劉容麟 ， 王寧 ， 李巖異 ， 張衛(wèi)婷

1.華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司，石家莊 050035；

2.石家莊農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，石家莊 050000

低溫保存技術(shù)是一種利用極低的溫度（一般為-80 ℃/-196 ℃），通過(guò)冷凍、低溫保存和解凍的過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物制品的長(zhǎng)期儲(chǔ)存和再使用的方法［1］。通過(guò)低溫保存，生物制品可得到優(yōu)質(zhì)、有效和安全的保障，從而延長(zhǎng)細(xì)胞、蛋白、病毒和疫苗原液等生物制品的儲(chǔ)存期限，擴(kuò)展生物制品使用的靈活性。然而，低溫保存中仍然存在生物制品失活、降解和變性等現(xiàn)象（圖1），因此需要選擇合適的冷凍保護(hù)劑（cryoprotectant agents， CPAs）和優(yōu)化低溫冷凍工藝以減少生物制品長(zhǎng)期儲(chǔ)存過(guò)程帶來(lái)的損傷［2］。本文綜述了低溫保存技術(shù)的最新應(yīng)用進(jìn)展，以期為生物制品低溫保存相關(guān)研究提供技術(shù)參考。

圖1 細(xì)胞及生物分子在低溫保存中的損傷因素Fig. 1 Damage factors of cells and biomolecules during cryopreservation

1 低溫保存技術(shù)

低溫保存技術(shù)是利用低溫條件，將體系中一切物理化學(xué)反應(yīng)變得極為緩慢甚至停止為一種保存技術(shù)，常用于不穩(wěn)定物質(zhì)的儲(chǔ)存。低溫保存技術(shù)在生物制品中，主要是通過(guò)降低生物、組織、細(xì)胞、微生物的酶活性，減緩代謝速度，防止生物大分子物質(zhì)發(fā)生降解和氧化，從而實(shí)現(xiàn)生物制品的長(zhǎng)期保存［2］。低溫保存技術(shù)可以分為一般冷凍、超低溫冷凍和液氮冷凍。一般冷凍是將樣品置于溫度為-40 ℃或更低的環(huán)境中，使體系的溫度處于玻璃轉(zhuǎn)變溫度（glass transition temperature， Tg）或共晶溫度（eutectic temperature， Te）以下，適用于細(xì)胞、細(xì)菌、酵母等微生物的保存。超低溫冷凍是將樣品置于溫度為-80 ℃或更低的環(huán)境中，可長(zhǎng)期保存DNA、血液等大分子物質(zhì)和生物組織。液氮冷凍是將樣品浸泡在液氮中保存，溫度為-196 ℃，是保護(hù)珍貴生物遺傳資源的最有效方法之一［3-5］。

2 低溫保存技術(shù)的影響因素

生物制品是指由普通的或以基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)獲得的微生物、細(xì)胞及各種動(dòng)物和人源的組織和液體等生物材料制備的，用于人類(lèi)疾病預(yù)防、治療和診斷的產(chǎn)品，主要包括生物大分子、細(xì)胞和組織等。由于生物制品具有復(fù)雜度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，其生產(chǎn)和制備過(guò)程異常繁瑣，質(zhì)量控制極為嚴(yán)格，經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值非常高，所以對(duì)于生物制品的保存技術(shù)提出了很高要求。目前，低溫保存技術(shù)是生物制品實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存最有效的手段之一，如何利用低溫保存技術(shù)實(shí)現(xiàn)生物制品的長(zhǎng)期保存，延長(zhǎng)保存期限，維持其生物活性和功能完整性，是當(dāng)前生物制品研究的一個(gè)重點(diǎn)關(guān)注領(lǐng)域。

低溫保存技術(shù)雖然可以長(zhǎng)期有效地保持生物制品的功能和活性，但各種條件和因素均影響其保存效果，主要影響因素包括冷凍保護(hù)劑、冷凍過(guò)程、冷凍速率、儲(chǔ)存溫度和解凍速率等。通過(guò)對(duì)這些影響因素的研究，可以更好地解決生物制品在長(zhǎng)期保存中存在的問(wèn)題。

2.1 CPAs

CPAs 是一種用于保護(hù)生物組織免于因冷凍而受損害（即由于冰晶形成的損害）的物質(zhì)，目前被廣泛應(yīng)用于生物制品的低溫保存中。CPAs 可以分為傳統(tǒng)型保護(hù)劑和復(fù)合型保護(hù)劑2 大類(lèi)，在生物制品的低溫保存中發(fā)揮著重要作用。

2.1.1傳統(tǒng)CPAs 傳統(tǒng)CPAs分為滲透性和非滲透性2種。滲透性CPAs包括二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）、甘油、乙二醇、丙二醇和乙酰胺等，這些物質(zhì)可以在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前穿透細(xì)胞膜，提供細(xì)胞內(nèi)的冷凍保護(hù)，也可以通過(guò)極性相互作用，定位在細(xì)胞膜磷脂的極性區(qū)域，取代水分子滲透到細(xì)胞膜內(nèi)。20世紀(jì)40年代，Polge等［5］首次報(bào)道了10%～40%甘油對(duì)精子具有冷凍保護(hù)作用，其機(jī)制主要是能夠避免因冷凍引起的細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)濃度升高問(wèn)題［6］。然而，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)有些細(xì)胞對(duì)甘油不敏感，如牛紅細(xì)胞。之后，研究者又發(fā)現(xiàn)DMSO 是一種滲透性更強(qiáng)的物質(zhì)，對(duì)人、牛紅細(xì)胞和牛精子的冰凍損傷具有明顯的保護(hù)作用。Mokoena等［7］通過(guò)使用DMSO建立了海洋單細(xì)胞藻類(lèi)的低溫保存方法，保存后其存活率達(dá)到與凍存前相同的水平。Prieto-Guevara 等［8］研究了DMSO 和甲醇（methanol， MET）作為CPAs 在微藻保存中的效果，發(fā)現(xiàn)DMSO濃度在5%時(shí)微藻的細(xì)胞損傷率最低。Nikitin等［9］發(fā)現(xiàn)甘油（90%培養(yǎng)基和10%的甘油）或乙二醇（90%培養(yǎng)基和10%乙二醇）作為CPAs，能長(zhǎng)期儲(chǔ)存溶血性曼氏桿菌，存活率分別為98.6%、95.7%，而不使用CPAs時(shí)，存活率僅為40.0%。Kardorff等［10］研究發(fā)現(xiàn)低溫保存人間充質(zhì)干細(xì)胞和人真皮成纖維細(xì)胞時(shí)，使用滲透性CPAs 如尿素和葡萄糖時(shí)，其細(xì)胞存活率與DMSO 相當(dāng)。鑒于DMSO 具有一定的細(xì)胞毒性，尿素和葡萄糖可作為替代DMSO 的安全低溫保護(hù)劑。腺相關(guān)病毒一直是體外和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移最常見(jiàn)和最通用的載體之一。腺相關(guān)病毒的生產(chǎn)過(guò)程難度大、周期長(zhǎng)，其中一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是純化后病毒載體的感染能力恢復(fù)。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)緩沖液組和實(shí)驗(yàn)組（5%甘油和0.001% Pluronic F68）在4 ℃儲(chǔ)存時(shí)，病毒的滴度損失程度相似［11］。但是，在經(jīng)過(guò)數(shù)次-80 ℃的冷凍/解凍循環(huán)后，與緩沖液組相比，實(shí)驗(yàn)組的病毒感染能力最為穩(wěn)定。

非滲透性CPAs 主要包括一些聚合材料和小分子物質(zhì)，其中聚合材料主要為聚乙烯吡咯烷酮、羥乙基淀粉（hydroxyethyl starch， HES）、聚乙二醇、葡聚糖等，小分子物質(zhì)主要為蔗糖、海藻糖、明膠等。這些物質(zhì)可以和細(xì)胞外的自由水分子結(jié)合，減少冷凍過(guò)程中細(xì)胞外冰晶的形成，但不能防止細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，因此在細(xì)胞冷凍保存中，不能單獨(dú)使用非滲透性CPAs，需與滲透性CPAs結(jié)合共同使用，通過(guò)稀釋溶質(zhì)效應(yīng)，改變?nèi)芤赫扯忍岣弑Ｗo(hù)效果［12］。Marton 等［13］使用1%大分子聚合物聚乙二醇（poly ethylene glycol， PEG）作為保護(hù)劑進(jìn)行冷凍時(shí)，噬菌斑形成單位回收率接近100%。通過(guò)冷凍和解凍的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在改變聚乙烯醇骨架結(jié)構(gòu)后，無(wú)規(guī)則聚乙烯醇比有規(guī)則聚乙烯醇表現(xiàn)出更明顯的冰重結(jié)晶抑制（ice recrystallization inhibition， IRI），聚脯氨酸也具有冰晶抑制活性，可保護(hù)生物體免受冰凍損傷［14］（表1）。

表1 低溫冷凍保護(hù)劑及特性Table 1 Cryogenic protection materials and their characteristics

2.1.2復(fù)合型CPAs 為了平衡滲透性CPAs 毒性和保存效率之間的矛盾，有效的策略是將滲透性CPAs 與非滲透性CPAs 兩者相結(jié)合，即形成復(fù)合型CPAs。通過(guò)降低滲透性CPAs 的濃度，減少毒性，利用非滲透性CPAs 減少體系冰晶的形成，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞更好的保存。Boafo 等［26］研究發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型的低溫保護(hù)劑具有不同的作用機(jī)制，而復(fù)合型CPAs對(duì)脂質(zhì)體的低溫儲(chǔ)存效果更好。

Fujita 等［15］嘗試探索不含DMSO 的低溫保存液冷凍人脂肪源間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果表明，在乳酸林格氏溶液中加入3%海藻糖、5%右旋糖酐和2.5%～5.0%丙二醇，可以較好地恢復(fù)凍融后的人脂肪源性間充質(zhì)基質(zhì)的細(xì)胞活性，這在細(xì)胞治療中具有很好的前景。Guo等［27］發(fā)現(xiàn)復(fù)合型CPAs在-80 ℃和-196 ℃均可以顯著提高法氏諾卡氏菌和鼠疫耶爾森氏菌疫苗株的存活率。法氏諾卡氏菌保存最佳復(fù)合CPAs為0.292 mol·L-1蔗糖、0.62 mol·L-1左旋肉堿和2.82 mol·L-1甘油，鼠疫耶爾森氏菌疫苗株保存的最佳復(fù)合CPAs 為左旋肉堿0.62 mol·L-1、甘油8.46 mol·L-1、蔗糖0.292 mol·L-1。Xin 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用甘油和海藻糖等組成的復(fù)合型冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍保存時(shí)，可以有效保護(hù)DNA折紙納米結(jié)構(gòu)免受凍結(jié)損傷，并不會(huì)對(duì)其形態(tài)產(chǎn)生不良影響，為DNA 折紙納米結(jié)構(gòu)在低溫下長(zhǎng)期保存提供了基礎(chǔ)。

2.1.3新型CPAs CPAs 的研究和應(yīng)用有著更廣闊的前景，隨著現(xiàn)代科技的不斷發(fā)展，CPAs 種類(lèi)也越來(lái)越多，并不斷涌現(xiàn)出新型的冷凍保護(hù)劑，如抗凍（糖）蛋白、大分子聚合物等，這些新材料的應(yīng)用，不斷推動(dòng)著低溫冷凍保護(hù)技術(shù)的進(jìn)步。

生存在極冷環(huán)境中的生物擁有一種特殊的冷適應(yīng)能力，能產(chǎn)生一類(lèi)抵御寒冷的蛋白質(zhì)。這類(lèi)保護(hù)性蛋白質(zhì)被稱(chēng)為抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）或抗凍糖蛋白（antifreeze glycoproteins，AFGPs），其具有獨(dú)特的冰晶控制功能。迄今為止，在天然魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)、細(xì)菌等體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了各種各樣的AFPs 和AFGPs。AFPs 平面與冰晶之間的優(yōu)先結(jié)合導(dǎo)致冰表面的微曲率變平緩，從而抑制了冰晶的生長(zhǎng)，使其能夠作為抑制冰再結(jié)晶的冰重結(jié)晶抑制劑（ice recrystallization inhibitors，IRI），AFGPs是迄今為止最有效的IRI［29］。Sreter等［17］研究了來(lái)自光滑鱉甲的抗凍蛋白在人胚胎腎細(xì)胞低溫保存的效果，發(fā)現(xiàn)該抗凍蛋白與DMSO 聯(lián)合使用能夠顯著提高低溫保存細(xì)胞的存活率。另外，Sun等［18］研究表明，在人胚胎皮膚成纖維細(xì)胞低溫保存緩沖液中，添加AFGPs 可顯著提高細(xì)胞的存活率，與非糖基化AFPs 的研究結(jié)果相符。AFGPs 經(jīng)半乳糖部分化學(xué)修飾后，具有額外的疏水性基團(tuán)，相較未經(jīng)修飾的AFGPs，顯著提高了人紅細(xì)胞恢復(fù)活力。此現(xiàn)象可能的作用機(jī)制是AFGPs 通過(guò)疏水相互作用插入細(xì)胞膜中，改變了酰基鏈的構(gòu)象，降低了膜通透性，從而提高了細(xì)胞的存活率。

聚合物具有良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性、可調(diào)性和生物相容性，已成為廣泛應(yīng)用的低溫保護(hù)劑。它們可以有效地調(diào)節(jié)低溫下的水分子運(yùn)動(dòng)和晶體生長(zhǎng)過(guò)程，從而起到保護(hù)生物制品活性的作用。聚合物通常具有較高的Tg。Tg 值越高，其結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，越能夠保持在低溫環(huán)境下的形態(tài)和活性。聚乙二醇、聚乙烯醇、海藻糖聚合物以及多聚脯氨酸等是聚合物中典型的低溫保護(hù)劑。Diaz-Dussan 等［23］使用皮膚成纖維細(xì)胞、HeLa（宮頸癌）和PC3（前列腺）癌細(xì)胞系，在控制速率和超快速冷凍方案下孵育24 h，成功地保持了高水平解凍后細(xì)胞膜的完整性，并通過(guò)差示掃描量熱法證實(shí)了海藻糖聚合物作為CPAs 具有獨(dú)特的冰再結(jié)晶抑制活性。Feyzmanesh等［22］研究也表明使用海藻糖聚合物作為保護(hù)劑可以有效保存人類(lèi)精子。使用DMSO 和乙二醇等小分子時(shí)，需要較高濃度，而這些分子在化學(xué)和遺傳學(xué)上對(duì)細(xì)胞有毒害作用，因此在臨床使用中受到限制。Qin 等［30］研究表明凍存液中使用L-脯氨酸低聚物后，DMSO 和乙二醇用量大大減少，同時(shí)大幅提高了卵母細(xì)胞存活率。此外，有研究表明使用圓二色光譜、動(dòng)態(tài)冰成形和傅里葉變換紅外光譜等方法檢測(cè)對(duì)聚L-丙氨酸-co-L-賴(lài)氨酸與聚乙烯醇，發(fā)現(xiàn)二者的IRI 活性與其α 螺旋度、疏水/親水平衡、分子量以及聚合物與冰晶相互作用的程度有關(guān)［22，25］。

氧化石墨烯是一種高導(dǎo)熱性材料，在低溫保存方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。它可以制成非常薄且堅(jiān)韌的保護(hù)層，為冷凍樣品在極低溫度下提供有效的保護(hù)。此外，氧化石墨烯還可以作為傳熱介質(zhì)，通過(guò)快速降溫來(lái)避免結(jié)晶和變性或者通過(guò)快速升溫來(lái)避免重結(jié)晶帶來(lái)的冰晶損傷。傳統(tǒng)的胚胎低溫保存技術(shù)面臨著加熱和冷卻速度較慢的瓶頸，而氧化石墨烯的高導(dǎo)熱性可以改善這一問(wèn)題。在一項(xiàng)研究中，氧化石墨烯納米顆粒被添加到新型導(dǎo)熱冷凍溶液中，可以用于小鼠囊胚的低溫保存［26］。與傳統(tǒng)的糖溶液相比，氧化石墨烯可以使胚胎冷凍玻璃化后再膨脹、孵化和著床不受影響，同時(shí)還可以防止細(xì)胞和分子的應(yīng)激，下調(diào)促凋亡基因Bcl-2相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein， BAX）和轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白53（transformation related protein 53， Trp53）的表達(dá)，體現(xiàn)出其作為胚胎CPAs 的潛力。另一項(xiàng)研究評(píng)估了氧化石墨烯作為CPAs對(duì)奶牛動(dòng)物精子活力的保護(hù)效果，結(jié)果顯示將氧化石墨烯添加到三羥甲基氨基甲烷蛋黃甘油擴(kuò)展劑中可以改善牛、水牛精液解凍后的品質(zhì)［31］。綜上，氧化石墨烯作為導(dǎo)熱材料在生物制品低溫保存領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。

2.2 冷凍過(guò)程

冷凍過(guò)程會(huì)對(duì)生物制品的質(zhì)量有多種影響，如生物制品結(jié)構(gòu)和功能的改變、生物反應(yīng)速率的變化、溶解性和穩(wěn)定性的改變。由于生物制品具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和成分，因此冷凍過(guò)程需要精確控制以最大限度地減少損傷。冷凍過(guò)程中需要注意的重要因素包括：儲(chǔ)存溫度、冷凍速率、解凍速率和其他因素。通過(guò)對(duì)這些冷凍過(guò)程機(jī)制的研究，可以更好地解決在生物制品冷凍過(guò)程中造成的質(zhì)量損害。

2.2.1儲(chǔ)存溫度 在生物制品冷凍過(guò)程中，應(yīng)選擇足夠低的儲(chǔ)存溫度，使整個(gè)溶液體系降至Tg 以下，整個(gè)物質(zhì)體系變?yōu)楣虘B(tài)，以避免降解反應(yīng)和溶質(zhì)對(duì)細(xì)胞或生物分子的破壞。在Tg 附近或之上，體系仍會(huì)有粘稠的液體水流動(dòng)，引起可能的物理或化學(xué)降解反應(yīng)以及溶質(zhì)濃縮效應(yīng)，造成生物制品活性的破壞。研究表明，在Tg 以下長(zhǎng)時(shí)間存儲(chǔ)的人類(lèi)精子，大部分在解凍后表現(xiàn)出良好的運(yùn)動(dòng)性能［5，16，32］。細(xì)胞在低溫儲(chǔ)存過(guò)程中，傳統(tǒng)的手動(dòng)儲(chǔ)存方法常常因反復(fù)暴露于室溫而給細(xì)胞儲(chǔ)存帶來(lái)極大影響。為了解決這一問(wèn)題，Xu等［33］開(kāi)發(fā)了一個(gè)自動(dòng)化冷凍保存系統(tǒng)，在受控溫度下（-150 ℃以下）進(jìn)行細(xì)胞處理，最大程度減少環(huán)境溫度波動(dòng)對(duì)儲(chǔ)存細(xì)胞的影響。該團(tuán)隊(duì)以人類(lèi)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為研究對(duì)象，比較手動(dòng)和自動(dòng)冷凍保存方法儲(chǔ)存效果的差異，研究結(jié)果表明自動(dòng)系統(tǒng)處理比手動(dòng)處理的人類(lèi)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出更高的細(xì)胞活力、恢復(fù)率和細(xì)胞增殖能力。輸血用血小板的保質(zhì)期只有7 d，大大限制了血小板的使用。近期，Guinness 等［34］研究表明，通過(guò)在-80 ℃下進(jìn)行冷凍保存，可將其保質(zhì)期延長(zhǎng)至少1年。血小板的冷凍保存和體液儲(chǔ)存方法的安全性并無(wú)差異。這項(xiàng)研究通過(guò)可靠的數(shù)據(jù)支撐了干預(yù)方案的可行性，研究證明這種方案在術(shù)中或重癥監(jiān)護(hù)病房患者中可以應(yīng)用，從而增強(qiáng)了對(duì)該方法安全性的支持。

Zhan等［35］通過(guò)向黑腹果蠅胚胎中添加CPAs，成功使50%以上的胚胎孵化，25%以上的幼蟲(chóng)成功發(fā)育為成蟲(chóng)。在連續(xù)凍存5代和6個(gè)月后，幼蟲(chóng)仍保持正常的性別比、生育力以及原始突變。此外，Zhang 等［36］也使用CPAs 保存新鮮的人體脂肪組織，在-196 ℃液氮中保存1 個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)使用70%甘油處理的組織中甘油醛-3-磷酸酶活性最高，效果最好，組織結(jié)構(gòu)也更完整。

2.2.2冷凍速率 在冷凍過(guò)程中，采用不同的冷凍速率會(huì)對(duì)生物組織、細(xì)胞、蛋白質(zhì)和核酸的回收率產(chǎn)生不同影響?？焖倮鋬鰰r(shí)會(huì)形成多而細(xì)小的冰晶，產(chǎn)生較大的冰水界面積，冰水界面易吸附蛋白，引發(fā)蛋白質(zhì)變性。在緩慢冷凍時(shí)，小冰晶會(huì)逐漸生長(zhǎng)為大冰晶，大冰晶的機(jī)械損傷會(huì)對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞器造成破壞［37］。此外，緩慢冷凍容易導(dǎo)致溶質(zhì)分子在冰晶形成過(guò)程中逐漸濃縮，從而未凍結(jié)的溶液部分形成滲透梯度，導(dǎo)致細(xì)胞脫水并造成不可逆性傷害［12］。該現(xiàn)象被稱(chēng)為冷凍濃縮效應(yīng)，冷凍濃縮會(huì)使溶質(zhì)濃度增加，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集或沉淀，從而影響細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能［38］。因此，在不同的生物制品制備過(guò)程中，需要選取最合適的冷凍速率，以保證生物組織、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸等生物制品的最大回收率［34］。

Zhang 等［39］探討了凍融過(guò)程中肌原纖維與凍融速率之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與快速冷凍相比，緩慢冷凍會(huì)導(dǎo)致解凍損失增加28%，肌原纖維形成大冰晶并且肌原纖維的持水能力下降，表面疏水性增加，更容易出現(xiàn)蛋白變性。Cao 等［37］研究了冷凍速率對(duì)乳酸脫氫酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)在0.025 mg·mL-1濃度下，快速冷凍60 ℃·min-1比緩慢冷卻0.8 ℃·min-1更具破壞性。然而一些研究表明，雙螺旋DNA 在不同條件下的凍融對(duì)其影響并不明顯。例如，Shikama 等［40］通過(guò)對(duì)小牛胸腺脫氧核糖核酸進(jìn)行凍融，直接凍至液氮中，其構(gòu)象和活性在前后未發(fā)生變化。Fuchizaki 等［41］則采用程序冷凍法和深度冷凍法冷凍紅細(xì)胞，在4～8 周后進(jìn)行解凍和比較，發(fā)現(xiàn)程序冷凍法的回收率為85.9%，明顯高于深度冷凍法的81.1%，而且程序冷凍法得到的紅細(xì)胞抗溶血性更強(qiáng)。James等［42］通過(guò)采用快速冷卻法和在-7 ℃和-14.5 ℃的100%氘化甲醇中孵育方法，成功提高了史蒂芬按蚊的孵化率，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

2.2.3解凍速率 解凍過(guò)程中，快速解凍不僅能促進(jìn)體系整體快速融化，還能減少冰晶的重結(jié)晶，從而有效減少生物制品的活性損失。相比之下，緩慢解凍會(huì)導(dǎo)致冰晶重結(jié)晶成更大的冰晶，從而造成生物制品的機(jī)械損傷。此外，解凍過(guò)程中存在危險(xiǎn)溫度區(qū)（-15～-160 ℃），這些溫度區(qū)域會(huì)促進(jìn)小冰晶向大冰晶的轉(zhuǎn)變，并且升溫速度對(duì)胞外冰成核和生長(zhǎng)有著重要的影響。因此，在升溫過(guò)程中，抑制冰晶的形成和生長(zhǎng)對(duì)于提高低溫保存效率至關(guān)重要。

冰的再結(jié)晶是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，且與不同的增溫參數(shù)密切相關(guān)。從低溫中恢復(fù)有活力的細(xì)胞和組織需要快速解凍，以減少重結(jié)晶的發(fā)生。Farrant 等［2］研究表明，少量肌肉樣本對(duì)快速解凍具有較好的適應(yīng)性，但較大的樣本則無(wú)法達(dá)到同樣的效果，因?yàn)闃颖驹诮鈨鰰r(shí)，熱量的傳遞非常重要。此外，解凍速率對(duì)生物體物質(zhì)的活性損失也有顯著的影響。Cao 等［37］指出乳酸脫氫酶的活性會(huì)隨著解凍速率的加快而提高。不過(guò)，也有例外情況，例如在解凍過(guò)程中，分泌型免疫球蛋白A的濃度和溶菌酶活性在25 ℃緩慢解凍時(shí)，活性顯著高于快速解凍的水平［43］。近年來(lái)，一些研究者嘗試將細(xì)胞冷凍成薄片的形式，以減少在解凍過(guò)程中冰重結(jié)晶對(duì)細(xì)胞的傷害，進(jìn)而提高細(xì)胞的生存率。此外，有研究者嘗試運(yùn)用磁場(chǎng)、激光場(chǎng)、電場(chǎng)、聲場(chǎng)等手段來(lái)促進(jìn)細(xì)胞和組織快速均勻傳熱解凍，有效減少了冰晶對(duì)細(xì)胞和組織的危害，從而顯著提高了細(xì)胞的存活率［24］。

冷凍和解凍程序是多種細(xì)胞療法中的最后步驟之一［44］，無(wú)論是造血和非造血產(chǎn)品（如間充質(zhì)干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞），優(yōu)化冷凍解凍程序和保護(hù)劑配比，都可以實(shí)現(xiàn)最佳的活力和有效的細(xì)胞劑量，為提高細(xì)胞治療在臨床使用中的安全性和有效性提供關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)，使得細(xì)胞治療成為經(jīng)濟(jì)上可行和可持續(xù)的藥物。此外，低溫保存技術(shù)也成為紅細(xì)胞罕見(jiàn)血型患者長(zhǎng)期儲(chǔ)存的有效方法。然而，冷凍/解凍過(guò)程中冷凍紅細(xì)胞有時(shí)在解凍后會(huì)引起嚴(yán)重的溶血。Fuchizaki 等［41］采用程序冷凍法和深度冷凍法冷凍紅細(xì)胞，得到了高達(dá)85%的細(xì)胞回收率。

2.3 其他因素

2.3.1氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激可導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子的破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死［45］。為了維持細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)平衡，精子低溫保存中通常需要添加抗氧化劑。在-196 ℃下儲(chǔ)存的精子解凍后存活率明顯高于-80 ℃下儲(chǔ)存的精子，這是因?yàn)樵?140 ℃以上的純水中仍有液態(tài)水存在，且液態(tài)水已被證明可支持細(xì)胞代謝并產(chǎn)生活性氧，從而加劇氧化應(yīng)激損傷［46］。Reda 等［20］在保存水牛精液過(guò)程中分別添加半胱氨酸50 和100 μmol·L-1，發(fā)現(xiàn)精子解凍后的活力和正常度明顯提高。研究表明，胱氨酸的加入顯著提高了細(xì)胞膜的完整性，提高了體系在低溫儲(chǔ)存過(guò)程中的抗氧化能力，從而進(jìn)一步提高了精子活性。

2.3.2緩沖液 冷凍過(guò)程中緩沖液的pH、鹽濃度是緩沖液對(duì)細(xì)胞的主要影響因素。pH 的升高可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解。而鹽濃度的增加則可能影響敏感細(xì)胞的存活率，并導(dǎo)致生物大分子回收率降低［2］。Thorat 等［19］采用微流成像（micro flow imaging， MFI）技術(shù)研究牛血清白蛋白和β-半乳糖苷酶在磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行凍融循環(huán)過(guò)程的聚集行為，并測(cè)量了溶液從20 ℃降至-25 ℃過(guò)程中pH 的變化。該研究發(fā)現(xiàn)在緩沖液濃度為100 mmol·L-1時(shí)，冷卻導(dǎo)致BSA和β-gal 緩沖液的pH 分別降低了3.1 和2.7 個(gè)pH單位，這是由于磷酸氫二鈉的結(jié)晶引起的。

2.3.3生物分子濃度 在理想的冷凍保護(hù)曲線中，保護(hù)劑和目的蛋白的濃度比例會(huì)影響凍融后的產(chǎn)品質(zhì)量。研究表明，采用蔗糖作為CPAs對(duì)治療性單克隆抗體的凍融具有積極作用。對(duì)于高濃度單克隆抗體蛋白（30 mg·mL-1和40 mg·mL-1），蔗糖能夠有效阻礙顆粒形成；然而在低濃度單克隆抗體蛋白的制劑中，蔗糖反而會(huì)誘導(dǎo)顆粒形成。此外，蔗糖只有在高于10 mg·mL-1蛋白濃度下才能發(fā)揮單克隆抗體的保護(hù)作用［16］。

3 展望

低溫保存技術(shù)是保證生物制品長(zhǎng)期儲(chǔ)存不可或缺的重要工具，而在新型程序化低溫保存技術(shù)的基礎(chǔ)上，新的生物制品需要同樣先進(jìn)的CPAs來(lái)保護(hù)寶貴的生物樣本。未來(lái)，智能化的低溫保存設(shè)備和管理系統(tǒng)將通過(guò)數(shù)據(jù)分析和可視化，實(shí)現(xiàn)對(duì)低溫保存條件的監(jiān)控和調(diào)節(jié)，利用新技術(shù)優(yōu)化生物制品低溫保存的環(huán)境，提高低溫保存效率和質(zhì)量。同時(shí)，生物制品的冷凍最佳工藝的探索將成為今后低溫保存技術(shù)的重要趨勢(shì)。

在這個(gè)背景下，新型低溫保護(hù)劑如復(fù)合CPAs、抗凍蛋白、聚合物以及氧化石墨烯等將會(huì)推動(dòng)生物制品的低溫保存技術(shù)向更高級(jí)別的方向發(fā)展，為生物制品的低溫保存提供更加有效的保存條件。同時(shí)，繼續(xù)探索新型低溫保護(hù)劑向無(wú)毒、低用量、高保護(hù)效能的方向發(fā)展仍將是未來(lái)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。隨著新技術(shù)和新材料的不斷涌現(xiàn)，低溫保存技術(shù)將不斷地發(fā)展和完善，為生物制品的保護(hù)和應(yīng)用提供更加可靠和高效的支持。