv功能，是精準免疫調節(jié)治療的前景之一。

4.3.4 改變微環(huán)境代謝腫瘤缺氧環(huán)境可以誘導細胞外腺苷產生，導致Treg 聚集。應用聚乙二醇化腺苷脫氨酶（polyethylene glycol adenosine deaminase，PEG-ADA）治療后外周血中腺苷水平下降，Treg 活性也下降[56]。Treg 可以自發(fā)產生細胞外腺苷，通過降低細胞外腺苷水平，抑制A2A/A2B 腺苷受體（如咖啡因等）或抑制CD73 等協(xié)同信號轉導分子[57]，可以打破Treg 的正反饋機制，抑制腫瘤生長[58]。攜帶ras 同源家族成員A（ras homolog family member A，RHOA）Y42 基因突變的胃癌能夠激活PI3K/AKT/MTOR 通路，使微環(huán)境中脂肪酸累積，Treg 聚集增加。應用PI3K、MTOR 抑制劑可以阻斷代謝異常，減少Treg 聚集，和PD-1 單抗聯合應用有逆轉耐藥的理論基礎，期待在更多的臨床研究中證實。

4.3.5 TCRTCR 是Treg 的關鍵信號通路，對Treg的分化成熟、抑制性蛋白表達有重要作用。應用他莫昔芬可使小鼠模型Treg 的TCR 消退50%～70%，TCR 缺陷的Treg 喪失增殖成熟能力，動物模型中炎癥性疾病和自身免疫性疾病增加[59]。該思路可以在腫瘤免疫治療中借鑒。

4.4 抗血管治療影響Treg

VEGFA 可以通過不成熟DC 誘導Treg 生長，提示VEGFA/血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）通路在免疫調節(jié)中有重要意義。轉移性腎癌患者經舒尼替尼治療可以降低Treg 數量，下降幅度與生存呈正相關[60]。在結直腸癌小鼠模型中應用舒尼替尼和VEGFA 抗體治療能使Treg 數量和比例下降至正常水平，但不影響其他淋巴細胞亞群。結直腸癌患者應用貝伐珠單抗聯合化療對比單純化療，Treg 數量和比例也有顯著下降[61]?？寡苤委熤幸矔騎reg 導致耐藥。通過對VEGF 和VEGFR2 抑制劑耐藥的膠質瘤模型研究發(fā)現，抗血管治療可以通過調節(jié)谷氨酸/胱氨酸逆向轉運體，增強Treg 功能，起到免疫抑制的作用，導致治療失敗[62]。因此抗血管治療聯合Treg抑制治療是避免耐藥的途徑之一。

4.5 免疫檢查點抑制劑對Treg 的影響

前文中已敘述多項關于免疫檢查點抑制劑聯合Treg 調節(jié)治療的策略，是有潛力的免疫治療聯合方案。免疫檢查點抑制劑治療本身也會對Treg產生影響，機制較為復雜。CTLA4 在Tconv 和Treg上都有表達，某些腫瘤中CTLA4 在Treg 上表達更高[63]，臨床前研究和臨床研究中發(fā)現CTLA4 單抗可以激活Teff，還可以通過ADCC 或抗體依賴細胞介導的吞噬效應（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）清除微環(huán)境中的Treg[64]，起到激活腫瘤免疫的作用。但某些試驗也有著不同的結果，Sharma 等[65]發(fā)現應用伊匹木單抗（Ipilimumab）和替西木單抗（Tremelimumab）的惡性黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌患者腫瘤中Tconv 數量增加，而Treg 數量未發(fā)生改變，提示上述兩種藥物殺傷Treg的效應有待證實。CTLA4 單抗耐藥的機制之一是腫瘤微環(huán)境中CCR4 配體上調，誘導Treg 聚集，應用CCR4 抗體可以阻斷Treg 聚集，和CTLA4 單抗聯合應用是逆轉耐藥的潛在靶點之一[66]。

Tconv 和Treg 都高表達PD-1，而PD-L1 則主要在Treg 上表達，該通路調控Treg 生成、活化以及Treg 與Tconv 的結合，所以PD-1/PD-L1 單抗對Treg的調控可能較為復雜。有的試驗中觀察到PD-1 單抗可以使微環(huán)境中Treg 減少，恢復抗腫瘤免疫。但動物實驗中也觀察到PD-1 可能是Treg 抑制功能的負調節(jié)信號，PD-1/PD-L1 單抗可以降低Treg 表面PD-1 的表達，增強抑制作用[67]。薈萃分析發(fā)現，在非小細胞肺癌、胃癌、惡性黑色素瘤患者中，PD-1/PD-L1單抗增加了PD-1陽性Treg的免疫抑制功能[68]。Koh 等[69]通過檢測非小細胞肺癌患者應用PD-1單抗前后外周血中Treg數量和TGF-β，發(fā)現治療前高Treg 和TGF-β的人群治療反應率高，PFS 和OS 延長，差異均有統(tǒng)計學意義。分離對免疫治療無應答患者的Treg，體外培養(yǎng)分析發(fā)現，其表面PD-1 表達增高，并能抑制共培養(yǎng)中CD8+T 細胞的活性[70]。因此，腫瘤微環(huán)境中Treg 表面PD-1 的表達可能是潛在的免疫治療療效差的預測指標。Kamada 等[71]通過對晚期胃癌患者和小鼠模型的研究發(fā)現，高表達PD-1 的Treg 在接受PD-1 單抗后活性增加，抑制性增強，是免疫治療超進展的機制之一。因此盡早識別該部分人群，并采用有效措施去除或減少Treg 可能成為預防超進展的策略。

目前免疫檢查點抑制劑對Treg 的影響仍未完全闡明，需要在基礎研究和臨床研究中進一步分析；Treg 表面PD-1/PD-L1 的表達也是值得探索的免疫治療療效、超進展和免疫相關毒性的生物預測靶標。

5 小結與展望

機體的免疫系統(tǒng)是復雜的網絡，Treg 通過多種分子、激酶、細胞接觸等方式在抗原識別、抗原呈遞、免疫效應階段起到抑制作用，對維持免疫穩(wěn)態(tài)至關重要。在腫瘤的免疫逃逸和免疫抑制中Treg扮演著重要的角色。免疫檢查點抑制劑是近年來腫瘤領域的重大進展，在腫瘤治療中的地位日益凸顯；通過調控Treg 改善腫瘤抑制性微環(huán)境也是免疫治療的手段之一。高效、持久、特異性清除腫瘤微環(huán)境中的Treg 或下調Treg 功能，開發(fā)針對性的藥物，協(xié)同化療、放療、抗血管治療、免疫檢查點抑制劑等成熟的治療方式，能夠發(fā)揮更有效的抗腫瘤作用，也是提高療效、減少耐藥和減輕不良反應的手段之一。因不同腫瘤微環(huán)境存在差異，Treg浸潤程度、Treg 亞型、Treg 分子表型不盡相同，腫瘤浸潤Treg 和外周Treg 也存在差別。因此，精準檢測淋巴細胞亞群，合理分型，針對性施治也是未來需要探索的方向。