孫 靜，楊 雪，彭 旭，盧立志，曾 濤，單雨萌，周 彬，梁振華，賈 鳴，申 杰,，杜金平,

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北 武漢 430064；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021；3.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430064）

鴨蛋含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等[1-2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為鴨蛋滋陰補(bǔ)腎，能夠提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)健康。鴨蛋作為咸蛋加工原料，其新鮮、潔凈、無(wú)暗紋無(wú)破損是保障加工品質(zhì)量的重要前提。限于我國(guó)以地面平養(yǎng)、網(wǎng)養(yǎng)為主的蛋鴨養(yǎng)殖現(xiàn)狀，鴨蛋常沾有羽毛、泥糞污等，臟蛋多，這種鴨蛋潔凈程度很難滿足加工高品質(zhì)咸蛋的需求[3]。一般認(rèn)為，被污染蛋殼表層的微生物會(huì)透過(guò)蛋殼滲入蛋內(nèi)而造成鴨蛋內(nèi)容物的污染[4-5]。有研究表明，由于蛋體表面的微生物數(shù)目增加，導(dǎo)致蛋體中微生物滲入污染鴨蛋的內(nèi)容物，特別是腸桿菌科的污染。細(xì)菌進(jìn)入蛋殼，不但會(huì)導(dǎo)致蛋殼內(nèi)部的結(jié)構(gòu)形式發(fā)生變化，還會(huì)破壞蛋殼中的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致蛋殼蛋白變稀，系帶液化斷裂，蛋黃膜失去彈性斷裂；蛋清和蛋黃混合在一起會(huì)產(chǎn)生大量的硫化氫等難聞的氣味，從而導(dǎo)致蛋殼的保質(zhì)期受到影響。因此臟鴨蛋載菌，給鴨蛋加工及食品安全帶來(lái)極大隱患；同時(shí)，鴨蛋上附著的污物風(fēng)干后難以清洗，加大了生產(chǎn)難度，使產(chǎn)品質(zhì)量下降，影響成品風(fēng)味。原料鴨蛋的清潔程度即載菌量與加工效果關(guān)系密切[6]。

石一等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鮮雞蛋殼外細(xì)菌以厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）為主，葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為優(yōu)勢(shì)菌屬。盧昌麗等[8]通過(guò)對(duì)不同季節(jié)鴨蛋表面菌群多樣性分析得出，鴨蛋殼表面主要為厚壁菌門和放線菌門，其中芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸球菌屬和埃希氏菌屬-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）為優(yōu)勢(shì)菌屬。因鴨雞的生活習(xí)慣、養(yǎng)殖場(chǎng)的環(huán)境不同，2 種禽類的蛋殼受污染的菌群存在差異[9]。目前已有研究并未探明新鮮鴨蛋表面微生物種類和數(shù)量對(duì)鴨蛋后續(xù)加工中品質(zhì)產(chǎn)生異變的影響，未能闡明鴨蛋加工前進(jìn)行潔凈處理的必要性。因此，理清鴨蛋載菌情況、鴨蛋載菌對(duì)加工的影響是解決臟鴨蛋加工的理論基礎(chǔ)課題。本研究選取不同潔凈程度的鴨蛋，測(cè)定鴨蛋的菌落總數(shù)，采用16S rDNA基因檢測(cè)分析鴨蛋的載菌組成，以分析比較鴨蛋載菌的表型及功能差異，以期為鴨蛋清潔生產(chǎn)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨蛋來(lái)自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所金水家禽養(yǎng)殖基地，相同日齡農(nóng)湖2號(hào)蛋鴨，分別采集蛋殼表面無(wú)明顯臟污蛋（CE）與有明顯臟污蛋（DE）及實(shí)驗(yàn)室腌制黑黃咸蛋（BSE）各200 枚。

RNasea、1×TE Biosharp生物科技有限公司；Q5?High-Fidelity DNA Polymerase 上海金畔生物科技有限公司；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit9 上海懋康生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2720聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀 美國(guó)ABI公司；FLX800T酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；DYY-6C電泳儀 北京六一公司；BG-gdsAUTO（130）凝膠成像系統(tǒng) 北京百晶生物技術(shù)有限公司；MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina 公司；Scilogex CF1524R常溫離心機(jī) 北京奧利賽克生物科技有限公司；K1302半微量凱氏定氮儀 上海君翼儀器設(shè)備有限公司；AD200L-H均質(zhì)機(jī) 上海昂尼儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鴨蛋分組與鴨蛋殼外菌液樣品的采集

按照莊宇[10]提出的抽樣工作要點(diǎn)，隨機(jī)選取CE、DE及BSE各40 枚。各組鴨蛋整蛋用無(wú)菌生理鹽水，常溫條件下置于超聲波清洗器中清洗，收集洗蛋水混合液作為CE、DE、BSE的殼外菌液樣本；在無(wú)菌環(huán)境下剝開蛋殼，分離蛋殼與殼膜，用200 mL無(wú)菌生理鹽水浸泡殼膜并蘸取擦拭蛋殼內(nèi)表面，收集該混合液作為CE、DE、BSE的殼內(nèi)菌液樣本；無(wú)菌條件下收集蛋白和蛋黃，混合均質(zhì)得到內(nèi)容物菌液樣本。無(wú)菌條件下收集蛋白和蛋黃，混合均質(zhì)得到內(nèi)容物菌液樣本。上述殼外、殼內(nèi)、內(nèi)容物樣本均分為2 份，分別用來(lái)測(cè)定菌落總數(shù)和MiSeq高通量測(cè)序。

1.3.2 菌落總數(shù)的測(cè)定

參照GB/T 4789.19—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 蛋與蛋制品檢驗(yàn)》[11]方法測(cè)定；微生物限量標(biāo)準(zhǔn)參照GB 2749—2015《蛋與蛋制品》[12]。

1.3.3 菌落多樣性的測(cè)定分析

由MiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA（步驟參照試劑盒說(shuō)明書）。對(duì)提取好的DNA樣品進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分子大小判斷，利用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行定量。過(guò)濾總序列中不合格的DNA模板，對(duì)合格的文庫(kù)根據(jù)Illumina MiSeq測(cè)序區(qū)域（V3＋V4），采用合成帶有barcode的特異引物進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段然后用Axygen凝膠回收試劑盒回收目的片段。

根據(jù)barcode序列區(qū)分各個(gè)樣本reads，去除嵌合序列后得到有效數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。對(duì)細(xì)菌可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）在100%相似水平下進(jìn)行聚類分析，繪制稀釋曲線；通過(guò)α多樣性指數(shù)分析，即菌群豐度指數(shù)Chao和ACE、菌群多樣性指數(shù)Shannon和Simpson，評(píng)價(jià)測(cè)序深度指數(shù)覆蓋率，驗(yàn)證數(shù)據(jù)分析的合理性，對(duì)這些α多樣性指數(shù)的計(jì)算方法詳見http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.html#module-skbio.diversity.alpha。以Venn圖形式表現(xiàn)多個(gè)樣本中共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，分析門和屬水平上物種多樣性及其對(duì)應(yīng)豐度，將聚類后屬水平上的數(shù)據(jù)以熱圖形式表示，物種分塊聚集后群落組成的相似性和差異性，顏色梯度代表差異大小。

1.3.4 菌落表型功能分析

利用BugBase軟件[13]預(yù)測(cè)細(xì)菌組表型，并按革蘭氏陰陽(yáng)性、氧氣消耗、生物膜、潛在致病力等對(duì)鑒定到的微生物進(jìn)行組間差異分類。

1.3.5 菌落PICRUSt基因功能預(yù)測(cè)分析

PICRUSt是根據(jù)微生物群落的豐富度與數(shù)據(jù)庫(kù)比，在無(wú)法觀察的條件下，就可以推斷出生物群落的功能。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，賦予基因信息生物學(xué)意義。基于已測(cè)細(xì)菌的測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)樣本中微生物的基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 次重復(fù)，結(jié)果以圖表形式表示。數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.00軟件作圖，方差分析采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行Duncan多重比較分析，P＜0.05，差異顯著。相關(guān)性分析采用Pearson法。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果

如圖1所示，DE殼外菌落總數(shù)顯著高于CE，菌落總數(shù)差異顯著，殼內(nèi)菌落總數(shù)差別不大。BSE的殼內(nèi)及內(nèi)容物菌落總數(shù)大幅增加，DE和CE內(nèi)容物未檢出。可以看出，DE攜帶的細(xì)菌水平顯著高于CE，DE更容易受到細(xì)菌污染；而BSE殼內(nèi)及內(nèi)容物攜帶細(xì)菌水平較高，BSE明顯腐敗變質(zhì)，不能繼續(xù)食用。

圖1 臟污鴨蛋、干凈鴨蛋和BSE殼外、殼內(nèi)及內(nèi)容物載菌數(shù)Fig.1 Number of bacteria on eggshell surface and shell membrane and in contents of stained duck eggs,clean duck eggs and BSE duck eggs

2.2 Illumina MiSeq測(cè)序數(shù)據(jù)與質(zhì)量控制

采用合成帶有barcode的特異引物進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V3＋V4區(qū)PCR擴(kuò)增，所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Illumina MiSeq測(cè)序，CE組獲得101215 條有效序列信息，DE組獲得51044 條優(yōu)化序列信息，BSE組獲得118059 條優(yōu)化序列信息。CE和DE組序列平均長(zhǎng)度為402.86 bp和415.87 bp，CE和DE組樣品的檢出有效序列條數(shù)相差2 倍，差異顯著，說(shuō)明兩個(gè)樣品間具有顯著差異。

以CE、DE、BSE 3 組洗蛋水混合液作為樣品，提取基因組DNA，樣品濃度與純度均符合PCR擴(kuò)增的要求。稀釋曲線可以反映檢測(cè)樣品中新物種的出現(xiàn)速度，曲線上某一點(diǎn)的斜率越大，表示出現(xiàn)新物種被檢測(cè)的速率越快，斜率越小則表示新物種出現(xiàn)的速率越慢。如圖2 所示，樣品測(cè)序量低于20000時(shí)，OTU數(shù)量還有明顯增加，說(shuō)明此時(shí)樣品中還有較多物種沒(méi)有被檢測(cè)。當(dāng)測(cè)序量繼續(xù)增加時(shí)，大部分樣品的OTU雖仍有增加，但是趨勢(shì)平緩，細(xì)菌的多樣性增加已經(jīng)不明顯，則說(shuō)明測(cè)序數(shù)量充分且合理，可用于進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)。

圖2 各樣品的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of bacterial sample

2.3 鴨蛋表面菌落α多樣性分析

CE、DE、BSE殼外微生物α多樣性分析見表1。覆蓋率即各組分樣品中序列被測(cè)出的概率，均達(dá)到99%以上，因此測(cè)序深度足夠、該組數(shù)據(jù)可有效表示樣本中微生物多樣性的真實(shí)情況，測(cè)序可信度高。

表1 α多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistical analysis of α diversity indexes

Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)和Faith_pd指數(shù)均可用來(lái)評(píng)估不同潔凈程度鴨蛋的物種豐富度，Chao指數(shù)越大，表明樣本豐度指數(shù)越高，Shannon指數(shù)越大，表明樣本多樣性越高，F(xiàn)aith_pd指數(shù)差異越大，說(shuō)明細(xì)菌物種差異越顯著。從表1可以看出，DE組的Chao指數(shù)大于CE組，Shannon指數(shù)和Faith_pd指數(shù)CE組大于DE組，物種均勻度CE組大于DE組。DE組微生物豐度高于CE組，而CE組微生物多樣性更豐富、均勻度更高，兩個(gè)樣品Shannon指數(shù)相差1 倍左右，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BSE殼外微生物豐度，多樣性、均勻度均小于CE，推測(cè)咸蛋腌制時(shí)高鹽高滲的環(huán)境抑制了BSE殼表面微生物的生長(zhǎng)[14]。

2.4 鴨蛋表面菌落組分OTU Venn圖分析

按100%的相似度聚類后歸為935 個(gè)OTU，包括 18 個(gè)門，256 個(gè)屬。由圖3可看出，BSE組與正常咸蛋（NBSE）組樣品殼內(nèi)共有OTU數(shù)為152 個(gè)，占NBSE組OTU數(shù)的10.71%，占BSE組OTU數(shù)的19.26%。由此可以看出NBSE組較BSE組殼內(nèi)細(xì)菌多樣性更豐富，可能是BSE中主要優(yōu)勢(shì)菌落為某種或幾種致黑類菌落，細(xì)菌種類多樣性不如NBSE。CE、DE和BSE組樣品殼外共有OTU有19 個(gè)，共有OTU分別占CE組4.50%，DE組3.42%，BSE組9.84%，各組重疊部分較小。由此可知，在不同分類水平上，不同潔凈程度的鴨蛋及BSE細(xì)菌水平均存在數(shù)量上的差異。DE組獨(dú)有的OTU數(shù)量多于CE組，說(shuō)明DE組具有大量CE組沒(méi)有的微生物。在DE組獨(dú)有的OTU中占比最大為變形菌門（Proteobacteria）的嗜冷桿菌屬（Psychrobacter），盧昌麗等[8]不同季節(jié)鴨蛋的表面細(xì)菌多樣性分析得出，不同季節(jié)的溫度、氣候環(huán)境對(duì)鴨蛋表面菌群多樣性有很大影響。楊伊磊等[9]研究表明，除了家禽的健康狀況差，禽蛋產(chǎn)出過(guò)程會(huì)受到污染外，養(yǎng)殖場(chǎng)的土壤、墊草、飼料、空氣、糞便等的衛(wèi)生狀況都會(huì)造成蛋殼表面細(xì)菌污染，因此導(dǎo)致DE比CE攜帶的細(xì)菌種群更為復(fù)雜多樣。BSE與DE組比BSE與CE組共有的OTU數(shù)少，但BSE組與DE組共有OTU相對(duì)豐度大，BSE組與CE組共有OTU相對(duì)豐度小、絕對(duì)含量也少。

圖3 不同樣品組分共有或獨(dú)有OTU數(shù)Venn圖Fig.3 Venn diagram showing shared and unique OTUs between bacterial samples

2.5 微生物種類分布比較

在門水平上對(duì)樣品進(jìn)行注釋分析，如圖4所示，BSE組優(yōu)勢(shì)菌占比較高的為厚壁菌門、變形菌門和放線菌門，分別為72.20%、16.13%和4.30%；NBSE組優(yōu)勢(shì)菌門則只有變形菌門，占比為82.83%，厚壁菌門和放線菌門占比僅2.09%和1.75%。CE優(yōu)勢(shì)菌占比較高的為變形菌門、厚壁菌門和放線菌門，分別為34.35%、27.25%和17.28%，擬桿菌門（Bacteroidetes）占比較少為8.29%；而DE優(yōu)勢(shì)菌占比較高的是變形菌門為89.01%，厚壁菌門和放線菌門分別占6.16%和3.98%。BSE組優(yōu)勢(shì)菌占比較高的是變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和厚壁菌門，分別為76.50%、8.00%、6.76%、5.43%。結(jié)果表明，DE組和BSE組殼外變形菌門的豐度大幅增加，為核心優(yōu)勢(shì)菌門，CE組殼外變形菌門、厚壁菌門和放線菌門均為優(yōu)勢(shì)菌門，NBSE組殼內(nèi)變形菌門為核心優(yōu)勢(shì)菌門。由此可見，腌制過(guò)后NBSE和BSE殼內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌門存在顯著差異，BSE殼內(nèi)外細(xì)菌相對(duì)豐度較高的都有厚壁菌門、變形菌門和放線菌門，但各個(gè)菌門的相對(duì)豐度并不相同。研究表明，變形菌門是胃腸道中一類適應(yīng)性強(qiáng)、具有潛在致病性的常見菌，包括大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺旋桿菌等病原菌，其豐度變化可直接對(duì)宿主健康產(chǎn)生影響[15]。大部分變形菌門的細(xì)菌都會(huì)導(dǎo)致肺炎、泌尿道等多種傳染病的癥狀[16-17]。劉肖利等[18]的研究表明，變形菌門為牛乳房炎的優(yōu)勢(shì)菌門。變形菌屬會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、卵磷脂分解，產(chǎn)H2S，蛋白呈暗褐色、蛋黃呈褐色或黑色[19]。由此可見：DE及BSE攜帶致病菌及導(dǎo)致鴨蛋變質(zhì)的腐敗菌的豐度高于CE，DE和BSE受污染程度大大增加。根據(jù)謝雨衡[20]的研究可知，變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門微生物能夠促進(jìn)致黑臭物質(zhì)H2S的產(chǎn)生，張伯涵[21]研究也證明了以上種類微生物對(duì)水體的致黑致臭有巨大作用，根據(jù)BSE和NBSE內(nèi)部?jī)?yōu)勢(shì)菌門差異推測(cè)，咸蛋黑黃形成原因與內(nèi)部厚壁菌門和變形菌門豐度差異存在一定關(guān)系，當(dāng)厚壁菌門相對(duì)豐度過(guò)高時(shí)會(huì)產(chǎn)生致黑致臭物質(zhì)。

圖4 殼內(nèi)外微生物門水平相對(duì)豐度比較Fig.4 Comparison of relative abundance of bacteria at the phylum between the inside and the outside of duck eggshells

在屬水平上，圖5顯示相對(duì)豐度前10的菌屬，其他菌屬歸類為others。BSE殼內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）占46.04%，蒂西耶氏菌屬（Tissierella）占22.60%，羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）占4.50%，假單胞菌屬（Pseudomonas）占3.43%；NBSE殼內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬占50.80%，羅爾斯通氏菌屬占20.27%，貪銅菌屬（Cupriavidus）占2.45%。可以看出，與NBSE組相比，BSE假單胞菌屬和羅爾斯通氏菌屬相對(duì)豐度驟減，而芽孢桿菌屬、蒂西耶氏菌屬等菌屬相對(duì)豐度則有不同程度的上升。CE殼外優(yōu)勢(shì)菌屬為涅斯特捷科氏菌屬（Nesterenkonia）占9.08%、彎曲桿菌屬（Campylobacter）占7.91%、鏈球菌屬（Streptococcus）占3.41%、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）占2.92%、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）占2.65%和乳桿菌屬（Lactobacillus）占2.27%；DE殼外優(yōu)勢(shì)菌屬為嗜冷桿菌（Psychrobacter）占86.01%、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）占2.20%；BSE組殼優(yōu)勢(shì)菌屬為羅爾斯通氏菌屬占22.91%，沙雷氏菌屬（Serratia）占5.05%，放線菌屬（Actinomyces）占3.32%。在DE組中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的嗜冷桿菌屬豐度占比高達(dá)85.99%，而CE組（籠養(yǎng)蛋）蛋殼表面嗜冷桿菌屬豐度占比小于1%。DE組中占2.20%的不動(dòng)桿菌屬也是一種常見腐敗菌。研究表明，嗜冷桿菌屬Psychrobactersp.ZY214菌具有產(chǎn)脂肪酶的功能[22]，嗜冷桿菌屬是引起冷鮮雞冷藏保存過(guò)程中腐敗變質(zhì)的主要菌屬之一[23]，低溫冷藏鯧魚腐敗過(guò)程中，嗜冷桿菌屬與不動(dòng)桿菌屬起到重要作用[24]。寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonassp.sp3菌在25 ℃、微堿性條件下可以起到氧化水中S2-的功能，從而達(dá)到抑制水體黑臭的作用[25]。CE組中優(yōu)勢(shì)菌屬?gòu)澢鷹U菌屬（豐度占比為7.94%）和涅斯特連科氏菌屬（豐度占比為8.87%）在DE組中豐度占比均小于1%。CE組中相對(duì)豐度為2.92%的寡養(yǎng)單胞菌屬，在DE中未檢出。BSE組中的第1優(yōu)勢(shì)菌屬是導(dǎo)致菌血癥感染的條件致病菌，還會(huì)對(duì)蛋清凝膠性、疏水性、色度改變等劣變品質(zhì)有較大影響[26]；第2優(yōu)勢(shì)菌屬沙雷氏菌屬屬于兼性厭氧菌，有研究指出該菌是腐敗變質(zhì)冰鮮鴨的第2優(yōu)勢(shì)菌種[27]。干凈鴨蛋菌群多種多樣，并且只有一小部分是致病菌，臟污鴨蛋的腐敗菌占很大優(yōu)勢(shì)，而能抑制鴨蛋腐敗變質(zhì)的菌群豐度很小，且未檢出。由此推測(cè)，DE比DE更容易腐敗變質(zhì)。因此鴨蛋產(chǎn)出后經(jīng)過(guò)清洗、消毒對(duì)減少腐敗菌、致病菌很有必要。

圖5 殼內(nèi)外微生物屬水平相對(duì)豐度比較Fig.5 Comparison of relative abundance of bacteria at the genus level between the inside and the outside of duck eggshells

為進(jìn)一步探究咸蛋異變的原因，對(duì)NBSE和BSE樣品的微生物進(jìn)行種水平的檢測(cè)，2 組樣品在種水平上豐度前10的微生物如圖6所示，其他菌種微生物被歸類為others。BSE組的優(yōu)勢(shì)菌種為皮氏羅爾斯通氏菌（Ralstonia pickettii）占4.50%，產(chǎn)氮假單胞菌（Pseudomonas azotoformans）占2.27%，偶發(fā)貪銅菌（Cupriavidus pauculus）占1.78%，清酒廣布乳桿菌（Lactobacillus sakei）占1.57%；NBSE組的優(yōu)勢(shì)菌種為產(chǎn)氮假單胞菌占50.46%，皮氏羅爾斯通氏菌（Ralstonia pickettii）占20.27%，偶發(fā)貪銅菌（Cupriavidus pauculus）占2.45%。吳彩葉等[28]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氮假單胞菌具有較強(qiáng)的組胺降解能力，能夠有效抑制組胺的生成并減少食品中原有的組胺含量，并且不會(huì)產(chǎn)生組胺，該菌具有一定程度的耐鹽性，但鹽濃度過(guò)高時(shí)會(huì)抑制其生長(zhǎng)和酶活性。皮氏羅爾斯通氏菌則具有良好的苯酚降解能力，同時(shí)還具有一定的重金屬耐受能力[29]。這兩種菌在NBSE組中都有很高的豐度占比，但在BSE中相對(duì)豐度明顯減少，符合與前面屬水平相對(duì)豐度的檢測(cè)結(jié)果中NBSE組假單胞菌屬和羅爾斯通氏菌屬相對(duì)豐度驟減的現(xiàn)象。值得注意的是，在BSE組屬水平上占有優(yōu)勢(shì)地位的芽孢桿菌屬在種水平上并未有豐度前10的菌種存在，僅有清酒廣布乳桿菌與其同屬芽孢桿菌綱（Bacilli），因此可以推測(cè)，BSE存在許多歸屬于芽孢桿菌屬的不同微生物種類，朱天傲[30]在研究中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和淀粉液化芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）為醬制品中主要的潛在產(chǎn)生物胺菌，其分離菌株中大部分含鳥氨酸脫羧酶和精氨酸脫羧酶基因，這兩種酶都參與腐胺的生成；通過(guò)對(duì)豆瓣醬發(fā)酵環(huán)境的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)鹽含量為5%或pH 5時(shí)，發(fā)酵液中生物胺含量會(huì)達(dá)到最高值；淀粉液化芽孢桿菌是一種兼性厭氧菌，當(dāng)氧含量不足時(shí)會(huì)通過(guò)產(chǎn)胺進(jìn)行質(zhì)子跨膜運(yùn)輸獲得能量。結(jié)合咸蛋腌制環(huán)境看，咸蛋腌制時(shí)腌制液鹽含量在5%左右，且咸蛋腌制時(shí)鴨蛋處于與空氣隔絕的狀態(tài)下，這種環(huán)境可能會(huì)對(duì)鴨蛋中生物胺的產(chǎn)生起到促進(jìn)作用。

圖6 BSE和NBSE殼內(nèi)微生物種水平比較Fig.6 Comparison of relative abundance of bacteria at the species level between the inside of BSE and that of NBSE

2.6 鴨蛋殼外微生物表型分析

通過(guò)BugBase預(yù)測(cè)得到細(xì)菌群落表型分析示例[31]，圖7展示了樣本細(xì)菌群落在需氧性、革蘭氏染色陰陽(yáng)性、氧化脅迫耐受性和致病性等表型上的相對(duì)豐度差異。

圖7 CE、DE和BSE組微生物表型預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of microbial phenotypes in CE,DE and BSE

綜合比較圖7A、B，CE微生物以厭氧為主，厭氧菌（主要為厚壁菌門）略多于需氧菌（為變形桿菌門、放線菌門），BSE微生物以需氧為主，厭氧的厚壁菌門在BSE樣品中豐度大幅降低、而需氧的變形桿菌門豐度大幅升高，推測(cè)鮮鴨蛋中厚壁菌門有一定的氧化脅迫耐受力，可在鹽漬時(shí)缺氧環(huán)境下發(fā)揮作用，當(dāng)“黑黃”產(chǎn)生時(shí)變形桿菌門又可大量增殖使蛋黃“黑化”程度加劇。這一現(xiàn)象與南寧市黑臭水體中變形桿菌門、厚壁菌門在黑臭生成階段與黑臭生成后的變化規(guī)律一致[21]。

綜合比較圖7C、D，NBSE微生物以革蘭氏陽(yáng)性菌為主。圖7F表明新鮮鴨蛋具致病性的微生物主要為變形桿菌門，且相對(duì)豐度較低，而BSE致病性微生物變形菌門的豐度大幅增加，變形桿菌是廣泛分布于自然界及人和動(dòng)物腸道中的致病菌[32]，由變形桿菌引起的食物中毒事件屢有報(bào)道[33-34]。由圖7E可知，CE的變形桿菌氧化脅迫耐受力較低，且相對(duì)豐度顯著低于BSE，說(shuō)明鮮鴨蛋上承載的變形桿菌門可采用具有一定氧化性的清洗劑去除。

2.7 功能預(yù)測(cè)

圖8～10分別展示了BSE、CE、DE微生物涉及的功能通路，主要包括細(xì)胞過(guò)程和信號(hào)傳導(dǎo)、信息儲(chǔ)存和處理和新陳代謝，包含25 個(gè)代謝通路。從圖9、10可以看出，DE組在碳水化合物運(yùn)輸和代謝通路上的豐度遠(yuǎn)大于CE組，由此可看出，DE碳水化合物分解能力強(qiáng)于CE，發(fā)現(xiàn)微生物在脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝以及次級(jí)代謝物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝通路上的微生物豐度DE＞CE。對(duì)比發(fā)現(xiàn)DE微生物致脂質(zhì)氧化分解成次級(jí)代謝物的能力強(qiáng)，推測(cè)DE微生物在脂質(zhì)代謝通路的活躍度明顯高于CE，脂質(zhì)氧化形成次級(jí)代謝物的能力也強(qiáng)于CE，而臟污鴨蛋在經(jīng)歷氧化劣變等一系列物化反應(yīng)后其脂質(zhì)氧化趨于平緩。在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝及無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝通路上微生物豐度CE＞DE，CE微生物在氨基酸及無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)代謝通路上均活躍，推測(cè)微生物對(duì)CE氨基酸與無(wú)機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝影響較大。輔酶運(yùn)輸和代謝通路上微生物豐度也呈現(xiàn)DE＞CE的規(guī)律，也說(shuō)明DE中輔酶參與的生化反應(yīng)更為活躍。BSE微生物在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝通路上相對(duì)豐度最高，說(shuō)明BSE微生物氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝最為活躍；BSE在次級(jí)代謝物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝通路上微生物豐度高于CE和DE，推測(cè)微生物對(duì)BSE脂質(zhì)氧化分解成次級(jí)代謝物的影響較大。雖然不同潔凈程度鴨蛋樣本預(yù)測(cè)的主要功能基因類別基本無(wú)差異，但豐度具有差異。DE碳水化合物以及脂質(zhì)代謝通路豐度高于CE，而CE氨基酸與無(wú)機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝通路表現(xiàn)出較高的豐度。碳水化合物是微生物生長(zhǎng)繁殖的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這與DE微生物豐度高于CE的結(jié)果相符。由此推測(cè)，不同潔凈程度的鴨蛋殼外細(xì)菌發(fā)揮各自的功能基因影響鴨蛋殼外微生物合成代謝途徑，從而形成了DE容易腐敗變質(zhì)的現(xiàn)象。

圖8 BSE微生物代謝通路情況Fig.8 Microbial metabolic pathways in BSE

圖9 CE微生物代謝通路Fig.9 Microbial metabolic pathways in CE

圖10 DE微生物代謝通路統(tǒng)計(jì)Fig.10 Statistical analysis of microbial metabolic pathways in DE

圖11反映了各組代謝通路物種組成情況，DE組主要微生物為嗜冷菌屬、不動(dòng)桿菌屬等，CE組主要微生物為賴氨酸芽孢桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、鏈球菌屬、未分類的慢生根瘤菌屬（unclassified_Rhizobiaceae）等，BSE組主要微生物為羅爾斯通菌屬、未分類的慢生根瘤菌屬、大豆根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、污泥單胞菌屬（Pelomonas）等。

圖11 各組代謝通路物種組成情況Fig.11 Species composition of metabolic pathways

DE組中嗜冷菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而CE組中嗜冷菌屬的相對(duì)豐度很低，由此推測(cè)，DE和CE在基因功能上的差異主要是由嗜冷菌屬引起。嗜冷桿菌是一種革蘭氏陰性菌，嗜冷，感染人較為少見。人來(lái)源的嗜冷桿菌主要為肺炎嗜冷桿菌和糞嗜冷桿菌[35]，吳國(guó)杰[36]研究表明，嗜冷桿菌產(chǎn)的酯酶Est10具有很強(qiáng)的耐鹽性，酯酶Est12對(duì)一些有機(jī)溶劑和去污劑也具有較好的活性和穩(wěn)定性。李建洲等[37]發(fā)現(xiàn)生鮮乳在低溫貯藏時(shí)會(huì)受嗜冷菌污染導(dǎo)致其大量繁殖并產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶。可見，DE中嗜冷桿菌屬豐度較高，極難清洗去除，且在高濃度鹽水或鹽泥鹽漬加工咸蛋，其所屬酯酶Est10依然有致劣能力。徐瑤瑤等[25]研究發(fā)現(xiàn)寡養(yǎng)單胞菌屬具有抑制水體黑臭的作用，CE導(dǎo)致腐敗變質(zhì)的嗜冷菌屬和不動(dòng)桿菌屬豐度很低，而寡養(yǎng)單胞菌屬的豐度高，這也是潔凈程度高鴨蛋不易形成黑黃的原因。

3 結(jié)論

測(cè)定CE、DE和BSE表面微生物總量、種類和豐度的差異，預(yù)測(cè)它們表面微生物的功能，并對(duì)比NBSE和BSE之間蛋內(nèi)微生物的差異，得出DE表面微生物總量顯著高于CE，且DE與CE表面不同優(yōu)勢(shì)菌屬的不同功能使DE腌制后理論上品質(zhì)變差的概率更高，細(xì)菌豐度分布、表型分析和功能預(yù)測(cè)也表明DE與BSE更為接近，對(duì)BSE和NBSE殼內(nèi)檢測(cè)也篩選出在鴨蛋腌制中影響品質(zhì)的微生物。本實(shí)驗(yàn)從微生物方面研究不同表面潔凈程度的鴨蛋，以不同微生物所產(chǎn)生的不同效果為依據(jù)，明確了DE在后續(xù)咸蛋加工中品質(zhì)下降出現(xiàn)黑黃的概率顯著高于CE，為鴨蛋清潔生產(chǎn)的必要性提供了理論依據(jù)。