楊倩婷 ， 田曉英 ， 張俊芳 ， 韓兵社

上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306

季節(jié)性溫差會(huì)導(dǎo)致水體溫度發(fā)生變化。有研究顯示，由于溫度升高魚類會(huì)出現(xiàn)遷徙、數(shù)量減少［1］、反應(yīng)能力減弱［2］等現(xiàn)象。此外，魚類面對(duì)溫度突然升高或者持續(xù)的高溫會(huì)產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)［3］。例如在夏季時(shí)，魚類容易因爆發(fā)疾病而死亡［4-5］，造成經(jīng)濟(jì)嚴(yán)重?fù)p失。因此，研究高溫對(duì)魚類的影響有重要意義。

tp53轉(zhuǎn)錄因子被稱為“基因守護(hù)者”，其在缺氧、DNA 損傷等壓力刺激時(shí)被激活，通過調(diào)控下游靶基因引起細(xì)胞周期阻滯、DNA 損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡與衰老，以此來保護(hù)機(jī)體［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，高溫壓力會(huì)激活tp53基因的表達(dá)［7］。Matsumoto等［8］發(fā)現(xiàn)tp53可能通過調(diào)控?zé)釕?yīng)激后的G 期停滯來修復(fù)DNA 損傷，從而降低tp53的熱敏感性。溫度應(yīng)激可能與tp53基因表達(dá)之間存在內(nèi)部聯(lián)系，提示該基因在高溫耐受能力方面可能發(fā)揮功能。然而，敲除tp53基因?qū)Π唏R魚高溫耐受能力的影響目前尚無研究報(bào)道。

溫度會(huì)影響魚類的逃逸、游泳和生殖洄游等行為，當(dāng)溫度變化導(dǎo)致魚類行為發(fā)生改變時(shí)，游泳行為就成為魚類此時(shí)最重要的環(huán)境適應(yīng)指標(biāo)［9］。tp53的缺失會(huì)影響魚類的反應(yīng)能力。在tp53與運(yùn)動(dòng)關(guān)系的相關(guān)研究中，Elabd 等［10］敲除斑馬魚tp53基因后，受精4 d 后（4 day post fertilization，4 dpf）的斑馬魚和5 dpf 的斑馬魚對(duì)震動(dòng)的反應(yīng)能力下降，逃避能力降低。我們推測(cè)，tp53在魚類的游泳能力中可能發(fā)揮作用，但是在高溫中tp53與運(yùn)動(dòng)能力的研究尚不清楚。

本研究以WT 斑馬魚和tp53-/-斑馬魚為實(shí)驗(yàn)材料，采用梯度升溫的方式對(duì)斑馬魚進(jìn)行高溫耐受實(shí)驗(yàn)，并檢測(cè)了34 ℃下斑馬魚的運(yùn)動(dòng)能力，以期為斑馬魚高溫耐受機(jī)制和運(yùn)動(dòng)行為學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用WT 斑馬魚為AB 品系，tp53-/-斑馬魚為本實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建品系［11］。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

主要實(shí)驗(yàn)儀器：恒溫培養(yǎng)箱（HBW-1000）購于江南儀表廠；熒光定量PCR儀（LightCycler 480）購于Bio-Rad 生物公司；超聲波細(xì)胞破碎儀（HX-ⅡD）購于上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；酶標(biāo)儀（Read-Max1900 型）購于上海閃譜生物科技有限公司；尼康體視顯微鏡（SMZ1500）購于尼康儀器（上海）有限公司；斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)（Danio Vision System）購于諾達(dá)思信息技術(shù)公司。

主要實(shí)驗(yàn)試劑：反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser 購于TaKaRa 生物公司；iTaqUniver SYBR Green Supermix 熒光定量試劑（1725124）購于Bio-Rad 生物公司；活性氧檢測(cè)試劑盒（S0033）、增強(qiáng)型ATP 檢測(cè)試劑盒（S0027）、蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（C0105M）均購于碧云天生物技術(shù)有限公司；γH2A.X 抗體（ab228655）購于Abcam公司。

1.3 斑馬魚養(yǎng)殖方案

斑馬魚飼養(yǎng)在水溫為28 ℃，pH 7 左右，光照/黑暗時(shí)間為14 h/10 h 的水循環(huán)系統(tǒng)中，以新鮮孵化的豐年蝦飼喂斑馬魚。

1.4 高溫處理升溫方案

以臨界溫度法測(cè)定魚的耐受性［12］，具體梯度升溫的方案如圖1所示：水溫以每小時(shí)1 ℃的速度從28 ℃勻速升溫至34 ℃，水溫在34 ℃維持12 h后，再以每小時(shí)1 ℃的速度勻速升溫至43 ℃，此后維持在43 ℃。在進(jìn)行梯度升溫實(shí)驗(yàn)前一天開始對(duì)實(shí)驗(yàn)斑馬魚禁食。

圖1 高溫升溫流程Fig. 1 Heating process

1.5 斑馬魚高溫耐受實(shí)驗(yàn)

將WT 斑馬魚和tp53-/-斑馬魚各20 條同時(shí)置于裝有6 L 循環(huán)水的魚缸中，WT 斑馬魚和tp53-/-斑馬魚中間用隔板隔開。使用圖1 的高溫升溫方案，斑馬魚在高溫下游動(dòng)速度加快，當(dāng)斑馬魚不再游動(dòng)且身體失去平衡后，將斑馬魚撈至28 ℃的水中，觀察狀態(tài)，若不能恢復(fù)則判定死亡。統(tǒng)計(jì)不同基因型斑馬魚的死亡時(shí)間、體重和體長(zhǎng)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取28 ℃、43 ℃ 0 h、43 ℃ 2 h 這3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)各3 條斑馬魚進(jìn)行混樣，用Trizol 法提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)成cDNA，在NCBI網(wǎng)站上設(shè)計(jì)RT-qPCR的引物（表1），以斑馬魚β-actin為內(nèi)參基因，使用iTaqUniver SYBR Green Supermix熒光定量試劑進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 RT-qPCR引物Table 1 Primers of RT-qPCR

1.7 ROS的測(cè)定

根據(jù)圖1 所示，43 ℃高溫處理2 h 后，將斑馬魚軀干放置在EP 管中，按1∶6 比例加入Tris-HCl（pH 8.0），用勻漿器進(jìn)行充分研磨，離心5 min。取上清液20 μL 和180 μL 探針至96 孔板中，進(jìn)行3 個(gè)重復(fù)，放至28 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min。檢測(cè)樣品熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm，得到的數(shù)據(jù)分析處理后得到活性氧的相對(duì)表達(dá)含量。

1.8 ATP的測(cè)定

根據(jù)圖1 所示，43 ℃高溫處理2 h，取斑馬魚的肌肉組織，每1 mg 肌肉組織中加入10 μL ATP檢測(cè)裂解液，在冰上進(jìn)行充分研磨。離心5 min，取20 μL 上清液至白色96 孔板中，加入100 μL ATP 檢測(cè)工作液，室溫放置3～5 min，檢測(cè)樣品的發(fā)光值。根據(jù)增強(qiáng)型ATP 檢測(cè)試劑盒說明書制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

1.9 Western blot檢測(cè)DNA損傷

取WT 和tp53-/-斑馬魚全魚用于γH2A.X 蛋白修飾檢測(cè)。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：在各樣品中加入RIPA 細(xì)胞裂解液，研磨超聲提取總蛋白，離心取上清，Bradford法檢測(cè)蛋白濃度。使用Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，一抗?jié)舛葹椋害肏2A.X（1∶2 000），Actin（1∶2 000），將PVDF 膜放入塑料膜中，加入一抗稀釋液并密封，在4 ℃搖床上孵育過夜。TBST 清洗后加入羊抗兔IgG-HRP 抗體（1∶2 000），將PVDF 膜放入塑料膜中，加入二抗稀釋液并密封，在常溫下?lián)u床孵育2 h。TBST 清洗PVDF 膜后，使用顯影液化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色后拍照。

1.10 制作石蠟切片及HE染色

取43 ℃處理2 h 的斑馬魚肝臟，取樣后立即放入4 %多聚甲醛固定液中固定72 h。固定結(jié)束后，將樣品進(jìn)行脫水、透明和浸蠟。蠟塊凝固后，進(jìn)行連續(xù)切片，切至內(nèi)臟部分時(shí)，用載玻片收集組織切片。切片烘干后，進(jìn)行脫蠟、HE染色、脫水、透明、封片。在尼康體視顯微鏡下觀察切片。

1.11 運(yùn)動(dòng)行為學(xué)監(jiān)測(cè)

隨機(jī)選取生長(zhǎng)狀況良好的1月齡WT和tp53-/-斑馬魚幼魚轉(zhuǎn)移至12孔板中，每孔1尾，每組6尾。采用Danio Vision 斑馬魚行為軌跡分析系統(tǒng)對(duì)斑馬魚進(jìn)行運(yùn)動(dòng)行為學(xué)監(jiān)測(cè)。先將斑馬魚轉(zhuǎn)移至暗室中適應(yīng)5 min，采集過程中保持周圍環(huán)境安靜。調(diào)節(jié)溫控系統(tǒng)將水溫直接升至34 ℃，監(jiān)測(cè)斑馬魚在34 ℃條件下的行為活動(dòng)。導(dǎo)出斑馬魚的運(yùn)動(dòng)軌跡圖和熱圖，根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算并分析斑馬魚的移動(dòng)距離、平均速度、最大加速度和活躍度。單次實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)時(shí)長(zhǎng)設(shè)定為10 min，每個(gè)溫度條件設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.12 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作用，獨(dú)立樣本顯著差異性分析采用t檢測(cè)。Western blot 蛋白灰度值使用Image J 軟件進(jìn)行處理。ns 表示在P＞0.05 水平上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*表示在P＜0.05水平上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；**表示在P＜0.01 水平上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；***表示在P＜0.001水平上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 tp53基因在高溫下的表達(dá)水平

RT-qPCR 結(jié)果顯示（圖2），與28 ℃相比，高溫下斑馬魚tp53mRNA 的相對(duì)表達(dá)量在43 ℃下升高，且高溫處理時(shí)間越長(zhǎng)，tp53mRNA 的相對(duì)表達(dá)量越高，這提示高溫激活了tp53的表達(dá)。

圖2 tp53 mRNA表達(dá)水平Fig. 2 tp53 mRNA expression level

2.2 敲除tp53基因?qū)Π唏R魚高溫存活時(shí)間的影響

對(duì)WT 斑馬魚和tp53-/-斑馬魚進(jìn)行高溫處理，當(dāng)溫度升高時(shí)，斑馬魚游動(dòng)速度加快，十分活躍。當(dāng)溫度達(dá)到43 ℃時(shí)，斑馬魚向水面游動(dòng)。制作生存曲線（圖3A），結(jié)果顯示W(wǎng)T斑馬魚的LT50為9 h，tp53-/-斑馬魚LT50為7 h（圖3B）。與WT 斑馬魚相比，tp53-/-斑馬魚在高溫下存活時(shí)間降低，說明tp53-/-斑馬魚不耐高溫。對(duì)斑馬魚的體重和體長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果顯示W(wǎng)T 和tp53-/-斑馬魚的體重體長(zhǎng)無顯著差異（圖3C～D）。同時(shí)，對(duì)斑馬魚的體重、體長(zhǎng)與存活時(shí)間進(jìn)行相關(guān)性分析，表明體重、體長(zhǎng)與存活時(shí)間無相關(guān)性（圖3E～F）。綜上說明，敲除tp53基因能夠降低高溫下斑馬魚的存活時(shí)間。

圖3 斑馬魚的高溫耐受實(shí)驗(yàn)Fig. 3 High temperature tolerance experiment of zebrafish

2.3 高溫對(duì)tp53-/-斑馬魚DNA的影響

為探究高溫下tp53-/-斑馬魚存活時(shí)間降低的原因，取28 ℃、43 ℃下2 h 的WT 和tp53-/-斑馬魚軀干以及肌肉分別進(jìn)行ROS、ATP水平測(cè)定，結(jié)果（圖4）顯示，28 ℃下，與WT 斑馬魚相比，tp53-/-斑馬魚ROS、ATP 水平均沒有顯著差異（P＞0.05）。在43 ℃下，tp53-/-斑馬魚的ROS水平明顯高于WT斑馬魚（P＜0.05），ATP 水平顯著低于WT 斑馬魚的ATP 水平（圖4B）。為檢測(cè)43 ℃高溫對(duì)WT 與tp53-/-斑馬魚在蛋白水平的DNA 損傷，γH2A.X 作為DNA 損傷的標(biāo)記物，其表達(dá)變化可以用來說明DNA 損傷水平。取斑馬魚全魚，使用Western blot檢測(cè)γH2A.X 蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，在28 ℃，WT 與tp53-/-斑馬魚的γH2A.X 蛋白表達(dá)水平無明顯差異；在43 ℃高溫下，tp53-/-斑馬魚的γH2A.X蛋白表達(dá)水平顯著高于WT 斑馬魚（圖4C～D）。上述結(jié)果說明，高溫環(huán)境下敲除tp53的斑馬魚損傷更加嚴(yán)重。

圖4 高溫對(duì)不同基因型斑馬魚的影響Fig. 4 Effects of high temperature on zebrafish of different genotypes

2.4 高溫對(duì)斑馬魚肝組織的影響

為檢測(cè)高溫對(duì)于斑馬魚組織的影響，我們分別取28 ℃和43 ℃處理2 h 的WT 和tp53-/-斑馬魚的腦、肝、眼和心臟，進(jìn)行HE 染色，結(jié)果（圖5）顯示，28 ℃下，WT 斑馬魚與tp53-/-斑馬魚的肝臟之間沒有顯著差異；高溫處理下，WT 和tp53-/-斑馬魚肝臟均出現(xiàn)充血狀態(tài)，肝細(xì)胞變形且形狀不規(guī)則，細(xì)胞之間的接觸變得松散，細(xì)胞質(zhì)丟失，但是與WT 斑馬魚相比，tp53-/-斑馬魚的肝臟組織充血現(xiàn)象更嚴(yán)重（圖5D）。然而，在WT 和tp53-/-斑馬魚的其他組織中沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。

圖5 WT和tp53-/-斑馬魚不同組織的HE染色Fig. 5 HE staining of different tissues in WT and tp53-/-zebrafish

2.5 敲除tp53基因?qū)Ω邷叵掳唏R魚運(yùn)動(dòng)能力的影響

為探究敲除tp53基因是否會(huì)影響高溫下斑馬魚的運(yùn)動(dòng)能力，本研究利用斑馬魚行為軌跡分析系統(tǒng)在34 ℃對(duì)1月齡WT和tp53-/-斑馬魚進(jìn)行運(yùn)動(dòng)行為學(xué)監(jiān)測(cè)，生成了斑馬魚的運(yùn)動(dòng)軌跡圖（圖6A）和熱圖（圖6B）。對(duì)斑馬魚的移動(dòng)距離（圖6C）、平均速度（圖6D）、最大加速度（圖6E）和活躍度（圖6F）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在28 ℃條件下，tp53-/-斑馬魚的移動(dòng)距離、平均速度、活躍度和最大加速度與WT 斑馬魚相比沒有顯著差異；在34 ℃條件下，tp53-/-斑馬魚的各指標(biāo)顯著降低，這說明tp53敲除后，斑馬魚在高溫下的運(yùn)動(dòng)能力降低。

圖6 敲除tp53對(duì)斑馬魚行為學(xué)的影響Fig. 6 Effect of tp53 knockout on behavior of zebrafish

3 討論

tp53可被輻射、DNA損傷劑、溫度、低pH等因素激活，從而對(duì)下游靶基因進(jìn)行調(diào)控［13］。本研究發(fā)現(xiàn)tp53在高溫下被激活，且敲除tp53可以降低斑馬魚的存活時(shí)間和運(yùn)動(dòng)能力，導(dǎo)致肝臟嚴(yán)重受損。在結(jié)腸癌細(xì)胞和斑馬魚胚胎中發(fā)現(xiàn)40 ℃高溫壓力下，tp53會(huì)通過激活HSP90 的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞存活，但是在43 ℃下tp53會(huì)激活細(xì)胞凋亡進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的死亡［14］。此外，溫度處理方式也會(huì)影響魚類的溫度耐受能力。適度的高溫馴化會(huì)增加魚類的抗熱能力，改善微生物的群落結(jié)構(gòu)［15］。研究發(fā)現(xiàn)，Hela 細(xì)胞在獲得高溫耐受性后可以提高抗凋亡蛋白的表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)由過氧化物引起的細(xì)胞凋亡［16］。在倉鼠卵巢癌細(xì)胞和人宮頸癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)40 ℃預(yù)處理3 h 后，可抵抗隨后在43 ℃下的致死性熱休克［17］。本研究中，高溫下tp53可能是通過激活熱休克蛋白的表達(dá)，從而提高斑馬魚的高溫耐受能力。

43 ℃下，與WT 斑馬魚相比，tp53-/-斑馬魚ROS 水平顯著升高，ATP 水平顯著降低，γH2A.X蛋白水平顯著升高，說明tp53參與了DNA 損傷修復(fù)的相關(guān)通路?；钚匝醯牟粩喾e累會(huì)導(dǎo)致生物機(jī)體的衰老，機(jī)體的抗氧化能力和不斷產(chǎn)生的氧自由基之間的動(dòng)態(tài)平衡一旦被打破，就會(huì)引起組織損傷［18］。還有研究提示，ROS 的積聚引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致線粒體中ATP 水平下降，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷［19］。tp53通過上調(diào)抗氧化基因使細(xì)胞降低ROS 的氧化，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用［20］。例如，在tp53基因敲除小鼠的脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞中觀察到了tp53缺失的細(xì)胞中ROS水平持續(xù)增加，促進(jìn)了氧化作用［19］。當(dāng)刺激因素引起DNA 損傷時(shí)，P53 蛋白會(huì)被迅速活化并且聚集，阻滯細(xì)胞周期并修復(fù)受損DNA［21-24］。因此，可能是由于ROS 水平升高導(dǎo)致ATP 合成能力降低，DNA 損傷增加使得敲除tp53斑馬魚存活時(shí)間降低。

本研究對(duì)高溫下斑馬魚腦、心臟、眼和肝組織進(jìn)行HE 染色，發(fā)現(xiàn)tp53-/-斑馬魚肝臟充血現(xiàn)象更加嚴(yán)重，其余組織在高溫下并沒有觀察到顯著差異。溫度升高會(huì)增加肝臟負(fù)荷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成肝損傷［25］。有研究顯示，斑馬魚胚胎在γ 輻射下會(huì)引起tp53在肝臟的積聚［26］。但是高溫下關(guān)于tp53與肝臟的研究還未見報(bào)道，所以高溫導(dǎo)致tp53-/-斑馬魚肝臟充血現(xiàn)象嚴(yán)重的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

高溫下，敲除tp53基因后斑馬魚的移動(dòng)距離、平均速度、加速度以及活躍性顯著降低，這說明tp53的缺失影響了高溫下斑馬魚的運(yùn)動(dòng)行為。移動(dòng)距離或速度經(jīng)常用于精神藥理學(xué)、行為神經(jīng)科學(xué)和行為遺傳學(xué)研究，被用來衡量運(yùn)動(dòng)活動(dòng)、多動(dòng)癥、探索性行為，甚至恐懼和焦慮［24］。研究表明，敲除tp53的斑馬魚幼魚在觸摸刺激和逃逸反應(yīng)需要更多的時(shí)間［10］。在小鼠中，tp53的缺失導(dǎo)致最大運(yùn)動(dòng)能力顯著降低，tp53通過調(diào)節(jié)不同的線粒體基因和機(jī)制來促進(jìn)有氧代謝和運(yùn)動(dòng)能力［27-28］。這與34 ℃下斑馬魚的運(yùn)動(dòng)能力結(jié)果一致，但是具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究以tp53-/-斑馬魚為模型，研究了tp53對(duì)高溫耐受能力和運(yùn)動(dòng)能力的影響。結(jié)果顯示，在高溫環(huán)境下，tp53-/-斑馬魚的ROS 水平升高導(dǎo)致ATP 合成能力降低，DNA 損傷增加使得敲除tp53斑馬魚存活時(shí)間和運(yùn)動(dòng)能力降低，肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷。