方靖靖 ， 黃昆侖，2，3 ， 仝濤，2，3

1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，精準(zhǔn)營養(yǎng)與食品質(zhì)量重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；教育部功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；

2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；

3.食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083

孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是一組以社交溝通缺陷、語言溝通障礙和刻板行為為特征的異質(zhì)性神經(jīng)發(fā)育障礙。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的最新報(bào)告表明，大約每100 名兒童中就有1 人患有ASD，且男性的患病率高于女性［1］。現(xiàn)有的科學(xué)證據(jù)表明，環(huán)境、遺傳因素均能使兒童更容易罹患ASD。近年來，ASD患病率不斷上升，不僅嚴(yán)重影響患者及其家庭的正常生活，還給社會帶來巨大負(fù)擔(dān)。盡管早期行為和教育干預(yù)可以在一定程度上改善ASD 患者的表觀癥狀，但目前ASD 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，針對ASD 核心癥狀的有效治療手段仍然非常有限。因此，迫切需要深入探究ASD 的病因及病理生理過程，以期為開發(fā)ASD的臨床診療措施提供理論依據(jù)。

在過去的十年中，ASD的診斷體系不斷發(fā)展，目前ASD 的診斷主要依賴于臨床觀察和行為特征?！毒裾系K診斷與統(tǒng)計(jì)手冊（第五版）》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，5th Edition，DSM5）定義了ASD 診斷標(biāo)準(zhǔn)的2 個(gè)核心領(lǐng)域，包括在多種情境下持續(xù)的社會溝通和社會互動(dòng)障礙以及限制性、重復(fù)的行為、興趣或活動(dòng)模式。這些癥狀自患者幼兒期開始出現(xiàn)，并在當(dāng)前的社會、職業(yè)或其他重要功能領(lǐng)域造成有臨床意義的損害。此外，DSM5 定義的這些障礙與智力障礙或全面發(fā)育遲緩無關(guān)［2］。

目前對ASD的研究主要依賴于動(dòng)物模型和細(xì)胞模型。成功可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪茄芯緼SD的基石。截至目前，國內(nèi)外各實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建的ASD細(xì)胞模型包括PC12細(xì)胞、SH-SY5Y細(xì)胞、人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、淋巴母細(xì)胞系和原代神經(jīng)元等。成功構(gòu)建的ASD 動(dòng)物模型包括非哺乳動(dòng)物模型、產(chǎn)前丙戊酸（valproic acid，VPA）暴露模型、BTBR 特發(fā)性小鼠模型、母體免疫激活（maternal immune activation，MIA）模型、基于ASD 易感基因構(gòu)建的嚙齒類動(dòng)物模型和非人靈長類動(dòng)物模型等。文章重點(diǎn)介紹了上述細(xì)胞模型和動(dòng)物模型的特點(diǎn)和構(gòu)建方法，并總結(jié)了各模型的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為ASD 相關(guān)研究提供線索和基礎(chǔ)。

1 細(xì)胞模型

近年來，細(xì)胞模型越來越多地應(yīng)用于ASD 的基礎(chǔ)研究中。PC12 細(xì)胞、SH-SY5Y 細(xì)胞、hiPSCs、LCLs 和原代神經(jīng)元等是目前ASD 研究中常用的細(xì)胞模型。ASD細(xì)胞模型的建立和應(yīng)用可以彌補(bǔ)動(dòng)物模型造模周期長、干擾因素多等局限，對ASD候選藥物的研發(fā)和篩選具有重要意義。

1.1 PC12細(xì)胞

PC12細(xì)胞為單克隆細(xì)胞系，由Greene和Tisehler 從可移植大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤中提取［3］。PC12細(xì)胞是研究神經(jīng)發(fā)育的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞模型，常用于ASD、帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)研究中。

在ASD研究中，可以利用PC12細(xì)胞探索ASD易感基因的功能，包括神經(jīng)連接蛋白-3（neuroligin-3，NLGN-3）、人第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（human phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN）、Rab3 相互作用分子3 等基因。例如，He 等［4］報(bào)道了PTEN與PC12 細(xì)胞的多巴胺功能障礙和異常行為相關(guān)。PTEN在ASD 的發(fā)展過程中可能通過抑制PI3K/CREB 通路降低酪氨酸羥化酶的表達(dá)水平，為ASD 的治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)。此外，PC12 細(xì)胞還被用于探索相關(guān)環(huán)境因素誘發(fā)ASD 的分子機(jī)制。孕期暴露于丙戊酸（valproic acid，VPA）、沙利度胺和酒精是ASD 的環(huán)境誘發(fā)因素，這些致畸物可能通過改變基因表達(dá)從而干擾大腦發(fā)育。Rout 等［5］研究了這3 種化合物對PC12 細(xì)胞模型中50 種不同轉(zhuǎn)錄因子的影響，研究結(jié)果表明GATA 結(jié)合蛋白3 基因表達(dá)的改變可能與ASD的發(fā)生有關(guān)。

然而，PC12 細(xì)胞也有其局限性。例如，在使用PC12 細(xì)胞研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物作用機(jī)制時(shí)，應(yīng)考慮到PC12細(xì)胞是一種腫瘤細(xì)胞，其形態(tài)和特征在多次傳代后會發(fā)生變化。

1.2 SH-SY5Y細(xì)胞

SH-SY5Y 細(xì)胞來源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，具有神經(jīng)元樣形態(tài)和生理特性。此外，SHSY5Y細(xì)胞可以分化為皮質(zhì)樣神經(jīng)元，是研究神經(jīng)發(fā)育過程中神經(jīng)表型和神經(jīng)退行性疾病的良好細(xì)胞模型。

在ASD 的相關(guān)研究中，常利用SH-SY5Y 細(xì)胞探索ASD 易感基因的功能，篩選新的ASD 易感基因。例如，據(jù)Unsicker 等［6］報(bào)道，SHANK2中一個(gè)或兩個(gè)等位基因的移碼突變可導(dǎo)致SH-SY5Y 細(xì)胞中神經(jīng)元分化的改變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞生長和突觸前/突觸后蛋白表達(dá)的變化。SHANK2突變還影響細(xì)胞酪氨酸激酶受體下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和淀粉樣前體的表達(dá)。此外，有研究者利用SH-SY5Y 細(xì)胞探索ASD 發(fā)病的分子機(jī)制。Kalkan 等［7］發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α 可通過激活Caspase-3 凋亡級聯(lián)誘導(dǎo)神經(jīng)變性。對SH-SY5Y 細(xì)胞中甲基化區(qū)域的分析表明，SH-SY5Y 細(xì)胞中高度甲基化區(qū)域的基因顯著富集于鈣離子信號、突觸傳遞和神經(jīng)元分化以及ASD 候選基因，提示基因甲基化可能是ASD的病因之一［8］。

SH-SY5Y 細(xì)胞模型也存在一定的局限性。例如，與hiPSCs 等其他細(xì)胞模型相比，SH-SY5Y細(xì)胞不能用于觀察神經(jīng)發(fā)育過程。與原代神經(jīng)元相比，未分化的SH-SY5Y 細(xì)胞對神經(jīng)毒素和神經(jīng)保護(hù)藥物的敏感性較低。

1.3 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cells， HiPSCs）是一種類似于胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞類型，由日本科學(xué)家Takahashi 等［9］通過在分化的體細(xì)胞中引入Oct-4、Sox-2、Klf4 和c-Myc 4 種轉(zhuǎn)錄因子來重編程體細(xì)胞而獲得。近年來，HiPSCs 的發(fā)展為單基因突變或特發(fā)性突變ASD 患者的神經(jīng)發(fā)育或精神疾病建模，以及開發(fā)針對特定ASD患者的個(gè)體化醫(yī)療提供了全新的機(jī)會。

HiPSCs 常用于探索ASD 易感基因的功能及相關(guān)基因突變誘發(fā)ASD 的分子機(jī)制。許多ASD患者存在唐氏綜合征細(xì)胞黏附分子（down syndrome cell adhesion molecules，DSCAM）基因突變，Lim 等［10］利用來自ASD 患者的HiPSCs 細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，DSCAM 突變可能通過損害NMDA 受體功能導(dǎo)致ASD 的相關(guān)表型。此外，HiPSCs 還可用于開發(fā)ASD 的潛在治療方法。例如，Marchetto 等［11］發(fā)現(xiàn)來自ASD患者的HiPSCs細(xì)胞增殖增加，表現(xiàn)出異常的神經(jīng)發(fā)生和突觸功能，而胰島素生長因子1處理可以改善這些神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)缺陷。Chiola 等［12］提出HiPSCs 本身也可以作為修復(fù)ASD 患者受損腦回路的工具。Jong等［13］利用來自接觸蛋白關(guān)聯(lián)蛋白樣蛋白2（contactin associated protein-like 2，CNTNAP2）突變的ASD 患者的HiPSCs 產(chǎn)生了前腦類器官，并研究了CNTNAP2突變對胚胎皮質(zhì)發(fā)育的影響。上述結(jié)果提示，HiPSCs 和腦類器官技術(shù)的發(fā)展為研究ASD 的潛在機(jī)制和探索治療途徑提供了新思路。

HiPSCs 也存在一定的局限性，如不能觀察到典型的病理表型。此外，在HiPSCs 制備中使用的核心轉(zhuǎn)錄因子之一c-Myc 已被證明是一種癌基因，可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生癌變，應(yīng)用HiPSCs 進(jìn)行ASD相關(guān)研究時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格控制其致瘤風(fēng)險(xiǎn)。

1.4 淋巴母細(xì)胞系

淋巴母細(xì)胞系（lymphoblastic cell lines， LCLs）亞群分析是檢測細(xì)胞免疫和體液免疫的重要指標(biāo)，可總體反映機(jī)體當(dāng)前的免疫功能和狀態(tài)。此外，LCLs 還可輔助診斷神經(jīng)系統(tǒng)疾病，對研究ASD發(fā)病機(jī)制和觀察藥物療效具有重要意義。

已有多項(xiàng)研究利用LCLs 探討了ASD 的相關(guān)分子機(jī)制，并為ASD 的藥物開發(fā)提供了新的研究工具。Nayan 等［14］利用LCLs 發(fā)現(xiàn)ASD 患者來源的LCLs超氧化物歧化酶活性較低，丙二醛和細(xì)胞內(nèi)DNA 損傷水平較高，而無刺蜂蜜處理可以扭轉(zhuǎn)這一變化。丁酸可顯著改善ASD 患者來源的LCLs 線粒體功能障礙，還可激活免疫系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)，改善ASD疾病狀態(tài)的能量代謝［15］。

盡管LCLs 是細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)的主要研究材料，但也存在一些局限性。例如，LCLs在采集后難以保存，不能傳代培養(yǎng)，患者的LCLs樣本往往需要反復(fù)采集。

1.5 原代神經(jīng)元

原代神經(jīng)元體外培養(yǎng)時(shí)間短，其遺傳性狀與體內(nèi)細(xì)胞相似，適用于神經(jīng)元形態(tài)、功能及分化的相關(guān)研究。與多次傳代的細(xì)胞相比，原代神經(jīng)元更接近于神經(jīng)元在體內(nèi)的正常發(fā)育狀態(tài)，具有簡便、快速、條件易控制、藥理靶點(diǎn)明確、干擾因素少、結(jié)果易觀察等優(yōu)點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)VPA 預(yù)處理原代神經(jīng)元后，Wnt/β-catenin 信號通路中關(guān)鍵信號分子β-catenin 和磷酸化糖原合成酶激酶3 的表達(dá)增加，提示VPA處理激活原代神經(jīng)元中Wnt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。VPA干預(yù)的原代神經(jīng)元可以很好地模擬ASD 患者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的異常狀態(tài)。VPA 還可抑制原代細(xì)胞樹突和軸突的生長，從而影響神經(jīng)元的發(fā)育和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的成熟［16］。此外，NLGN 表達(dá)異常與ASD的發(fā)生有關(guān)，使用原代神經(jīng)元進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，NLGN并不影響突觸數(shù)量，而是影響突觸的抑制和興奮功能，從而導(dǎo)致社交障礙等ASD相關(guān)的行為異常［17］。

原代神經(jīng)元還存在不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境等缺點(diǎn)，限制了原代神經(jīng)元在神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)研究中更廣泛的應(yīng)用。表1總結(jié)了各種細(xì)胞模型在ASD研究中的應(yīng)用及優(yōu)缺點(diǎn)。

2 非哺乳動(dòng)物模型

非哺乳動(dòng)物模式生物如果蠅、秀麗隱桿線蟲、斑馬魚等也被用于ASD 的相關(guān)研究中。非哺乳動(dòng)物模型不僅具有高通量、短壽命、短生殖周期、加速代際研究等與細(xì)胞模型相似的優(yōu)勢，而且具有較高的基因保守性，可用于ASD 相關(guān)的病理特征探索以及社會行為變化觀察。此外，這些非哺乳動(dòng)物模型還被用于ASD 候選基因、環(huán)境因素及候選藥物的高通量分析和快速篩選。但非哺乳動(dòng)物模型在生理、解剖和行為特征等方面與人類差異均較大。

2.1 果蠅

果蠅具有繁殖周期短、產(chǎn)量高、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。此外，果蠅基因組相對簡單和保守。因此，果蠅可廣泛用于包括ASD 在內(nèi)的精神疾病的分子機(jī)制研究。

果蠅脆性X 智力低下1（fragile X mental retardation 1，F(xiàn)MR1）基因與人類該基因同源性達(dá)35%，相似性達(dá)56%。Kanellopoulos 等［18］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1的缺失增加了突觸代謝型谷氨酸受體的表達(dá)，降低了環(huán)磷酸腺苷的表達(dá)，導(dǎo)致果蠅的學(xué)習(xí)記憶缺陷。利用果蠅構(gòu)建雙酚A誘導(dǎo)的ASD 模型，表現(xiàn)出類似ASD 的行為特征，如重復(fù)行為和異常的社會行為［19］。這些研究結(jié)果證實(shí)了果蠅作為研究ASD 動(dòng)物模型的可行性，為探索相關(guān)易感基因和環(huán)境因素誘發(fā)ASD 的分子機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)。

2.2 秀麗隱桿線蟲

秀麗隱桿線蟲具有保守、簡單的神經(jīng)元通路，為篩選ASD 易感基因和探索相關(guān)分子機(jī)制提供了強(qiáng)有力的工具。Helena 等［20］利用SFARI Gene數(shù)據(jù)庫（http：//gene-archive.sfari.org，version3.0）鑒定了秀麗隱線蟲中人類ASD 相關(guān)易感基因的同源基因，并篩選出在社會行為中起作用的新的候選基因，這些基因突出了突觸在ASD 中的重要貢獻(xiàn)，主要涉及細(xì)胞信號傳導(dǎo)、表觀遺傳學(xué)和磷脂代謝等功能。Troy 等［21］利用秀麗隱桿線蟲表征了ASD 相關(guān)基因的功能，并量化了135 個(gè)突變的26種表型，涵蓋形態(tài)、運(yùn)動(dòng)、觸覺敏感性和學(xué)習(xí)習(xí)慣。還有研究利用秀麗隱桿線蟲發(fā)現(xiàn)了以CHD8·CHD7和NLGN-3·NLGN-1為中心的感覺反應(yīng)和學(xué)習(xí)的基本網(wǎng)絡(luò)，并發(fā)現(xiàn)NLGN-1的R433C錯(cuò)義突變可導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲的社會功能障礙，NLGN-1的重新表達(dá)可以恢復(fù)NLGN-1突變秀麗隱桿線蟲的感覺和學(xué)習(xí)障礙［22］。此外，一些研究利用秀麗隱桿線蟲探索治療ASD 的候選藥物。例如，Kathrin 等［23］通過秀麗隱桿線蟲篩選出具有ASD 相關(guān)運(yùn)動(dòng)缺陷表型的突變體，并對超過3 900種化合物進(jìn)行了全面的藥物篩選。

2.3 斑馬魚

斑馬魚作為新興模型，具有繁殖快、交配行為受光控制、產(chǎn)卵多、體外受精、早期胚胎整體透明、易于使用藥物等優(yōu)點(diǎn)。在行為學(xué)方面，斑馬魚模型表現(xiàn)出相對簡單和定義明確的感覺運(yùn)動(dòng)行為。此外，斑馬魚具有同質(zhì)性偏好和群落聚集的特征，可用于社會行為研究。近年來，斑馬魚因其較高的遺傳操作效率和顯著的行為表型，成為研究ASD極具吸引力的模式生物。

目前，一些研究利用斑馬魚模型探索VPA 等環(huán)境因素引發(fā)ASD樣行為的分子機(jī)制。例如，VPA處理的斑馬魚表現(xiàn)出類似ASD的癥狀，如細(xì)胞增殖降低、顏色偏好降低、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）神經(jīng)元分化受損［24］。在斑馬魚中對神經(jīng)分子機(jī)制的研究為未來ASD的靶向治療提供了重要線索。此外，還有研究利用斑馬魚探索了ASD易感基因?qū)ι窠?jīng)發(fā)育和自主行為的影響。Gauthier等［25］發(fā)現(xiàn)下調(diào)SHANK3同源基因的表達(dá)可以降低斑馬魚的頭圍和游泳時(shí)對觸摸的反應(yīng)能力。

2.4 鳴禽類

除上述ASD 動(dòng)物模型外，斑胸草雀等鳴禽動(dòng)物模型也可用于ASD 的相關(guān)研究。斑胸草雀具有良好的發(fā)聲學(xué)習(xí)能力，可用于模擬語言交流障礙，研究ASD 易感基因和語言相關(guān)基因在鳴禽學(xué)習(xí)發(fā)聲環(huán)路中的作用。例如，在鳴禽類ASD 動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)CNTNAP2與ASD 相關(guān)，并廣泛存在于人類語言相關(guān)的神經(jīng)環(huán)路中［26］。

非哺乳動(dòng)物模型在生理、解剖和行為特征等方面與人類差異均較大，表2 總結(jié)了該類模型在ASD研究中的應(yīng)用以及優(yōu)缺點(diǎn)。

表2 非哺乳動(dòng)物模型在ASD研究中的應(yīng)用以及優(yōu)缺點(diǎn)Table 2 The application, advantages, and disadvantages of non-mammalian models in ASD study

3 嚙齒類動(dòng)物模型

嚙齒類動(dòng)物的基因與人類具有高度同源性，針對已知的ASD 風(fēng)險(xiǎn)基因和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素，目前已經(jīng)建立了多種嚙齒類動(dòng)物模型。嚙齒類動(dòng)物模型成本低、妊娠期短、產(chǎn)仔數(shù)高，研究嚙齒類動(dòng)物模型的行為和生理特性的方法也相對詳盡。此外，嚙齒類動(dòng)物的基因操作工具豐富，單基因嚙齒類動(dòng)物模型可以用來解釋特定基因的功能，但并不能代表大多數(shù)人類的ASD 疾病。然而，嚙齒類動(dòng)物和人類在許多方面存在著較大差異，如大腦解剖和行為特征。這些差異使得嚙齒類動(dòng)物模型在ASD 研究中的轉(zhuǎn)化價(jià)值成為一個(gè)有爭議的問題。小鼠和大鼠都被廣泛用于構(gòu)建與ASD 相關(guān)的嚙齒動(dòng)物模型，而大鼠具有更廣泛的社會行為和更復(fù)雜的聲學(xué)交流系統(tǒng)，其中特定的超聲發(fā)聲（ultrasound vocalization，USV）是其情境依賴性情緒信號，具有重要的交流功能。常用的ASD 嚙齒類動(dòng)物模型包括產(chǎn)前VPA 暴露模型、BTBR 特發(fā)性小鼠模型、MIA 模型以及基于ASD 易感基因構(gòu)建的嚙齒類動(dòng)物模型等（表3）。

表3 常用的嚙齒類動(dòng)物模型在ASD研究中的應(yīng)用以及優(yōu)缺點(diǎn)Table 3 The application, advantages and disadvantages of commonly used rodent models in ASD study

3.1 產(chǎn)前丙戊酸暴露模型

VPA 在臨床上被用作抗癲癇藥或情緒穩(wěn)定劑，可以治療癲癇、雙相情感障礙和神經(jīng)病理性疼痛。Bromley 等［27］報(bào)道了孕期VPA 暴露會增加子代患ASD 的風(fēng)險(xiǎn)。此外，研究發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)前VPA 暴露史的兒童神經(jīng)發(fā)育障礙疾病的患病率增加了6～10 倍，其中ASD 是產(chǎn)前VPA 暴露兒童在6 歲時(shí)最常見的神經(jīng)發(fā)育障礙［28］表征。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)前暴露于VPA 的大鼠或小鼠是研究ASD 的經(jīng)典動(dòng)物模型，被廣泛用于探索ASD的潛在治療藥物相關(guān)研究中。例如，母鼠在妊娠11.5～13.5 d 皮下或腹腔注射400～600 mg·kg-1VPA，會普遍導(dǎo)致子代小鼠超聲發(fā)聲頻率降低，持續(xù)時(shí)間縮短。在社會交往實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)前暴露VPA仔鼠的社會能力普遍受損，但當(dāng)VPA 劑量低于350 mg·kg-1時(shí)，仔鼠的社會損害表型不明顯。在社會偏好實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)前暴露VPA 子代的社會偏好普遍降低。在重復(fù)行為檢測方面，雌性小鼠在妊娠11.5～13.5 d 腹腔或皮下注射400～600 mg·kg-1VPA 所產(chǎn)生的子代小鼠在曠場實(shí)驗(yàn)和理毛實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出理毛、挖掘等重復(fù)行為增加的總體趨勢。在埋珠實(shí)驗(yàn)中，母鼠妊娠第10～13 d 暴露于300～600 mg·kg-1VPA 可增加子代小鼠的埋珠數(shù)量。在探索行為方面，大多數(shù)研究顯示產(chǎn)前暴露VPA 子代的探索行為減少。對于產(chǎn)前暴露VPA子代在曠場實(shí)驗(yàn)中活動(dòng)是否減少也存在爭議。在一些研究中，產(chǎn)前暴露VPA 的后代小鼠表現(xiàn)出高活躍性，而在其他研究中，產(chǎn)前暴露VPA 的后代小鼠表現(xiàn)出活動(dòng)量減少［29］。此外，VPA 暴露大鼠模型也可用于ASD 候選藥物的篩選。Juybari等［30］研究表明，VPA 暴露（妊娠第12.5 d，腹腔注射600 mg·kg-1）會誘導(dǎo)雄性子代大鼠產(chǎn)生ASD 樣行為，增加痛閾，而白藜蘆醇可以部分改善這些行為缺陷。

在分子機(jī)制方面，研究者對VPA 在胚胎發(fā)育早期誘發(fā)ASD 的分子機(jī)制進(jìn)行了初步探究，發(fā)現(xiàn)VPA 暴露通過調(diào)節(jié)一些信號通路，如組蛋白高乙?；?、Wnt 信號通路、ERK-p21 通路和腦內(nèi)γ-氨基丁酸水平，從而影響大腦發(fā)育和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)成熟，最終導(dǎo)致后代出現(xiàn)ASD 樣行為表型。VPA 嚙齒類動(dòng)物模型除了與ASD 患者在行為學(xué)和解剖學(xué)上具有一定的相似性外，還表現(xiàn)出與ASD 患者相似的腸道菌群失調(diào)，這使得VPA 嚙齒類動(dòng)物模型成為研究ASD的最佳模型之一［31］。

妊娠期注射高劑量VPA（400～600 mg·kg-1）可誘導(dǎo)子代小鼠或大鼠出現(xiàn)社交和認(rèn)知障礙，重復(fù)性行為增加等ASD 核心癥狀。然而，高劑量VPA可能導(dǎo)致小鼠產(chǎn)前死亡或子代數(shù)量減少。已有研究發(fā)現(xiàn)，低、中劑量VPA 暴露也被用于構(gòu)建ASD的嚙齒動(dòng)物模型。例如，Wei 等［32］報(bào)道在妊娠第17 d單次皮下注射100或200 mg·kg-1VPA 會導(dǎo)致小鼠的新物體識別能力受損和恐懼條件反射行為異常。因此，產(chǎn)前低或中等劑量的VPA 暴露可能與高劑量VPA 暴露誘發(fā)不同的行為改變。此外，鼠齡也會影響VPA 的造模效果，例如，Chaliha等［29］報(bào)道，與VPA 暴露的年輕嚙齒動(dòng)物相比，老年嚙齒動(dòng)物暴露于VPA 表現(xiàn)出更少的社交和探索行為。因此，建議研究者在進(jìn)行行為學(xué)測試時(shí)應(yīng)確保受試動(dòng)物處于幼年年齡范圍內(nèi)，并同時(shí)使用雄性和雌性動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以反映實(shí)驗(yàn)因素對ASD患者兩性的影響。

3.2 BTBR特發(fā)性小鼠模型

BTBR T+/tpr3tf/J（BTBR）小鼠品系來源于攜帶Discldel、T+、Itpr3tf和Cox7a2ll4種基因突變的近交系小鼠，BTBR 小鼠最初由哥倫比亞大學(xué)的Dunn 將攜帶短尾基因的小鼠與攜帶簇狀基因突變的小鼠雜交，使其連續(xù)近交獲得［33］。BTBR 小鼠的異常行為主要由編碼犬尿氨酸3-單加氧酶的Kmo基因的3 個(gè)單核苷酸多態(tài)性引起。BTBR 小鼠能夠很好地模擬臨床ASD 患者的核心癥狀，因此被廣泛用于ASD 的病理機(jī)制和篩選候選藥物的相關(guān)研究中。

BTBR 小鼠是目前公認(rèn)的特發(fā)性ASD 動(dòng)物模型，其核心癥狀與ASD 患者的臨床癥狀最為相似，并可穩(wěn)定地遺傳給后代。BTBR 小鼠在三箱社交能力實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯的社交動(dòng)機(jī)和社交能力缺乏等社交功能障礙。在直接社會互動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，BTBR 小鼠嗅探、跟隨等探索性社會行為明顯減少。在USV 測試中，當(dāng)BTBR 小鼠離開母鼠的籠子時(shí)，BTBR 小鼠發(fā)出異常高頻、高振幅的超聲波。研究人員認(rèn)為這種行為類似于ASD 兒童在被迫與母親分離時(shí)的大聲哭泣。相比之下，成年BTBR 小鼠面對陌生小鼠的氣味時(shí)，發(fā)出的超聲波數(shù)量減少，這與人類ASD 患者的語言溝通障礙相似。此外，研究還表明，BTBR 小鼠的重復(fù)行為增加，如獨(dú)居、挖掘、理毛和埋珠等［34］。

BTBR 小鼠的解剖特征也與ASD 患者存在一定一致性。例如，在BTBR 小鼠中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的器質(zhì)性病變主要集中在皮質(zhì)、胼胝體和海馬發(fā)育不良方面，最顯著的神經(jīng)解剖學(xué)特征是胼胝體100%丟失和海馬關(guān)聯(lián)嚴(yán)重減少，這些特征與ASD患者的臨床表現(xiàn)相似［33］。截至目前，研究發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致BTBR 小鼠ASD 相關(guān)行為的分子機(jī)制主要包括大腦膠質(zhì)細(xì)胞突觸投射異常、興奮/抑制失衡、多種神經(jīng)遞質(zhì)失衡如單胺能遞質(zhì)（5-HT 和多巴胺）失衡和膽堿能遞質(zhì)傳遞系統(tǒng)失衡、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)發(fā)生障礙或異常、細(xì)胞內(nèi)信號選擇性中斷等［35］。

3.3 母體免疫激活模型

母體免疫激活（maternal immune activation，MIA）模型的研究來源于對ASD 致病因素的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，母親孕期尤其是前3 個(gè)月的感染與子代患ASD 的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將妊娠雌性小鼠或大鼠暴露于聚肌胞苷酸（polyinosinic-polycytidylic acid，Poly I：C）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、模擬病毒、細(xì)菌等環(huán)境中可以成功構(gòu)建MIA 模型，這些因素通過誘導(dǎo)母體免疫反應(yīng)來激活免疫系統(tǒng)，其中孕期母體暴露于Poly I：C是最常用的MIA模型。

Poly I：C 是一種人工合成的干擾素誘導(dǎo)劑，具有類似于病毒的雙鏈RNA 結(jié)構(gòu)，用于模擬人類病毒感染。在雌鼠妊娠第10.5、12.5、14.5 d 注射5 mg·kg-1Poly I： C 可成功建立MIA 小鼠模型，子代小鼠會出現(xiàn)ASD 的核心癥狀［36］。在USV 測試中，MIA 子代小鼠在面對不同社會刺激時(shí)超聲發(fā)聲頻率降低，提示MIA 子代小鼠存在語言交流障礙。在三室社交能力測試中，MIA 子代小鼠的社會偏好顯著降低，提示MIA 子代小鼠存在社會交往障礙。在埋珠和理毛實(shí)驗(yàn)中，MIA 子代小鼠的重復(fù)刻板行為增加。這些結(jié)果表明，Poly I：C 免疫激活模型的子代小鼠表現(xiàn)出與ASD 患者非常相似的行為學(xué)特征，如社會交往障礙、理毛、重復(fù)筑巢和刻板行為等。此外，在妊娠第12.5 d 注射20 mg·kg-1Poly I：C 也可以成功構(gòu)建ASD 小鼠模型，子代小鼠出現(xiàn)胃腸道屏障缺陷、腸道菌群紊亂和血清代謝物變化等現(xiàn)象，口服脆弱擬桿菌可改善MIA 小鼠的腸道通透性和腸道微生物組成，同時(shí)可以改善言語溝通、刻板印象、焦慮和感覺運(yùn)動(dòng)行為等缺陷［37］。但由于母體的免疫反應(yīng)不同和MIA 子代行為差異，嚙齒動(dòng)物MIA 模型構(gòu)建中的注射劑量、注射時(shí)間和注射次數(shù)均不一致，因此目前尚無統(tǒng)一的Poly I： C誘導(dǎo)MIA模型構(gòu)建方法。

LPS誘導(dǎo)的MIA 模型也是相對常見的ASD 動(dòng)物模型。Kirsten 等［38］在妊娠第9.5 d 通過向母鼠腹腔注射100 μg·mg-1LPS 構(gòu)建ASD 模型，子代表現(xiàn)出語言交流障礙、學(xué)習(xí)記憶能力下降、重復(fù)刻板行為增加等行為特征，但子代的社交能力未受影響。此外，用LPS 構(gòu)建的ASD 模型大鼠紋狀體中多巴胺、5-HT及其代謝物也有所減少［39］。

3.4 基于ASD易感基因構(gòu)建的嚙齒動(dòng)物模型

隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，研究人員通過基因測序技術(shù)篩選了大量ASD 相關(guān)易感基因。與此同時(shí)，Cre-lox、歸巢核酸內(nèi)切酶、鋅指核酸內(nèi)切酶、轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶、CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，使遺傳動(dòng)物模型近年來廣泛應(yīng)用于ASD 的研究中。通過在嚙齒類動(dòng)物中突變ASD 相關(guān)易感基因，構(gòu)建了多種ASD遺傳動(dòng)物模型。目前，用于構(gòu)建ASD 嚙齒動(dòng)物模型的常見ASD 易感基因（表4）主要包括NLGN基因家族、NRXN基因家族、SHANK基因家族、甲基化CpG 結(jié)合蛋白2（methyl-CpG binding protein 2，MECP2）、FMR1、結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物1/2（tuberous sclerosis complex 1/2，TSC1/2）、PTEN和泛素蛋白E3連接酶A（ubiquitin-protein ligase E3A，UBE3A）等。

3.4.1NLGN基因家族NLGN家族是一類存在于突觸后膜的細(xì)胞黏附分子，由5 個(gè)家族成員（NLGN-1、NLGN-2、NLGN-3、NLGN-4X、NLGN-4Y）組成，這些細(xì)胞黏附分子是介導(dǎo)突觸發(fā)育和成熟的關(guān)鍵蛋白。此外，它們還可以調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸和谷氨酸能突觸，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮/抑制平衡，大量研究表明NLGN與ASD 等神經(jīng)發(fā)育疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

不同的NLGN基因在神經(jīng)元發(fā)育過程中可能發(fā)揮不同的功能，NLGN-1在突觸形成和突觸可塑性的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，并能影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的社交和記憶能力。NLGN-1基因敲除小鼠表現(xiàn)出理毛行為顯著增加，空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷，這與海馬長時(shí)程增強(qiáng)受損相似［40］。NLGN-2存在于抑制性突觸中，NLGN-2基因敲除小鼠表現(xiàn)出探索活動(dòng)減少，超聲發(fā)聲減少且時(shí)間短等異常行為，但同時(shí)NLGN-2敲除小鼠表現(xiàn)出正常的社會行為，并未檢測到刻板或重復(fù)行為增加的行為學(xué)特征［41］。NLGN-3是一種編碼突觸后蛋白的基因，對突觸的成熟和傳遞具有重要作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)NLGN-3是誘導(dǎo)或促進(jìn)ASD 發(fā)生的基因之一，NLGN-3R451C 基因敲入小鼠的社交能力受損，空間學(xué)習(xí)能力增強(qiáng)，這些行為改變伴隨著抑制性突觸傳遞的增加，而興奮性突觸沒有明顯變化［42］。人類遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NLGN-4基因與ASD相關(guān)，腦內(nèi)NLGN-4缺失可能導(dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，對語言交流過程和認(rèn)知發(fā)育產(chǎn)生顯著影響。此外，NLGN-4基因敲除小鼠在社會交往和交流方面表現(xiàn)出選擇性缺陷［43］。

3.4.2NRXN基因家族NRXN家族是一類與精神分裂癥和ASD 相關(guān)的突觸前細(xì)胞黏附分子。NRXN家族包含NRXN-1、NRXN-2、NRXN-3和NRXN-44 個(gè)基因，每個(gè)基因都可以通過上游和下游啟動(dòng)子產(chǎn)生α 和β 蛋白亞型，它們分別在鈣依賴性突觸傳遞、誘導(dǎo)和分化中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，NRXN-1和NRXN-2是ASD 易感基因，NRXN-1α和NRXN-2α敲除小鼠均表現(xiàn)出社交障礙和焦慮相關(guān)行為缺陷等ASD 樣行為表型。此外，NRXN-1α基因敲除小鼠在行為測試中也表現(xiàn)出更高的攻擊性［44］。盡管關(guān)于NRXN-3基因敲除小鼠與ASD 癥狀的關(guān)聯(lián)研究非常有限，但在亞臨床ASD 患者的父親體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了NRXN-3基因缺失［45］。NRXN-4又稱CNTNAP2，是首批被證實(shí)參與ASD 發(fā)生和發(fā)展的基因之一。CNTNAP2在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中高表達(dá)，可直接與語言發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白P2（forkhead box P2，F(xiàn)oxp2）結(jié)合。多項(xiàng)研究表明，敲除CNTNAP2基因的大鼠和小鼠表現(xiàn)出ASD 樣行為缺陷，如重復(fù)行為增加、社會行為障礙和異常感覺行為，利培酮治療可以逆轉(zhuǎn)CNTNAP2敲除小鼠的重復(fù)行為，這一結(jié)果提示CNTNAP2敲除小鼠有望成為ASD 藥理學(xué)研究的模型［46］。

3.4.3SHANK基因家族SHANK家族是一類突觸后支架蛋白，可與離子型或代謝型谷氨酸受體相互作用，也可通過錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、鈣蛋白酶介導(dǎo)的鈣信號通路以及多種重要的突觸后蛋白相互作用。SHANK家族由SHANK1、SHANK2和SHANK33 個(gè)基因組成，其中SHANK3是SHANK家族中與ASD相關(guān)性最緊密的基因。SHANK3在大腦皮層、海馬和小腦的顆粒細(xì)胞中高表達(dá)，是促進(jìn)樹突棘和功能性突觸形成和成熟的必需基因。目前已經(jīng)構(gòu)建了多種靶向SHANK3突變的動(dòng)物模型。SHANK3基因敲除小鼠表現(xiàn)出ASD 樣行為，如重復(fù)行為增加、學(xué)習(xí)記憶能力受損、社會交往障礙。靶向SHANK3的ANK 結(jié)構(gòu)域基因序列可以消除SHANK3最長亞型SHANK3α，這類基因敲除小鼠表現(xiàn)出更喜歡在籠子里活動(dòng)、探索新事物的興趣降低、空間記憶能力和可塑性受損等ASD 樣行為特征，但并未出現(xiàn)重復(fù)行為和焦慮樣行為的增加［47］。靶向SHANK3的PDZ 域基因序列可以消除SHANK3α、SHANK3β和部分SHANK3γ，這些PDZ 敲除小鼠表現(xiàn)出重復(fù)行為增加、社會交往障礙和過度焦慮等行為表型［48］。

3.4.4MECP2基因MECP2作為轉(zhuǎn)錄因子，在基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。MECP2是神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵基因。例如，MECP2基因的突變或增殖可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育障礙，MECP2蛋白的增加或減少可導(dǎo)致ASD 樣表型。將人類MECP2基因轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi)，小鼠表現(xiàn)出類似ASD 的表型，如社交行為缺陷［49］。Lu 等［50］報(bào)道MECP2轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)特異性甲基化可降低小鼠MECP2的表達(dá)，這類小鼠表現(xiàn)出一系列行為變化，如社交行為減少，重復(fù)行為增加，焦慮/抑郁增加，學(xué)習(xí)和記憶能力下降。海馬中MECP2啟動(dòng)子甲基化的特異性增加足以誘導(dǎo)大多數(shù)行為變化。目前，通過刪除3 號外顯子以及MECP2基因308X 點(diǎn)突變建立的小鼠模型是比較經(jīng)典的MECP2突變小鼠模型。

3.4.5FMR1基因 脆性X 染色體綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是由X 染色體上的FMR1基因突變引起的，是最常見的遺傳形式上的智力障礙疾病。FMR1基因突變可導(dǎo)致類似ASD 的癥狀，以及其他精神發(fā)育障礙，如多動(dòng)癥和癲癇。同時(shí)，F(xiàn)XS 也是ASD 最常見的單基因疾病，可以很好地代表ASD 的遺傳基礎(chǔ)和臨床表現(xiàn)。目前，絕大多數(shù)FXS 相關(guān)研究使用的動(dòng)物模型為FMR1敲除小鼠，其行為表型與FXS 患者在重復(fù)行為增加、超興奮、焦慮、易怒、社交障礙、空間學(xué)習(xí)能力障礙、海馬突觸發(fā)育障礙等多方面是一致的，這些特征主要是由腦回路的興奮和抑制不平衡引起的。通過酵母人工染色體將人FMR1基因轉(zhuǎn)移到FMR1敲除小鼠中，可以逆轉(zhuǎn)FMR1敲除小鼠的行為異常，表現(xiàn)為焦慮行為減少和探索行為增加［51］。然而，也有研究表明，F(xiàn)MR1突變小鼠模型不能完全表達(dá)FXS 的一些臨床表型，例如，F(xiàn)MR1敲除小鼠在Morris水迷宮測試和八臂迷宮測試中表現(xiàn)出正常的記憶能力和學(xué)習(xí)認(rèn)知能力，未表現(xiàn)出全面認(rèn)知障礙［52］。

3.4.6TCS1/2基因 結(jié)節(jié)性硬化癥是一種與ASD相關(guān)的罕見疾病，主要涉及基因?yàn)門SC1/2。小腦浦肯野細(xì)胞中TSC1的缺失可導(dǎo)致小鼠的社交障礙、認(rèn)知障礙、發(fā)聲異常和重復(fù)行為增加等ASD 樣行為。浦肯野細(xì)胞中TSC2基因的敲除也會導(dǎo)致小鼠社交障礙和重復(fù)行為的增加［53］。此外，Normand等［54］報(bào)道了妊娠第12.5天小鼠丘腦中TSC1的缺失會導(dǎo)致成年小鼠出現(xiàn)諸如強(qiáng)迫性梳理和癲癇發(fā)作等ASD樣行為特征，而mTOR抑制劑處理可以改善TSC模型中的突觸可塑性和相關(guān)行為障礙。

3.4.7PTEN基因PTEN是一種編碼磷酸酶和緊張素同源物的基因，已在高達(dá)20%的ASD 和頭大畸形兒童中鑒定出PTEN突變。如今，PTENcKO 小鼠模型已經(jīng)成為了解PTEN在發(fā)育過程中的作用，以及PTEN對包括ASD 在內(nèi)的人類神經(jīng)發(fā)育障礙疾病影響的有價(jià)值工具。例如，Cupolillo 等［55］證明小腦浦肯野細(xì)胞中PTEN的缺失會導(dǎo)致ASD 樣行為特征，包括社交能力受損、重復(fù)行為和運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)障礙。

3.4.8UBE3A基因UBE3A基因編碼1個(gè)100 kD的蛋白質(zhì)，其功能是泛素連接酶和轉(zhuǎn)錄輔激活劑。目前，有研究表明UBE3A在突觸功能和調(diào)節(jié)突觸可塑性中發(fā)揮著重要作用。Xu 等［57］發(fā)現(xiàn)UBE3A過表達(dá)小鼠表現(xiàn)出類似ASD 的癥狀，如重復(fù)行為增加和社交缺陷，而維A 酸補(bǔ)充劑可以顯著緩解小鼠的ASD樣表型。

3.4.9其他ASD 易感基因 目前，越來越多的ASD 相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)，基于這些熱點(diǎn)基因構(gòu)建的ASD嚙齒類動(dòng)物模型包括多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白T356M突變小鼠、EPHB6基因缺失小鼠、Foxp2基因敲除小鼠和KCTD13基因缺失小鼠。此外，近年來出現(xiàn)了新的ASD 風(fēng)險(xiǎn)基因，包括電壓門控性鈉通道二型α亞單位、Ras GTP酶激活蛋白1、ARID1B、谷氨酸離子型受體NMDA2B、DSCAM和T-brain-1，通過突變這些特定的ASD 風(fēng)險(xiǎn)基因，也可以構(gòu)建潛在的ASD嚙齒類動(dòng)物模型［33］。

3.5 ASD的其他嚙齒類動(dòng)物模型

除了上述3類常用的ASD 嚙齒動(dòng)物模型和基于ASD 易感基因構(gòu)建的各種嚙齒動(dòng)物模型外，研究人員還基于各種疑似致病因素開發(fā)了其他ASD嚙齒動(dòng)物模型，包括丙酸暴露模型、內(nèi)側(cè)前額葉皮層破壞模型、母體自身抗體模型等。

3.5.1丙酸暴露模型 通過向成年大鼠大腦注射丙酸，可以成功構(gòu)建ASD 大鼠模型，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶障礙、重復(fù)刻板樣行為、感覺運(yùn)動(dòng)異常等ASD樣行為。丙酸暴露大鼠模型大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，引起神經(jīng)炎癥，氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平增加，谷胱甘肽水平降低［58］。這些研究為丙酸誘導(dǎo)的ASD 嚙齒動(dòng)物模型的研究提供了基礎(chǔ)，但丙酸暴露與人ASD的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

3.5.2內(nèi)側(cè)前額葉皮層破壞模型 來源于ASD患者的尸檢結(jié)果顯示，內(nèi)側(cè)前額葉皮層異常生長。大鼠出生后前額葉皮層的破壞會導(dǎo)致發(fā)育后期社交行為減少等類似ASD 的行為障礙，但成年大鼠沒有表現(xiàn)出這種行為異常，目前利用該方法構(gòu)建ASD模型還存在許多技術(shù)難點(diǎn)和不確定性［59］。

3.5.3母體自身抗體模型 研究發(fā)現(xiàn)，部分ASD患者母親的血清中存在一種特異性抗體，如免疫球蛋白E13-E18、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）等，可影響胎兒大腦發(fā)育，導(dǎo)致后代出現(xiàn)ASD 樣癥狀。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，母鼠在孕期暴露于IgG 可增加后代幼鼠皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖，增加成年雄性小鼠神經(jīng)元大小及后代腦容量，同時(shí)在行為實(shí)驗(yàn)中會導(dǎo)致后代小鼠的感覺發(fā)育受損、焦慮行為增加和其他類似ASD的行為表現(xiàn)［60］。

綜上，嚙齒類動(dòng)物的基因操作工具豐富，單基因嚙齒類動(dòng)物模型可以用來解釋特定基因的功能，但并不能代表大多數(shù)人類的ASD 疾病。表3和表4總結(jié)了常用的嚙齒類動(dòng)物模型在ASD 研究中的應(yīng)用及優(yōu)缺點(diǎn)。

4 非人靈長類動(dòng)物模型

雖然嚙齒動(dòng)物已被廣泛用于ASD 的相關(guān)研究中，但嚙齒動(dòng)物與人在大腦解剖、分子途徑、社會行為等方面存在一定的差異，而非人類靈長類動(dòng)物在社會行為、解剖特征、藥物動(dòng)力學(xué)等方面與人類非常相似。眼睛注視異常和視覺接觸減少是ASD患者的共同特征。非人類靈長類動(dòng)物可以像人類一樣通過眼睛處理社會刺激，有能力從照片或視頻中識別個(gè)人，且眼睛注視的焦點(diǎn)可以定量分析，而嚙齒動(dòng)物主要依靠嗅覺來處理信息。因此，非人靈長類動(dòng)物模型使得獲得類似人類血液和組織樣本以及組織活檢成為可能。這些社會行為和認(rèn)知功能方面的差異可能限制了在ASD 嚙齒類動(dòng)物模型中的研究發(fā)現(xiàn)對人類ASD 患者的適用性，而非人靈長類模型可以提供比嚙齒動(dòng)物模型更有價(jià)值的信息。綜合來看，在ASD 相關(guān)研究中，非人靈長類動(dòng)物被認(rèn)為是比嚙齒動(dòng)物更好的動(dòng)物模型。然而，維持非人靈長類動(dòng)物模型需要特殊的設(shè)備，成本很高，而且該模型生命周期較長，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)周期較長。此外，進(jìn)行此類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之前，倫理制度非常嚴(yán)格。

目前，一些研究人員已在非人靈長類動(dòng)物中開展了ASD 相關(guān)研究。例如，在非人靈長類動(dòng)物中對ASD 相關(guān)基因SHANK3和MECP2進(jìn)行了突變，以構(gòu)建ASD 的非人靈長類動(dòng)物模型。Zhou等［61］利用CRISPR/Cas9 技術(shù)在食蟹猴及其后代構(gòu)建SHANK3突變食蟹猴，表現(xiàn)出重復(fù)行為增加、社交缺陷以及學(xué)習(xí)缺陷等ASD 樣行為。隨后，Zhang 等［62］利用獨(dú)特的靈長類眼球追蹤檢測技術(shù)結(jié)合磁共振成像分析對MECP2突變食蟹猴的相關(guān)表型進(jìn)行了探索，觀察到MECP2突變食蟹猴的生理、行為和結(jié)構(gòu)異常與ASD 患者相似。這些研究證明了利用基因工程方法構(gòu)建非人靈長類動(dòng)物模型研究腦部疾病的可行性和可靠性，同時(shí)非人靈長類動(dòng)物模型對于ASD 相關(guān)神經(jīng)機(jī)制的研究和潛在的治療干預(yù)具有重要價(jià)值。

此外，非人靈長類動(dòng)物孕期暴露于ASD 易感環(huán)境因素也可誘導(dǎo)子代發(fā)生ASD 樣行為。例如，Yasue 等［63］證明VPA 暴露會導(dǎo)致狨猴缺乏社交動(dòng)機(jī)和社交興趣下降。懷孕期間注射Poly I：C 的恒河猴后代表現(xiàn)出ASD 樣核心癥狀，如異常的刻板行為、重復(fù)行為增加和社會交往受損［64］。此外，臨床研究證實(shí)，高頻輻射可能導(dǎo)致ASD 發(fā)病率增加，當(dāng)恒河猴在懷孕前3 個(gè)月暴露于過量的X 射線下時(shí)，成年猴也會表現(xiàn)出更多的刻板行為和認(rèn)知行為障礙［65］。恒河猴在孕期暴露于與ASD 相關(guān)的特異性母體抗體，其后代表現(xiàn)出一定的社交障礙和腦容量增加，這與母親攜帶自身抗體的ASD兒童的臨床癥狀非常相似［66］。

綜上所述，食蟹猴和恒河猴等非人靈長類動(dòng)物與人類的同源性最高，生活在復(fù)雜的社會群體中。他們可以通過面部表情、肢體語言和聲音來進(jìn)行社會交流，在情感和社會方面與人類最為相似。非人靈長類ASD動(dòng)物模型模擬了與ASD患者相似的行為缺陷，并且具有與人類相似的社會行為相關(guān)的關(guān)鍵腦區(qū)。此外，利用眼動(dòng)跟蹤技術(shù)可以評估非人靈長類動(dòng)物的社會注意力缺陷。綜上所述，這些非人靈長類ASD動(dòng)物模型（表5）更接近于ASD 患者的表型和神經(jīng)特征，為嚙齒類動(dòng)物ASD模型向人類ASD疾病過渡提供了橋梁。

表5 非人靈長類動(dòng)物模型在ASD研究中的應(yīng)用以及優(yōu)缺點(diǎn)Table 5 The application, advantages and disadvantages of non-human primate models in ASD study

5 展望

本文系統(tǒng)總結(jié)了ASD 的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型及其構(gòu)建方法，以期為深入了解ASD 的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。在ASD研究中建立細(xì)胞模型和動(dòng)物模型的必要性和優(yōu)勢在于：①在臨床研究中，腦組織和神經(jīng)細(xì)胞樣本難以獲得，但在這些ASD 模型中是可以獲得的；②豐富且可重復(fù)的樣本使得研究者可以通過控制變量來研究環(huán)境和遺傳因素在ASD 神經(jīng)病理中的作用；③通過基因工程技術(shù)篩選新的易感基因，探索相關(guān)易感基因的功能；④研究者可以利用大量的動(dòng)物模型來觀察相關(guān)因素和候選藥物對ASD 核心行為的影響；⑤這些模型還可以用于研究和篩選ASD預(yù)防和干預(yù)措施。

目前，國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功構(gòu)建了多種細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，用于探究ASD 的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)ASD 診斷措施以及防治手段等相關(guān)領(lǐng)域。例如，ASD 的多種動(dòng)物模型為探究ASD 病理學(xué)與膽固醇代謝障礙之間存在重要關(guān)系提供了關(guān)鍵線索［67］。細(xì)胞因子IL-17 在不同ASD 模型中普遍增加，這些研究有助于闡明T 細(xì)胞活化和IL-17分泌在ASD 發(fā)病機(jī)制中的作用［68］。聽覺功能障礙是ASD 最常見的感知異常，而其潛在的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制尚不明確。在ASD 模型中多項(xiàng)研究表明，聽覺功能障礙可能是由中樞處理受損引起的，與E/I平衡失調(diào)以及GABA 能信號的改變有關(guān)，為治療ASD 患者的聽覺功能障礙提供了潛在的治療靶點(diǎn)［69］。此外，隨著基因編輯技術(shù)的逐步發(fā)展，基于易感基因構(gòu)建的ASD 細(xì)胞模型和動(dòng)物模型已成為探索ASD 致病機(jī)制和開發(fā)ASD 基因療法的重要工具。

在ASD 細(xì)胞模型方面，PC12 細(xì)胞、SH-SY5Y細(xì)胞、hiPSCs、LCLs 和原代神經(jīng)元在應(yīng)用于ASD相關(guān)研究時(shí)各有優(yōu)缺點(diǎn)。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，研究者可以利用CRISPR/Cas9 技術(shù)建立在形態(tài)和功能上更接近人類細(xì)胞的靈長類ASD 細(xì)胞模型，這將推動(dòng)ASD 發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展。ASD患者細(xì)胞標(biāo)本獲取困難，靈長類ASD 細(xì)胞模型的成功建立對闡明ASD 的發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)特異性標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)、篩選候選藥物以及評估新藥療效具有重要意義。

能夠高度還原ASD 臨床特征和發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型是研究ASD 的理想工具。目前越來越多的動(dòng)物模型被成功構(gòu)建，ASD 動(dòng)物模型的多樣化也導(dǎo)致了研究結(jié)果和表型的差異。結(jié)合國內(nèi)外動(dòng)物模型評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，3 種驗(yàn)證方法被廣泛用于評價(jià)動(dòng)物模型與人類疾病的相似性。①構(gòu)建效度方面，要求動(dòng)物模型的構(gòu)建方法和病理生理變化與疾病的假設(shè)或理論相一致。目前符合構(gòu)建效度的ASD 動(dòng)物模型包括SHANK3、FMR1、CNTNAP2、MECP2等基于單基因突變的ASD 動(dòng)物模型，以及VPA、MIA 等基于環(huán)境因素的ASD 動(dòng)物模型。②表面效度方面，要求動(dòng)物模型在許多方面能夠模擬疾病的典型特征。本文中提到的ASD 動(dòng)物模型幾乎都不同程度地滿足了這一要求。BTBR小鼠模型和VPA 小鼠模型能較好地模擬ASD 患者的臨床表型，因此在這些動(dòng)物模型中具有最好的表觀特征。③預(yù)測效度方面，要求動(dòng)物模型的藥理學(xué)和非藥理學(xué)反應(yīng)與臨床治療表現(xiàn)一致，能夠?yàn)榧膊〉拈L期治療和發(fā)病機(jī)制研究提供預(yù)測。然而，由于目前還沒有批準(zhǔn)用于治療ASD 患者核心癥狀的藥物上市，因此并不能很好地評估現(xiàn)有模型的預(yù)測效度。

除了上述提到的模式生物，還有一些其他的模式生物如狗和牛，正在被嘗試應(yīng)用于ASD 研究中。作為相對高級的哺乳動(dòng)物，狗和牛與人類在核心臨床表型、大腦結(jié)構(gòu)、生理、營養(yǎng)代謝、致病因素等方面的相似性高于嚙齒類動(dòng)物，但是這類動(dòng)物的體積較大、實(shí)驗(yàn)操作難度較大、維護(hù)費(fèi)用昂貴。Tsilioni 等［70］報(bào)道了血清神經(jīng)降壓素和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素在ASD 患者和具有ASD表型的斗牛犬中均顯著升高，這種犬種可能有助于ASD的診斷、發(fā)病機(jī)制和治療的研究。

考慮到ASD 的上述特點(diǎn)和高度異質(zhì)性，究竟哪種細(xì)胞模型和動(dòng)物模型是研究ASD 發(fā)病機(jī)制的最佳模型，目前尚未達(dá)成共識。研究者可嘗試從多個(gè)獨(dú)立的模型中尋找一致的ASD 致病因素，以探索ASD的致病機(jī)制、診斷方式和治療方法。