熊茂蘭 , 蔚思言 , 羅軍濤 , 韓兵社 , 張俊芳 *
1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)師范中心,上海 201306;
2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院,上海 201306
甘油三酯是機(jī)體內(nèi)儲(chǔ)存能量的主要形式之一,對(duì)維持正常的生命活動(dòng)起著重要作用[1]。哺乳動(dòng)物的甘油三酯主要在肝臟中合成并儲(chǔ)存在脂肪組織中,而魚類的甘油三酯主要在肝臟中合成與儲(chǔ)存[2-3],其肝細(xì)胞同時(shí)具有合成和分泌甘油三酯的能力。甘油三酯的合成主要包括活化和酯化2 個(gè)過(guò)程,該過(guò)程始于甘油-3-磷酸的?;磻?yīng)生成溶血磷脂酸(lysophosphatidic acids,LPA),這是一個(gè)由甘油-3-磷酸?;D(zhuǎn)移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT1)催化的限速步驟[4]。甘油三酯水解為脂肪酸和甘油需要3個(gè)連續(xù)的步驟,至少涉及3 種不同的酶:脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)、激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglyceride lipase,HSL)與單?;视椭久福╩onoglyceride lipase,MGL)。在脂肪組織中,ATGL 和HSL 在甘油三酯的水解過(guò)程中起主要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期大量喂養(yǎng)高脂飼料會(huì)導(dǎo)致魚體內(nèi)甘油三酯含量增加,造成脂質(zhì)代謝紊亂。魚類脂代謝紊亂不僅會(huì)影響魚肉的口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[6],還會(huì)引起魚類肝臟發(fā)生病變,如脂肪肝?。?],對(duì)魚類的健康和養(yǎng)殖業(yè)的市場(chǎng)價(jià)值產(chǎn)生了較大的負(fù)面影響[8]。
越來(lái)越多的研究證明,表觀遺傳修飾對(duì)脂代謝起著重要的調(diào)控作用[9]。組蛋白去乙?;?1(histone deacetylase 11,HDAC11)是一種鋅離子依賴性去乙?;福?0]。HDAC11 除了在免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及癌癥中起作用外[11],還在哺乳動(dòng)物中參與了新陳代謝和肥胖的調(diào)節(jié)過(guò)程[9]。研究發(fā)現(xiàn),小鼠中敲除hdac11不僅能降低肝臟甘油三酯的含量,影響肝臟脂肪變性,還能刺激棕色脂肪的形成,誘導(dǎo)白色脂肪發(fā)生褐變,增強(qiáng)機(jī)體的產(chǎn)熱能力[12-13]。值得注意的是,斑馬魚是變溫動(dòng)物,不存在棕色脂肪[14],其代謝調(diào)節(jié)與哺乳動(dòng)物有一定差異,hdac11在魚類中是否發(fā)揮相同的作用有待進(jìn)一步研究。
本研究利用CRISPR/Cas9 構(gòu)建了缺失5 bp 的斑馬魚hdac11-/-突變體,并檢測(cè)了野生型與hdac11突變體在正常和高脂飲食條件下的體重、體長(zhǎng)、甘油三酯的含量及其相關(guān)基因的表達(dá)量,以期為探討hdac11在魚類脂代謝中的調(diào)控作用提供參考。
1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其飼養(yǎng) 野生型AB 品系斑馬魚和hdac11突變體斑馬魚,在溫度為28.0±0.5 ℃,pH 6.8~7.8的斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中(Aquaneering公司)養(yǎng)殖,每日光照14 h,黑暗10 h。斑馬魚胚胎由一雌一雄自然交配產(chǎn)卵獲得,收集的斑馬魚受精卵于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.1.2主要試劑及儀器 2×TaqMaster Mix(Vazyme,P111-01),Cas9 蛋白GenCrispr NLS-Cas9-NLS Nuclease (Z03389-100,金斯瑞公司),MAXIscript?T7 Transcription Kit 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(AM1314,Invitrogen 公司),ClarityTMWestern ECL Substrate 顯影液(#1705060,Bio-Rad 公司),Immun-Blot?PVDF Membrane for Protein Blotting(#1620177,Bio-Rad公司),HDAC11 抗體(orb578601,Biorbty 公司),甘油三酯檢測(cè)試劑盒(A110-1-1,南京建成公司),油紅O粉末(O0625,Sigma公司),蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(E607318,上海生工公司),4%多聚甲醛(E672002,上海生工公司),Trizol 試劑(#15596026,Ambion 公司),TransScript?Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(AU341,北京全式金公司),PerfectStart?Green qPCR SuperMix(AQ601,北京全式金公司)。
主要儀器:凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad 公司),超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像儀(Amersham Imager 680 RGB),熒光定量PCR 儀器(LightCycler?480Ⅱ),尼康體視顯微鏡(SMZ1500)。
1.2.1敲除靶點(diǎn)及檢測(cè)引物設(shè)計(jì) 在Ensembl 網(wǎng)站(https://asia.ensembl.org/index.htmL)上獲取斑馬魚hdac11基因序列,并在http://crispor.tefor.net/網(wǎng)站搜索Cas9 靶點(diǎn),選擇靶點(diǎn)時(shí)評(píng)估其效率、脫靶和特異性,最終確定最優(yōu)靶點(diǎn)位于第4 外顯子上,靶點(diǎn)序列為:5′-GGCTCGGGAAGCCAGCGAGG-3′。通過(guò)NCBI 網(wǎng)站設(shè)計(jì)檢測(cè)靶點(diǎn)引物(hdac11-F 和hdac11-R),Blast 檢測(cè)引物特異性。本實(shí)驗(yàn)所用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
1.2.2體外轉(zhuǎn)錄gRNA 及純化 gRNA 體外轉(zhuǎn)錄模板的上游引物前端含有T7 啟動(dòng)子,其序列為:5′-TAATACGACTCACTATAGGCTCGGGAAGCCAG CGAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′,gRNA 體外轉(zhuǎn)錄模板的下游引物序列為:5′-AAAAGCACC GACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGAC TAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAA AC-3′。gRNA 模板PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共34 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min;12 ℃保存。純化后的體外轉(zhuǎn)錄模板按照體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(MAXIscript?T7 Transcription Kit)步驟進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄gRNA,并用LiCl沉淀法純化gRNA。
1.2.3顯微注射 按照Cas9蛋白濃度800 ng·μL-1,gRNA 濃度100 ng·μL-1混合后,注射至斑馬魚受精卵中。將未注射的同一批受精卵作為對(duì)照組,在對(duì)照組和注射組中隨機(jī)挑選10 枚受精后48 h(4 hour post fertilization)胚胎,用堿裂解法提取基因組DNA。用2×TaqMaster Mix 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共34 個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸5 min;12 ℃保存。最后將PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。
1.2.4hdac11純合突變體篩選 F0代性成熟斑馬魚與WT 斑馬魚雜交,獲得F1代雜合子斑馬魚。用堿裂解法提取F1代斑馬魚尾部基因組DNA,用PCR 擴(kuò)增目的序列,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),再將PCR 產(chǎn)物純化后進(jìn)行TA 克隆,TA 單克隆測(cè)序確定突變類型。將性成熟的F1代雌雄斑馬魚進(jìn)行自交產(chǎn)生F2代,F(xiàn)2代剪尾鑒定即可篩出hdac11-/-斑馬魚。
1.2.5Western blot檢測(cè)HDAC11蛋白的表達(dá) 取1 月齡的WT 和hdac11-/-斑馬魚全魚檢測(cè)HDAC11蛋白的表達(dá),具體實(shí)驗(yàn)步驟為:在各樣品中加入RIPA 細(xì)胞裂解液,超聲破碎組織提取總蛋白,隨后進(jìn)行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳,利用PVDF 膜進(jìn)行Western blot。5%脫脂牛奶稀釋抗體,Biorbty公司(orb578601)HDAC11抗體(1∶2 000)4 ℃孵育過(guò)夜;山羊抗兔二抗(1∶2 000)37 ℃孵育2 h。TBST 清洗PVDF 膜后,使用化學(xué)發(fā)光顯影液試劑盒顯色,拍照。
1.2.6斑馬魚體重、體長(zhǎng)測(cè)量 用200 mg·L-1三卡因?qū)?5、30、60 和90 dpf 斑馬魚麻醉,用吸水紙吸干魚體表面水分,在電子天平中稱重量(mg)。用直尺測(cè)量魚頭部最前端到尾鰭基部的距離,記為斑馬魚體長(zhǎng)(cm)。
1.2.7石蠟切片制作 取90 dpf 斑馬魚肝臟組織,4%多聚甲醛固定24 h。將組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋。蠟塊切成5 μm 薄片,37 ℃烘烤過(guò)夜。經(jīng)過(guò)脫蠟、染色等步驟后,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察并拍照。
1.2.8冰凍切片油紅O 染色 取90 dpf 斑馬魚肝臟組織,液氮冷凍30 s,浸泡在包埋劑中,-80 ℃冷凍,切片(10 μm)。4%多聚甲醛固定15 min,蒸餾水浸洗掉包埋劑,60%異丙醇浸洗2 min,油紅O染液(3 g·L-1)避光染色15 min,60%異丙醇清洗2次,蒸餾水浸洗1 min,蘇木素3 min,蒸餾水清洗干凈,甘油明膠封片。
1.2.9肝臟甘油三酯含量測(cè)定 分別取3尾90 dpf WT 與hdac11突變體斑馬魚的肝臟混合為一組并稱量肝臟重量,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),共計(jì)9尾魚,按照重量(g):體積(mL)=1∶9比例,加入9倍體積的磷酸鹽緩沖液,冰水浴條件下電動(dòng)研磨器研磨1 min,4 ℃條件下2 500 r·min-1離心10 min,按照南京建成公司的甘油三酯試劑盒(A110-1-1)說(shuō)明書取上清液,測(cè)量甘油三酯含量。另取少量上清液勻漿稀釋40倍檢測(cè)組織的總蛋白量,用于生化指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化。
1.2.10斑馬魚高脂模型的建立 將5 dpf 的WT和hdac11-/-斑馬魚均分成2 組,每組各120 尾,一組進(jìn)行正常飲食喂養(yǎng)(standard diet,SD),一組進(jìn)行高脂喂養(yǎng)(high fat diet,HFD)。在5~15 dpf階段SD 組每日投喂1 次草履蟲,HFD 組每日投喂3 次草履蟲以及10 mL 蛋黃溶液;16~90 dpf 階段SD組每日投喂5 mg 豐年蟲·尾-1,HFD 組每日投喂60 mg豐年蟲·尾-1以及10 mL蛋黃液。
1.2.11實(shí)時(shí)熒光定量PCR Trizol 法提取WT 和hdac11-/-斑馬魚肝臟的總RNA,使用北京全式金(AU341)TransScript?Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行第一鏈合成,使用PerfectStart?Green qPCR SuperMix 試劑盒進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增。在NCBI 網(wǎng)站上設(shè)計(jì)qPCR 引物(表1),以斑馬魚β-actin為內(nèi)參,檢測(cè)甘油三酯合成與分解相關(guān)基因在WT 和hdac11-/-斑馬魚中的表達(dá)水平,每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),基因表達(dá)水平采用相對(duì)定量方法2-ΔΔCt計(jì)算。
表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study
1.2.12數(shù)據(jù)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行處理,采用t檢驗(yàn)對(duì)不同樣品之間的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(ns:P>0.05;*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001;****:P<0.000 1)。
將靶點(diǎn)設(shè)計(jì)在hdac11基因第4外顯子的反義鏈上(圖1A),gRNA與Cas9蛋白混合注入斑馬魚胚胎細(xì)胞,待胚胎發(fā)育至48 hpf提取DNA,將F0代斑馬魚經(jīng)傳代得到F2代雜合和純合斑馬魚(圖1B)。生物信息學(xué)分析表明,突變型斑馬魚序列在79 個(gè)氨基酸后提前出現(xiàn)終止密碼子(圖1C)。Western blot結(jié)果顯示,hdac11-/-斑馬魚中檢測(cè)不到HDAC11蛋白的表達(dá),證明成功獲得缺失5 bp 的hdac11-/-斑馬魚突變體(圖1D)。
圖1 利用CRISPR/Cas9構(gòu)建hdac11突變體Fig. 1 Generation of hdac11 mutant using CRISPR/Cas9 system
為了觀察hdac11-/-斑馬魚(KO)表型,我們檢測(cè)了正常喂養(yǎng)條件下15、30、60 和90 dpf 的野生型和突變體的體重和體長(zhǎng)。結(jié)果顯示:與WT 相比,hdac11-/-斑馬魚的體重和體長(zhǎng)均無(wú)顯著性差異(圖2A~B)。然而,3 月齡hdac11-/-斑馬魚雌性和雄性的體表顏色更深(圖2C)。
圖2 hdac11-/-斑馬魚表型特征Fig. 2 Phenotypic characterization of zebrafish WT and hdac11-/-
為了研究敲除hdac11對(duì)斑馬魚甘油三酯的影響,本實(shí)驗(yàn)選取25 dpf 的WT 和hdac11-/-斑馬魚幼魚,通過(guò)油紅O 染色觀察幼魚體內(nèi)的脂滴分布情況,并檢測(cè)幼魚甘油三酯含量;用90 dpf WT 和hdac11-/-斑馬魚雄魚肝臟進(jìn)行蘇木素伊紅染色、油紅O染色以及甘油三酯含量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3A),WT 和hdac11-/-幼魚內(nèi)臟均存在脂滴,但與WT相比,hdac11-/-脂滴更小,并且hdac11-/-肝臟位置油紅著色較淺。全魚甘油三酯含量檢測(cè)顯示(圖3B),與WT 全魚甘油三酯含量(0.004 2±0.000 5 mmol·gprot-1)相比,hdac11-/-全魚甘油三酯含量(0.001 9±0.000 3 mmol·gprot-1)顯著降低(P<0.01)。
圖3 斑馬魚幼魚甘油三酯檢測(cè)Fig. 3 Triglyceride detection in larval zebrafish
如圖4所示,與WT相比,hdac11-/-肝臟細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異,但脂滴數(shù)量更少且變小,hdac11-/-肝臟甘油三酯含量(0.207 4±0.004 mmol·gprot-1)顯著低于WT(0.236 5±0.01 mmol·gprot-1,P<0.05)。
圖4 斑馬魚成魚甘油三酯檢測(cè)Fig. 4 Triglyceride detection in adult zebrafish.
為了進(jìn)一步研究敲除hdac11基因?qū)Π唏R魚脂代謝的影響,我們檢測(cè)了正常飲食(SD)和高脂飲食(HFD)后15、30、60 和90 dpf 斑馬魚的體重和體長(zhǎng),90 dpf 時(shí)雄魚肝臟的蘇木素伊紅染色、油紅O 染色以及肝臟甘油三酯含量。結(jié)果顯示:與SD 相比,HFD 組喂養(yǎng)60 d 后出現(xiàn)體重和體長(zhǎng)的顯著變化(P<0.000 1),但WT-HFD 與KO-HFD之間無(wú)顯著性差異(圖5A~B)。高脂誘導(dǎo)后,相比于野生型,KO-HFD 組肝臟細(xì)胞質(zhì)著色較淺,脂滴變?。▓D5C);相應(yīng)的,如圖5D,KO-HFD 組甘油三酯含量(0.234 4±0.010 0 mmol·gprot-1)也顯著低于WT-HFD 組(0.422 8±0.020 0 mmol·gprot-1,P<0.05)。
圖5 高脂誘導(dǎo)下hdac11-/-斑馬魚表型檢測(cè)Fig. 5 Phenotypic characterization in WT and hdac11-/- zebrafish under high fat diet
為了進(jìn)一步探究hdac11-/-斑馬魚甘油三酯降低的原因,我們檢測(cè)了甘油三酯分解途徑中關(guān)鍵基因pnpla2和lipeb的表達(dá)水平,這2 個(gè)基因在斑馬魚中分別編碼甘油三酯脂肪酶ATGL和激素敏感性脂肪酶HSL。同時(shí),我們也檢測(cè)了甘油三酯合成途徑基因gpam的表達(dá)水平,該基因在斑馬魚中編碼甘油-3-磷酸?;D(zhuǎn)移酶1(GPAT1)。RT-qPCR 結(jié)果顯示(圖6),正常飲食和高脂飲食條件下,hdac11-/-肝臟中pnpla2、lipeb基因表達(dá)水平均顯著上調(diào),gpam基因表達(dá)水平均顯著下調(diào)。
圖6 不同飲食條件下肝臟甘油三酯相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)Fig. 6 Expression of genes related to triglyceride under different dietary conditions
本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建了hdac11-/-斑馬魚模型,研究了hdac11對(duì)斑馬魚脂代謝的影響。首先,我們發(fā)現(xiàn)了正常飲食和高脂飲食下15、30、60、90 dpf的野生型與hdac11-/-斑馬魚之間體重和體長(zhǎng)均沒(méi)有顯著差異,說(shuō)明hdac11敲除對(duì)于斑馬魚的體重和體長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。有研究發(fā)現(xiàn),敲除hdac11后小鼠在正常飲食下沒(méi)有表現(xiàn)出體重的差異[13],但高脂飲食誘導(dǎo)后,hdac11-/-小鼠體重相對(duì)于野生型小鼠顯著降低[12]。上述結(jié)果說(shuō)明hdac11在斑馬魚和小鼠脂代謝中的作用有一定差異,可能是由于斑馬魚和小鼠的脂代謝過(guò)程有所不同。例如,研究發(fā)現(xiàn)小鼠中敲除hdac11能刺激棕色脂肪的形成,誘導(dǎo)白色脂肪褐變,促進(jìn)了棕色脂肪中解偶聯(lián)蛋白-1 的表達(dá),使脂代謝能力增強(qiáng),最終導(dǎo)致高脂誘導(dǎo)下hdac11-/-小鼠體重顯著降低[12]。而魚類屬于變溫動(dòng)物,體內(nèi)不存在棕色脂肪[14],因此斑馬魚和小鼠之間脂肪組織類型與脂代謝過(guò)程的差異均可能是造成表型差異的重要原因。有趣地是,其他HDAC 家族成員也參與脂代謝的調(diào)控,例如Chatterjee 等[15]發(fā)現(xiàn)hdac9-/-小鼠在高脂飲食下體重也顯著降低。HDAC 家族成員在脂代謝調(diào)節(jié)中的作用仍有待進(jìn)一步研究。
本研究發(fā)現(xiàn)正常飲食和高脂飲食下hdac11-/-斑馬魚肝臟中脂滴數(shù)量均變少變小,肝臟甘油三酯含量均顯著降低,說(shuō)明hdac11敲除后斑馬魚肝臟甘油三酯含量顯著下降。在小鼠中,高脂飲食條件下hdac11-/-小鼠肝臟甘油三酯、血漿甘油三酯含量均顯著降低,肝臟脂肪變性亦得以改善[12]。高脂飲食下HDAC11抑制劑能降低小鼠血清中甘油三酯的含量,而過(guò)表達(dá)HDAC11 能增加血清中甘油三酯的含量[16]。盡管目前對(duì)于正常飲食下hdac11-/-小鼠肝臟甘油三酯含量的研究尚無(wú)報(bào)道,上述結(jié)果仍提示在斑馬魚和小鼠中hdac11可以上調(diào)肝臟甘油三酯含量。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn),特異性敲除肝臟中hdac3的小鼠正常飲食下會(huì)導(dǎo)致肝臟甘油三酯的積累[17]。這些結(jié)果說(shuō)明多個(gè)HDAC 成員可能以不同的方式參與肝臟脂代謝調(diào)控。
為進(jìn)一步探究hdac11調(diào)節(jié)脂代謝涉及的分子機(jī)制,我們研究了甘油三酯代謝途徑中pnpla2、lipeb和gpam基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在正常飲食與高脂飲食條件下突變體中pnpla2和lipeb基因表達(dá)水平均顯著上調(diào),gpam基因表達(dá)水平均顯著下調(diào)。pnpla2基因編碼的ATGL 參與甘油三酯分解的第一步[18],lipeb基因編碼的HSL 是甘油三酯分解的限速酶[19],gpam基因編碼GPAT1,該酶催化甘油三酯合成的第一步反應(yīng)。已有研究報(bào)道,斑馬魚中敲除pnpla2會(huì)導(dǎo)致脂滴體積增大,引起嚴(yán)重的甘油三酯沉積[20];lipeb-/-小鼠在許多組織中存在大量甘油三酯的積累[21],GPAT1-/-小鼠體重、肝臟甘油三酯含量降低;高脂飲食后,與野生型相比,GPAT1-/-小鼠肝臟甘油三酯積累較少[22-23]。這些研究結(jié)果支持了我們?cè)趆dac11敲除的斑馬魚中檢測(cè)到的基因表達(dá)水平變化和甘油三酯含量降低的現(xiàn)象。這提示斑馬魚中敲除hdac11可能通過(guò)影響pnpla2、lipeb和gpam基因的表達(dá)水平,增加對(duì)甘油三酯的分解,減少甘油三酯的合成,導(dǎo)致甘油三酯含量降低。
綜上所述,本研究構(gòu)建了hdac11斑馬魚敲除模型,初步研究了hdac11在斑馬魚脂代謝中的作用,為魚類脂代謝過(guò)程中的表觀調(diào)控機(jī)制提供了新的研究方向。