周漢琛，劉亞芹，王 輝，楊霽虹，徐玉婕，雷攀登

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，安徽 黃山 245000）

‘柿大茶’是我國(guó)著名的有性系茶樹品種，由其嫩梢加工的太平猴魁綠茶花香明顯，且滋味醇厚鮮爽，品質(zhì)優(yōu)異。揮發(fā)性物質(zhì)分析顯示醇類化合物在太平猴魁綠茶中的含量較高（相對(duì)含量可達(dá)到36%～62%），比如芳樟醇、芳樟醇氧化物、香葉醇及2-乙基-1-己醇等[1]。研究顯示，蘭花香的重要貢獻(xiàn)者茉莉酮酸甲酯及其異構(gòu)體在太平猴魁綠茶中含量豐富，對(duì)太平猴魁綠茶的花香貢獻(xiàn)較大[2]。新近研究顯示，‘柿大茶’品種加工的太平猴魁綠茶，與非‘柿大茶’茶樹品種加工的綠茶在香氣品質(zhì)、揮發(fā)物含量上均有較大差異[3]，即‘柿大茶’品種加工的太平猴魁綠茶的香氣品質(zhì)更優(yōu)異。此外，研究還表明不同‘柿大茶’品系加工的綠茶，在香氣品質(zhì)上也存在明顯差異[3]，推測(cè)‘柿大茶’不同品系間存在遺傳多樣性，使得次級(jí)代謝產(chǎn)物積累有差異。前期研究即表明，‘柿大茶6號(hào)’、23號(hào)綠茶香氣、滋味品質(zhì)顯著優(yōu)于‘柿大茶7號(hào)’品系綠茶[4]。不同產(chǎn)地的‘太平猴魁’綠茶在表兒茶素（epicatechin，EC）、沒(méi)食子兒茶素（gallocatechin，GC）、咖啡堿、表沒(méi)食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）含量分布上也存在差異[5]。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）分析表明，‘柿大茶’群體種中具有相對(duì)較高的遺傳多樣性[6]。

茶葉品質(zhì)與茶樹品種、栽培管理及加工工藝密切相關(guān)[7-10]。優(yōu)良茶樹品種的選育對(duì)茶葉品質(zhì)的提升至關(guān)重要。‘柿大茶’茶樹品種嫩梢持嫩性較強(qiáng)，由其加工的太平猴魁綠茶，外形蒼綠、壯實(shí)；香氣、滋味品質(zhì)俱佳（圖1）。為獲得較為優(yōu)異的‘柿大茶’品種，當(dāng)?shù)貙?duì)加工成品茶品質(zhì)較為優(yōu)異的‘柿大茶’單株進(jìn)行了扦插與培育。目前較優(yōu)異的‘柿大茶’品系有‘高家早’（gaojiazao，GJZ）、‘黃種’（huangzhong，HZ）、‘柿大茶2號(hào)’（shidacha No.2，SDC2）、‘柿大茶6號(hào)’（shidacha No.6，SDC6）、‘廣陽(yáng)早’（guangyangzao，GYZ）等（圖1）?！D早2號(hào)’（fuzao No.2，F(xiàn)Z2）為無(wú)性系茶樹品種，從祁門楊樹林群體種中選育而來(lái)；‘舒茶早’（shuchazao，SCZ）茶樹品種選育于安徽舒城群體種。目前這兩個(gè)無(wú)性系品種在黃山茶區(qū)栽種較為廣泛，在黃山市黃山區(qū)（太平猴魁綠茶主產(chǎn)區(qū)）也有一定栽種面積。已有研究表明不同‘柿大茶’品系加工綠茶存在差異，使得太平猴魁綠茶品質(zhì)不穩(wěn)定。本研究擬基于揮發(fā)性與非揮發(fā)性代謝物分析，結(jié)合RNA-seq測(cè)序分析技術(shù)，研究不同‘柿大茶’品系間、‘柿大茶’與非‘柿大茶’品種間的物質(zhì)基礎(chǔ)及遺傳背景差異，旨在為后續(xù)‘柿大茶’優(yōu)異品種選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘柿大茶’品系來(lái)源于黃山市猴坑村品種園，包含GJZ、HZ、SDC2、SDC6及GYZ；非‘柿大茶’茶樹品種FZ2和SCZ來(lái)源于安徽省農(nóng)科院茶葉研究所商山基地。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析時(shí)，采取4月份一芽二葉嫩梢并立即置于干冰中，后貯存在-80 ℃冰箱，用于后續(xù)分析。

正構(gòu)烷烴（C5～C20）美國(guó)Sigma 公司；試劑A（Buffer A-1，0.12 mol/L，pH 2.9）、試劑B（Buffer B-1，0.3 mol/L，pH 4.2）、試劑C（Buffer C-4，0.3 mol/L，pH 8.0）、試劑D（500 mmol/L NaOH，0.68 mmol/L EDTA）德國(guó)賽卡姆公司。

1.2 儀器與設(shè)備

57348-U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維頭 德國(guó)默克公司；7697A-7890A氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀、DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、液相色譜柱InfintyLab Proshell 120 SB-C18（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）美國(guó)Agilent公司；LC-2010高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本島津公司；433D氨基酸分析儀 德國(guó)賽卡姆公司。

1.3 方法

1.3.1 綠茶樣品前處理

綠茶加工中的鮮葉原料來(lái)源于黃山市黃山區(qū)（太平猴魁綠茶主產(chǎn)區(qū)）；7 個(gè)茶樹品種（品系）栽種地理位置相對(duì)一致。依據(jù)太平猴魁綠茶加工標(biāo)準(zhǔn)（DB 34/T 258—2012《太平猴魁茶工藝規(guī)程》）將7 個(gè)品種嫩梢制成綠茶樣，主要步驟如下：摘取一芽二三葉嫩梢于室內(nèi)攤放4～6 h；深鍋殺青3～4 min后手工捏尖、理?xiàng)l、壓制；毛火100 ℃、9～10 min；足火70 ℃、30 min；三烘85 ℃、20 min。綠茶樣貯藏于-20 ℃冰箱，用于后續(xù)代謝物分析。

1.3.2 感官審評(píng)

由6 位審評(píng)專家依據(jù)國(guó)家茶葉審評(píng)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》）中的綠茶審評(píng)辦法對(duì)7 個(gè)綠茶樣的香氣、滋味品質(zhì)進(jìn)行描述與評(píng)分。具體步驟如下：準(zhǔn)確稱取3.0 g茶樣，于150 mL 98 ℃水中沖泡4 min后，倒出茶湯，其中葉底用于香氣品質(zhì)審評(píng)，茶湯用于滋味審評(píng)。香氣、滋味品質(zhì)審評(píng)采用百分制：綠茶具有鮮醇、醇厚鮮爽、濃醇鮮爽等滋味品質(zhì)特征，得分范圍為90～99；尚醇厚、清爽品質(zhì)特征得分范圍為80～89；濃澀、青澀、欠醇品質(zhì)特征得分范圍為70～79。香氣評(píng)價(jià)中，具有嫩香、花香等品質(zhì)特征得分范圍為90～99；清香、尚高爽品質(zhì)特征得分范圍為80～89，而具有尚純、熟悶等香氣品質(zhì)特征的綠茶得分范圍為70～79。

1.3.3 揮發(fā)性化合物測(cè)定

采用頂空固相微萃?。╤eadspace-solid phase microextraction，HS-SPME）對(duì)7 個(gè)綠茶樣中的香氣進(jìn)行吸附[3,11]。同時(shí)為探究茶湯中花香類化合物含量差異，參照Flaig等[12]研究方法，以1∶50（茶水比）配制茶湯，冷卻至室溫后取10 mL茶湯利用50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維頭于40 ℃水浴吸附40 min。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

G C-M S 檢測(cè)條件：D B-5 M S 色譜柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度260 ℃；不分流。SPME纖維頭吸附結(jié)束后立即于進(jìn)樣口解吸附5 min，升溫程序如下：初始溫度為40 ℃并保留5 min，后以 4 ℃/min速率升到200 ℃并保留2 min，再以10 ℃/min速率升到280 ℃并保留5 min。載氣為高純氦氣（＞99.99%），載氣流速為1 mL/min。離子源溫度為為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；電子能量為70 eV；質(zhì)量掃描范圍為30～600 u。

化合物鑒定采用保留指數(shù)法，即利用正構(gòu)烷烴計(jì)算化合物保留指數(shù)，并與NIST數(shù)據(jù)庫(kù)（https://webbook.nist.gov/chemistry/）進(jìn)行比對(duì)，定性化合物。化合物定量采用樣品中化合物峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品峰面積之比計(jì)算含量（μg/kg或μg/L）。

1.3.4 兒茶素、咖啡堿含量分析

準(zhǔn)確稱取0.25 g綠茶樣，加入8 mL沸水；90 ℃水浴7 min后收集茶湯。此步驟重復(fù)提取3 次后混合茶湯提取液，并利用超純水稀釋4 倍。采用0.22 μm水系膜過(guò)濾茶湯后，用于HPLC。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

HPLC條件：InfintyLab Proshell 120 SB-C18（150 mm× 4.6 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相A為0.04%磷酸溶液；流動(dòng)相B為乙腈；流動(dòng)相C為甲醇；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；柱溫箱溫度為40 ℃。洗脫條件：0～1 min，90% A，7.5% B，2.5% C；1～23 min，85% A，11.2% B，3.8% C；23～23.1 min，15% A，85% B；23～35 min，15% A，85% B；35～50 min，90% A，7.5% B，2.5% C；50～60 min，90% A，7.5% B，2.5% C。

兒茶素類物質(zhì)和咖啡堿定性鑒定依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間；化合物定量（mg/g）依據(jù)已繪制的兒茶素物質(zhì)、咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

1.3.5 游離氨基酸含量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[4,13]方法，采用氨基酸分析儀測(cè)定茶湯樣品中游離氨基酸。樣品配制與兒茶素分析中的提取、稀釋方法一致。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。色譜柱為L(zhǎng)CA K07/Li（150 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相和衍生相流速分別為0.45 mL/min和0.25 mL/min。試劑A、試劑B、試劑C和試劑D用于流動(dòng)相分析。茚三酮緩沖液（1 L：20 g茚三酮，600 mL甲醇，400 mL鉀鈉緩沖液）。流動(dòng)相梯度：0～1 min，80% A，20% B；1～3 min，79% A，21% B；3～8 min，61% A，39% B；8～20 min，43% A，57% B；20～24 min，43% A，57% B；24～36 min，100% B；36～42 min，100% C；42～47 min，76% C，24% D；47～61 min，76% C，24% D；61～61.1 min，100% D；61.1～68 min，100% D；68～68.1 min，100% A；68.1～84 min，100% A。檢測(cè)波長(zhǎng)分別為570 nm和440 nm。

游離氨基酸定性以標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間為基準(zhǔn)；化合物定量（mg/g）以樣品中的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品峰面積之比計(jì)算含量。

1.3.6 茶樹嫩梢轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

7 個(gè)茶樹品種（品系）嫩梢（一芽二葉）的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及遺傳進(jìn)化樹分析由廣州基迪奧生物公司完成。主要步驟如下：提取茶樹嫩梢的RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于文庫(kù)構(gòu)建。測(cè)序平臺(tái)為Illumina Novaseq6000（廣州基迪奧公司）。測(cè)序完成后，通過(guò)軟件過(guò)濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)、去除接頭序列等，以獲得高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。以舒茶早基因組序列（http://tpdb.shengxin.ren/）為參考基因組，利用MUSCLE（http://www.drive5.com/muscle/）分析不同茶樹品種（品系）中基因家族進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建進(jìn)化樹；利用Stringtie重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本，并利用RSEM計(jì)算樣本中基因轉(zhuǎn)錄水平。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0軟件中的Duncan計(jì)算法分析樣品中代謝物積累的差異（P＜0.05）；利用SIMCA 14.0軟件對(duì)不同茶樹品種（品系）中的代謝物、基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官審評(píng)結(jié)果

本研究依據(jù)太平猴魁綠茶加工工藝：攤放、殺青、捏尖、壓制、干燥，將以上7 個(gè)茶樹品種（品系）嫩梢加工成綠茶。滋味審評(píng)結(jié)果顯示，‘柿大茶’品系綠茶GJZ、GYZ及非‘柿大茶’品種綠茶FZ2具有鮮醇品質(zhì)特征，滋味感官審評(píng)得分較高；HZ、SDC2、SDC6綠茶滋味鮮爽度不足，得分相對(duì)較低；SCZ綠茶滋味醇厚度、鮮爽度均不足，得分最低。香氣評(píng)審結(jié)果顯示，GJZ、HZ綠茶具有花香品質(zhì)特征，得分較高，其次為SDC2綠茶；FZ2和SCZ品種鮮葉加工的太平猴魁綠茶香氣品質(zhì)有差異，前者香氣品質(zhì)較佳（表1）。

表1 ‘柿大茶’和非‘柿大茶’茶樹品種綠茶及感官審評(píng)Table 1 Sensory evaluation results of ‘Shidacha’ and non-‘Shidacha’ green tea

2.2 代謝物分析

利用HPLC和氨基酸分析儀分析7 種綠茶茶湯中的兒茶素類、咖啡堿及游離氨基酸等主要的非揮發(fā)性組分。結(jié)果表明，酯型兒茶素表兒茶素沒(méi)食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）在‘柿大茶’品種綠茶中的含量較高；簡(jiǎn)單型兒茶素表兒茶素（epicatechin，EC）、兒茶素（catechin，C）和EGC在‘柿大茶’與非‘柿大茶’綠茶中的差異不明顯；咖啡堿含量在各綠茶中差異較大，其中在SDC2綠茶中含量最高，在GYZ綠茶中含量最低（表2）。除HZ綠茶中的兒茶素類物質(zhì)總量明顯高于其他品種綠茶外，在同一工藝下，各綠茶中兒茶素總量差異較小，比如在GJZ、SDC2、SDC6、GYZ、FZ2綠茶間均未達(dá)到顯著差異（P＞0.05）（圖2）。游離氨基酸分析顯示，游離氨基酸總量在‘柿大茶’綠茶HZ中最高，達(dá)到62.47 mg/g，其次為FZ2綠茶（59.02 mg/g）；除SCZ綠茶（29.88 mg/g）的氨基酸總量較低外，其他4 個(gè)綠茶（GJZ、SDC2、SDC6、GYZ）中的游離氨基酸總量無(wú)顯著差異，分布范圍為42.02～49.97 mg/g。茶氨酸含量在各綠茶中的差異較大，在‘柿大茶’綠茶HZ中含量最高，達(dá)到干質(zhì)量的5%（表2）。

表2 綠茶中主要滋味成分含量Table 2 Contents of major taste compounds in green tea samplesmg/g

圖2 花香類化合物在7 個(gè)綠茶茶湯中的含量Fig.2 Contents of floral aroma volatiles in seven tea infusion samples

分析7 種綠茶中的揮發(fā)性代謝物。基于前期的研究結(jié)果[3]，表明‘柿大茶’綠茶中的糖苷類化合物及與逆境脅迫相關(guān)的化合物含量較高，比如香葉醇、芳樟醇、橙花叔醇、吲哚、茉莉酮等。圖2表明，GJZ、HZ、SDC6綠茶中的揮發(fā)性物質(zhì)總量明顯高于其他品種綠茶；FZ2綠茶揮發(fā)性物質(zhì)總量與SDC6綠茶無(wú)顯著性差異；SDC2、GYZ、SCZ綠茶中的揮發(fā)性物質(zhì)總量相近，無(wú)顯著差異。利用HS-SPME-GC-MS分析綠茶茶湯中花香類的化合物，結(jié)果顯示，糖苷類化合物（芳樟醇氧化物和芳樟醇、香葉醇）在各綠茶茶湯中差異較大，以芳樟醇及其氧化物為例，除GYZ綠茶外，其在‘柿大茶’綠茶茶湯中的含量均較高。與逆境脅迫相關(guān)的花香類化合物分析顯示，吲哚、茉莉酮、橙花叔醇等在香氣得分較高的茶湯中的含量均較高。在感官審評(píng)中SDC2香氣品質(zhì)要優(yōu)于SCZ、GYZ綠茶，而3 個(gè)綠茶中的香氣物質(zhì)總量無(wú)顯著性差異?；ㄏ泐愇镔|(zhì)分析顯示，芳樟醇氧化物、芳樟醇、香葉醇、茉莉酮以及橙花叔醇等在SDC2茶湯中的含量顯著高于GYZ和SCZ。

2.3 遺傳進(jìn)化分析

為探究‘柿大茶’品系間、‘柿大茶’與非‘柿大茶’茶樹品種間在遺傳背景上的差異，以7 個(gè)茶樹品種嫩梢為研究對(duì)象，通過(guò)RNA-seq技術(shù)分析7 個(gè)茶樹品種鮮葉中的全基因組轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果顯示，以全基因組轉(zhuǎn)錄水平為變量進(jìn)行PCA，SCZ、FZ2和GYZ相距較近（以不同象限為準(zhǔn)），為第1組；SDC2和SDC6為第2組，而GJZ和HZ分別單獨(dú)一組（圖3A）?！链蟛琛废礢DC2和SDC6間的全基因組轉(zhuǎn)錄水平相似度非常高，差異表達(dá)基因較少（差異倍數(shù)大于2，假陽(yáng)性率＜0.05），這表明SDC2和SDC6品系可能來(lái)源于相同的‘柿大茶’單株。利用Diamond和OrthoMCL軟件鑒定同源基因以確定基因家族分布情況，結(jié)果顯示，‘柿大茶’茶樹品種基因家族數(shù)量高于非‘柿大茶’茶樹品種。基于篩選的單拷貝直系同源基因家族構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹（圖3B），結(jié)果顯示SDC2和SDC6在同一分枝上，這與全基因組轉(zhuǎn)錄水平分析相一致；GJZ單獨(dú)在一亞分枝上；FZ2和SCZ在同一小亞分枝上；‘柿大茶’品系GYZ和HZ與非‘柿大茶’茶樹品種FZ2和SCZ聚在一個(gè)大亞分枝上。

圖3 全基因組轉(zhuǎn)錄水平PCA（A）及遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建（B）Fig.3 PCA plot (A) and phylogenic tree (B) of seven tea varieties

2.4 萜類代謝途徑關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平差異分析

萜類物質(zhì)是茶樹中重要的一類化合物，尤其是單萜類、倍半萜類化合物，具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，對(duì)茶樹響應(yīng)逆境脅迫及成品茶風(fēng)味的形成均具有重要作用，比如芳樟醇、芳樟醇氧化物、香葉醇及橙花叔醇等[14-17]。單萜類物質(zhì)一般是通過(guò)質(zhì)體中的2-C-甲基-赤蘚糖醇-4-磷酸（methylerythritol-phosphate，MEP）途徑生成前體物質(zhì)牻牛兒基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP），后續(xù)再由萜類合成酶催化生成；倍半萜類物質(zhì)則是通過(guò)細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑生成前體物質(zhì)法尼烯焦磷酸（farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP）[18-19]。通過(guò)感官審評(píng)及代謝物分析顯示，‘柿大茶’與非‘柿大茶’茶樹品種綠茶在香氣品質(zhì)上差異明顯，且在揮發(fā)性萜類物質(zhì)積累上存在顯著差異。本研究重點(diǎn)分析了MEP和MVA途徑中的關(guān)鍵酶基因在7 個(gè)茶樹品種中的轉(zhuǎn)錄水平變化，結(jié)果顯示，在MVA途徑中（圖4），AACT基因在茶樹中存在3 個(gè)同源基因（CSS0031828.1、CSS0022458.1、CSS0000979.1），其中AACT1的轉(zhuǎn)錄水平在SCZ、FZ2中較低（FPKM值約為1），在‘柿大茶’品種中的FPKM值約為6～7；AACT3在各個(gè)茶樹品種中的表達(dá)量均較低，且在HZ、GYZ中FPKM值為0；HMGS（CSS0012119.1）、HMGR（CSS0020332.1、CSS0027456.1、CSS0044307.1、CSS0045944.1）、MVK（CSS0041428.1）、PMK（CSS0034538.1、CSS0011945.1）、PMD（CSS0049709.1）等關(guān)鍵酶基因在不同茶樹品種中的轉(zhuǎn)錄水平差異不明顯，其中MVK基因在GJZ、SDC2、SDC6、FZ2品種中的轉(zhuǎn)錄水平較高；基因IDI2（CSS0014154.1）在非‘柿大茶’品種FZ2和SCZ中的表達(dá)量（FPKM值約為23～32）顯著高于‘柿大茶’品種（FPKM值約為1～3）。

圖4 MVA和MEP途徑中關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平分析Fig.4 Transcription analysis of key enzyme genes involved in MVA and MEP pathways

在MEP 途徑中，DXS（CSS 0018056.1）、DXR（CSS0045852.1）、MCS（CSS0021900.1）基因轉(zhuǎn)錄水平在各茶樹品種中的差異不大；CMS（CSS 0021874.1）、CMK（CSS 0004136.1、CSS0031944.1）基因在SCZ、FZ2中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于‘柿大茶’品系（圖4）。

2.5 與花香類化合物生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平分析

通過(guò)MVA和MEP途徑中關(guān)鍵酶基因的分析，顯示這兩條通路上的基因轉(zhuǎn)錄水平在‘柿大茶’與非‘柿大茶’品種間的差異不明顯?！链蟛琛贩N綠茶中含有較高含量的花香類化合物，比如香葉醇、芳樟醇、芳樟醇氧化物、橙花叔醇、吲哚、苯乙醇及茉莉內(nèi)酯等。這些花香類化合物的生成與茶樹內(nèi)源次級(jí)代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因表達(dá)密切相關(guān)[20-22]。因此，本研究著重分析了香葉醇、芳樟醇、橙花叔醇、苯乙醇、吲哚及茉莉內(nèi)酯生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果顯示香葉醇合成酶基因CsGES（CsTPS10、CSS0027229.1）在‘柿大茶’品系中的轉(zhuǎn)錄水平（FPKM值約為2～3）顯著低于非‘柿大茶’茶樹品種（FPKM值約為10～11）；(R)-芳樟醇合成酶CsRLIS（MT178265）在SDC6中的轉(zhuǎn)錄水平最高，在非‘柿大茶’茶樹品種中的轉(zhuǎn)錄水平均較低，而(S)-芳樟醇合成酶CsSLIS（KF006849.1）在GYZ、FZ2品種中的轉(zhuǎn)錄水平較高，其次為HZ和SCZ。CsTSA（KX022968）和CsTSB2（KX022970）協(xié)同催化底物IGP生成吲哚[21]。轉(zhuǎn)錄水平分析顯示CsTSA在非‘柿大茶’品種中表達(dá)量更高，在‘柿大茶’品系中的表達(dá)量較為一致；CsTSB2在不同茶樹品種中的轉(zhuǎn)錄水平差異較大，在SDC2和SDC6中的轉(zhuǎn)錄水平最高（FPKM值為6），其次為HZ（FPKM值為2），而在非‘柿大茶’品種中該基因的FPKM值較低，約為0.2。CsPAR（MF977691）為苯乙醇生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，其在非‘柿大茶’茶樹品種FZ2和SCZ中的表達(dá)量較高。茉莉內(nèi)酯生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因CsLOX1（EU195885）在各茶樹品種中的表達(dá)量變化較為一致；橙花叔醇合成酶基因CsNES（KY033151）在‘柿大茶’品系中的轉(zhuǎn)錄水平（FPKM值約為18-27）顯著高于FZ2（FPKM值約為12）和SCZ（FPKM值約為8）。

圖5 與花香類化合物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因在不同茶樹 品種中的轉(zhuǎn)錄分析Fig.5 Transcription analysis of key enzyme genes involved in the biosynthesis of floral aroma volatiles

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)相同工藝將5 個(gè)‘柿大茶’品系及2 個(gè)非‘柿大茶’茶樹品種加工成綠茶，分析揮發(fā)性及非揮發(fā)性代謝物含量變化，同時(shí)基于RNA-seq技術(shù)分析7 個(gè)茶樹品種鮮葉中的全基因組轉(zhuǎn)錄水平。揮發(fā)性代謝物分析顯示，花香類化合物在‘柿大茶’品種綠茶茶湯中含量較高，比如香葉醇、芳樟醇、吲哚、茉莉酮及橙花叔醇等。香葉醇和芳樟醇是茶樹中重要的單萜類化合物，前者具有玫瑰香型，后者具有花香特征，對(duì)綠茶、紅茶的香氣品質(zhì)形成具有重要貢獻(xiàn)[8,23]。香葉醇和芳樟醇都屬于單萜類化合物，由萜類合成酶催化前體物質(zhì)GPP生成。本研究中顯示合成GPP的MEP途徑中的關(guān)鍵酶基因在‘柿大茶’和非‘柿大茶’品種中的轉(zhuǎn)錄水平均較高，且CMK、CMS兩個(gè)關(guān)鍵酶基因在FZ2和SCZ中的轉(zhuǎn)錄水平反而高于‘柿大茶’茶樹品種。后續(xù)通過(guò)分析香葉醇合成酶基因CsGES及芳樟醇合成酶基因CsRLS和CsSLS的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，顯示CsGES在非‘柿大茶’FZ2和SCZ中的轉(zhuǎn)錄水平更高，而芳樟醇合成酶CsRLS在‘柿大茶’品系中的轉(zhuǎn)錄水平普遍更高。CsRLS是負(fù)責(zé)茶樹中(R)-型芳樟醇生物合成的重要功能酶基因[24]，且(R)-型芳樟醇香氣閾值較低（約為0.8 μg/L），相比(S)-型芳樟醇（閾值約為7.4 μg/L）更易被人嗅覺(jué)感知[25-26]。因此，推測(cè)(R)-型芳樟醇可能是‘柿大茶’品系綠茶花香更顯的重要因素。吲哚、橙花叔醇均具有花香特性，是烏龍茶中重要的呈香化合物[27-28]。本研究結(jié)果顯示合成吲哚的關(guān)鍵酶基因CsTSB2在非‘柿大茶’茶樹品種的中轉(zhuǎn)錄水平極低，推測(cè)是FZ2和SCZ綠茶中吲哚含量較低的原因。

感官審評(píng)與滋味成分分析表明‘柿大茶’與非‘柿大茶’在滋味品質(zhì)上的差異不突出，比如非‘柿大茶’FZ2綠茶滋味鮮醇，審評(píng)得分顯著高于‘柿大茶’綠茶HZ、SDC2和SDC6。此外，對(duì)兒茶素合成途徑中關(guān)鍵酶基因的分析也表明（結(jié)果未列出），這些通路上的關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平在7 個(gè)茶樹品種中的差異不顯著。Xia Enhua等[29-30]研究表明，‘中國(guó)種’茶樹（Camellia sinensisvar.sinensis）在人工選育干擾下，與揮發(fā)性化合物代謝相關(guān)的基因變異較多，且存在基因復(fù)制事件。本研究中的遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，‘柿大茶’品系與非‘柿大茶’品種FZ2和SCZ遺傳背景確實(shí)存在差異。因此，推測(cè)‘柿大茶’茶樹品種在人工選育影響下，某些揮發(fā)性代謝物合成通路的進(jìn)化對(duì)其成品茶香氣品質(zhì)形成較為有利。

綜上所述，本研究著重分析了‘柿大茶’與非‘柿大茶’茶樹品種遺傳背景的差異和其加工綠茶品質(zhì)及代謝物差異，結(jié)果表明‘柿大茶’在遺傳背景上有別于非‘柿大茶’茶樹品種FZ2和SCZ?！链蟛琛贩N加工的綠茶在香氣品質(zhì)上較為優(yōu)異，與其花香類化合物代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量較高相關(guān)。本研究結(jié)果對(duì)后續(xù)選育優(yōu)異的‘柿大茶’品種有重要指導(dǎo)作用，同時(shí)對(duì)高香類茶樹品種選育提供了理論參考。