張 平 李嘉琪 劉雪峰 潘廣濤 丁 辛 呂文亮 劉菏婧 許 鵬 王從安

(1 湖北中醫(yī)藥大學(xué),武漢,430065; 2 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬鹽城市中醫(yī)院,鹽城,224000; 3 山東第一醫(yī)科大學(xué),濟(jì)南,250002)

幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori,Hp)是臨床導(dǎo)致慢性胃炎最常見的致病菌之一,目前全國近半數(shù)人口深受其害[1]。被Hp感染者口周皮膚寄存Hp，加之疫情影響下長期佩戴口罩致使口周皮膚持續(xù)受Hp刺激加重感染，且口罩區(qū)高濕、高溫環(huán)境使得皮膚油脂分泌增多，引起口周皮膚痤瘡[2]。目前西醫(yī)治療口周痤瘡以抗生素、異維A酸和激素類藥物為主，但均存在不同程度的不良反應(yīng)，且常具有耐藥性、復(fù)發(fā)風(fēng)險高[3]，而隨著傳統(tǒng)中醫(yī)藥與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的融會貫通，中醫(yī)學(xué)對于痤瘡病因病機(jī)、預(yù)后治療的認(rèn)識不斷豐富，在治療本病方面具有特殊優(yōu)勢。

痤瘡的發(fā)生與皮脂腺過度角質(zhì)化、皮脂腺阻塞、雄激素過度刺激以及痤瘡桿菌在皮脂腺單位的細(xì)菌定植有關(guān)[4],研究表明,Toll樣受體(Toll-like Receptor,TLR)存在于人體內(nèi)多種炎癥細(xì)胞表面,參與天然免疫和獲得性免疫,其中的TLR4蛋白介導(dǎo)其信號通路下游的核因子κB產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì),從而引起各種細(xì)胞反應(yīng)作用于表皮皮膚組織,與皮膚的痤瘡炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[5-7]。連樸飲具有清化濕熱,恢復(fù)脾胃升降的功效,本研究所用連樸飲加減方由黃連、厚樸、蒲公英、法半夏、石菖蒲、丹參、土鱉蟲組成,由呂文亮教授30余年臨床經(jīng)驗結(jié)合多項相關(guān)研究成果化裁而來,全方具有健脾與祛濕同用,瀉下與涼血化痰同用的配伍特點(diǎn)[8]?！捌⒃谌A為唇”“口之氣味因脾開竅于口,其他臟腑之氣可循經(jīng)脈上至于口”,均說明脾胃功能或其他臟腑功能失?；蛘卟∽兌荚诳谥苡兴从砙9],濕熱之邪上泛口唇是口周皮膚病常見的發(fā)病因素,祛濕熱法應(yīng)用于治療口周皮膚病變尤為關(guān)鍵。課題組臨床應(yīng)用本方發(fā)現(xiàn),連樸飲加減方在調(diào)節(jié)Hp感染者胃生態(tài)環(huán)境的同時,患者口周皮膚痤瘡得到明顯改善;另有研究顯示,Hp感染與口周皮膚環(huán)境改變存在較大的相關(guān)性,口周皮膚病患者伴有Hp感染率較高,部分患者伴有明顯消化道癥狀,但機(jī)制不明[10-11]。因此本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和動物實驗驗證相結(jié)合,探討連樸飲加減方治療Hp陽性痤瘡潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn),以及連樸飲通過調(diào)節(jié)TLR4/核因子κB信號通路治療Hp陽性口周痤瘡的作用機(jī)制,以期為防治口周痤瘡提供更多科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級6周齡Balb/c雄性小鼠60只,體質(zhì)量(20±5)g,由遼寧長生實驗動物中心提供,合格證號SCXK(鄂)2017-0012。于湖北中醫(yī)藥大學(xué)的SPF級動物飼養(yǎng)中心進(jìn)行飼養(yǎng),使用許可證編號SCXK(鄂)2020-0018,常規(guī)飲食飲水,室內(nèi)溫度(20±8)℃,相對濕度(50±10)%,人工采光,12 h進(jìn)行晝夜交替,實驗倫理審查批號：HUCMS202107003。

1.1.2 藥物 連樸飲加減方：黃連10 g、厚樸10 g、蒲公英30 g、法半夏10 g、石菖蒲10 g、丹參10 g、土鱉蟲10 g。生藥購于湖北省中醫(yī)院,經(jīng)過臨床劑量和藥物動物劑量換算[12],連樸飲加減方給藥濃度為13.65 g/kg,煎制為生藥含量為0.5 g/mL湯劑,4 ℃保存?zhèn)溆?。阿莫西林膠囊(0.25 g/片)(聯(lián)邦制藥廠有限公司,批號：HC20150055);左氧氟沙星片(0.5 g/片)[第一三共制藥(北京)有限公司,批號：H20040091];埃索美拉唑腸溶膠囊(40 mg/片)(重慶萊美藥業(yè)股份有限公司,批號：H20130095);枸櫞酸鉍鉀片(0.3 g/片)(麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠,批號：H10900084)。

1.1.3 試劑與儀器 5×蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號：P0015L);RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號：P0013D);β-肌動蛋白(β-actin)抗體、兔抗TLR4多克隆抗體(艾博抗上海貿(mào)易有限公司,貨號：ab8226、ab264468);兔抗核因子κB多克隆抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司,貨號：BF8005);蛋白Marker、辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)標(biāo)記山羊抗兔、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠(賽默飛世爾科技中國有限公司,貨號：26616、E-AB-1003、E-AB-1001);4%多聚甲醛(武漢卡諾斯科技公司,批號：BL539A);生物顯微鏡(尼康公司,日本,型號：E100);白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(R&D公司,美國,批號：QK206、MTA00B);高壓蒸汽滅菌鍋(上海力辰科技公司,貨號：DGL-35B);三氣培養(yǎng)箱(上海Heal Force力新儀器公司,貨號：0918K3K0286L);電子天平(中國湘雅天平儀器設(shè)備公司,型號：TP5200C);高速離心機(jī)(日立公司,日本,型號：CR21G);微量移液器(北京大龍公司,型號：DPETTE);溫控冰箱(中國伊萊克斯公司,型號：BCD-281E)。

1.2 方法

1.2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

1.2.1.1 連樸飲活性成分及靶點(diǎn)篩選 基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,https：//tcmspw.com/tcmsp.php),取得連樸飲方中各個藥物的化學(xué)成分,接著按口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%與類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18為閾值篩選得到潛在的活性化合物[13]。其中TCMSP平臺內(nèi)無蒲公英、土鱉蟲數(shù)據(jù),選擇在中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具(BATMAN-TCM)進(jìn)行篩選搜索。

1.2.1.2 活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)的收集 將上述篩選的化合物輸入Swisstarget Prediction數(shù)據(jù)庫(SIB,http：//www.swisstargetprediction.ch/)獲取連樸飲各個藥物的化合物對應(yīng)的靶點(diǎn),再把候選的化合物在TCMSP數(shù)據(jù)庫對應(yīng)的靶點(diǎn)作為補(bǔ)充,于Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)中獲取其靶點(diǎn)蛋白對應(yīng)的基因名。把SIB數(shù)據(jù)庫與TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取的靶點(diǎn)基因合并去重后,獲得連樸飲的候選靶點(diǎn)。

1.2.1.3 Hp陽性痤瘡相關(guān)靶點(diǎn)的收集 基于GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/),以“Acne”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,以“helicobacter pylori”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,取兩部分交集,獲取Hp陽性痤瘡相關(guān)靶點(diǎn)基因。

1.2.1.4 連樸飲治療Hp陽性痤瘡的靶點(diǎn)預(yù)測 利用Venny 2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將“1.2.1.2”和“1.2.1.3”所獲取的潛在活性成分靶點(diǎn)與疾病相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行對比和匹配,取交集,最后得到連樸飲方治療Hp陽性痤瘡的潛在作用靶點(diǎn)。

1.2.1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選 將“1.2.1.4”的潛在作用靶點(diǎn)提交至STRING 11.0(https：//string-db.org/)在線數(shù)據(jù)庫,限定物種為“人類(Homosapiens)”,設(shè)定最高置信度(Highestconfidence)>0.90,去除未互相連接的節(jié)點(diǎn)(Node)后,得到“靶點(diǎn)互作”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系并保存為“tsv”格式文件;將上述文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中,運(yùn)用“Network Analyzer”插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析,選取度值大于平均度值(Degree)的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn);利用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.2.1.6 中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Excel將“1.2.1.5”項下的關(guān)鍵靶點(diǎn)與連樸飲中藥-活性成分匹配,再利用Cytoscape 3.7.2將中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化處理。

1.2.1.7 關(guān)鍵靶點(diǎn)富集分析 將“1.2.1.6”項下篩選上述篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8平臺數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/),進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)分類富集分析,以P<0.01為閾值,依據(jù)count值進(jìn)行排序,分別篩選排名前10條GO的條目,運(yùn)用Prism 8繪制柱狀圖,京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析,經(jīng)過DAVID 6.8平臺數(shù)據(jù)庫處理后的數(shù)據(jù),以P<0.01為閾值,依據(jù)count值排序,篩選前10條KEGG代謝通路,使用Origin2017繪制氣泡圖并對以上兩項結(jié)果可視化分析。

1.2.2 動物實驗驗證

1.2.2.1 造模方法及成功標(biāo)志 SPF級雄性Balb/c小鼠60只,按照隨機(jī)數(shù)字分組法分為5組：空白對照組、模型對照組、中藥組、西藥組、中西醫(yī)結(jié)合組,每組12只,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。除空白對照組外,每組小鼠以5×109CFU/mL克拉霉素耐藥菌液0.2 mL灌胃,隔日2次,共14 d。之后在小鼠口周皮內(nèi)注射6×107CFU/μL丙酸桿菌菌液至出現(xiàn)肉眼可見的腫脹、發(fā)紅和紅斑即停止[14]。除空白對照組外,每組隨機(jī)挑選2只小鼠處死。取出全胃,擠出胃內(nèi)容物,沿小鼠胃大彎剪開,使用生理鹽水漂洗,將胃組織分為兩部分。一部分胃黏膜以滅菌接種環(huán)推入尿素細(xì)菌微量生化反應(yīng)管,24 h后尿素細(xì)菌微量生化反應(yīng)管由淡黃色變?yōu)榧t色為Hp感染造模成功的標(biāo)志。另一部分胃組織進(jìn)行胃黏膜銀染色,以觀測到上皮細(xì)胞Hp為定植成功,隨后觀察小鼠口周皮膚,若出現(xiàn)肉眼可見的腫脹、發(fā)紅和紅斑,即為造模成功。

1.2.2.2 給藥方法 空白對照組和模型對照組以生理鹽水0.3 mL/kg灌胃;中藥組給予連樸飲加減方13.65(g/kg)灌胃;西藥組給予阿莫西林膠囊(0.23 g/kg)、左氧氟沙星片(0.076 g/kg)、埃索美拉唑腸溶膠囊(6.06 mg/kg)、枸櫞酸鉍鉀片(0.18 g/kg)灌胃;中西醫(yī)組給予連樸飲加減方(13.65 g/kg)聯(lián)合阿莫西林膠囊(0.23 g/kg)、左氧氟沙星片(0.076 g/kg)、埃索美拉唑腸溶膠囊(6.06 mg/kg)、枸櫞酸鉍鉀片(0.18 g/kg)灌胃,1次/d。每3 d稱量并記錄體質(zhì)量1次。

1.2.3 觀察指標(biāo)及方法 各組小鼠治療28 d后,0.3%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射,眶靜脈取血1 mL,3 000 r/min,離心半徑12 cm,離心15 min(4 ℃)后,取上層血清,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎妹嘎?lián)免疫吸附試驗試劑盒,檢測小鼠血清中TNF-α和IL-6的水平;取小鼠口周皮膚組織置于4%多聚甲醛固定巢組織72 h后,脫水、包埋,4 μm切片,脫蠟,蘇木精-伊紅染色,光鏡下觀察小鼠口周皮膚組織病理變化;采用蛋白質(zhì)印跡法檢測小鼠口周皮膚組織含核苷酸結(jié)合寡聚化域蛋白1(Nucleotide-binding Oligomerization Domain 1,NOD1)、TLR4和核因子κB蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及其靶點(diǎn)預(yù)測 本方連樸飲共有7味藥,共篩選出70個化合物,黃連14個、厚樸2個、蒲公英3個、半夏11個、石菖蒲3個、丹參38個、土鱉蟲1個,經(jīng)整合去重后得到連樸飲活性成分候選靶點(diǎn)1 048個。

2.2 連樸飲治療Hp陽性痤瘡的潛在靶點(diǎn) 收集到疾病相關(guān)靶點(diǎn)408個,連樸飲治療Hp相關(guān)性痤瘡潛在作用靶點(diǎn)118個。見圖1。

圖1 連樸飲治療Hp陽性痤瘡的潛在作用靶點(diǎn)

2.3 連樸飲治療Hp陽性痤瘡的關(guān)鍵靶點(diǎn)和PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 潛在的作用靶點(diǎn)的PPI可視化網(wǎng)絡(luò)包括邊(Edge)393條,節(jié)點(diǎn)(Node)118個,平均度值(Degree)為6.66,圖中節(jié)點(diǎn)的度值代表相連接的邊的條數(shù),其中連樸飲治療Hp相關(guān)性痤瘡關(guān)鍵靶點(diǎn)42個。見圖2。度值較大的靶點(diǎn)是STAT3、MAPK1、SRC、EP300、JUN,其度值分別為30,29,24,22,22。見圖3。

圖2 連樸飲治療Hp陽性痤瘡的潛在作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 連樸飲治療Hp陽性痤瘡關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 連樸飲單味中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)的度值代表相連接的邊的條數(shù),其中脫氧隱丹參酮(Deoxyneocryptotanshinone),新隱丹參酮Ⅱ(Neocryptotanshinone ii)、棕櫚堿A(Palmidin A)、新橙皮苷(Neohesperidin)、丹參醛(Tanshinaldehyde)等潛在的活性成分擁有較高度值。見圖4,表1。

表1 連樸飲治療Hp陽性痤瘡的活性成分(排度值前10位)

圖4 連樸飲治療Hp陽性痤瘡的“中藥-活性成分-靶點(diǎn)圖”網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO富集分析 在生物過程中主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的陽性調(diào)控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter),細(xì)胞增殖的正調(diào)控(Positive regulationg of cell proliferatiiong),細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控(Negative regulationg of cell proliferatiiong)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction);在細(xì)胞組分中主要涉及細(xì)胞質(zhì)(Cytoplasm),細(xì)胞核(Nucleus)和胞漿(Cytosol);在分子功能中主要涉及57個,主要涉及蛋白結(jié)合(Protein binding),同蛋白結(jié)合(Identical protein binding)和三磷酸腺苷結(jié)合(ATP binding)。見圖5。

圖5 連樸飲治療Hp陽性痤瘡關(guān)鍵靶點(diǎn)GO富集分析

2.6 KEGG代謝通路富集分析 涉及基因數(shù)較多的代謝通路包括PI3K-AKT信號通路,MAPK信號通路,Chemokine信號通路,HIF-1信號通路,Toll-like receptor信號通路等。見圖6。

圖6 連樸飲治療Hp陽性痤瘡關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG富集分析

2.7 連樸飲對Hp陽性口周痤瘡小鼠皮膚組織病理學(xué)的影響 蘇木精-伊紅染色顯示空白對照組表皮光滑且較薄,毛囊等結(jié)構(gòu)分布排列正常。與空白對照組比較,模型對照組可見表皮增厚,毛囊口擴(kuò)張明顯,周圍可見大量的炎癥細(xì)胞分布,差異明顯。觀察組與模型對照組比較,炎癥細(xì)胞顯著減少,其中中西醫(yī)結(jié)合組療效最好,蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示最接近空白對照組。

圖7 連樸飲對小鼠Hp陽性痤瘡模型上皮組織病理切片的影響(蘇木精-伊紅染色,×40)

2.8 連樸飲對Hp陽性口周痤瘡小鼠炎癥介質(zhì)IL-6、TNF-α水平的影響 與空白對照組比較,模型對照組小鼠血清IL-6、TNF-α的水平顯著上升(均P<0.01);與模型對照組比較,中藥組、西藥組、中西醫(yī)結(jié)合組小鼠血清炎癥介質(zhì)IL-6、TNF-α均顯著下降(均P<0.01)。見表2。

表2 連樸飲對Hp陽性口周痤瘡小鼠炎癥介質(zhì)IL-6、 TNF-α水平的影響

2.9 連樸飲加減方對Hp陽性口周痤瘡小鼠口周皮膚組織NOD1、TLR4、核因子κB蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組比較,模型對照組小鼠口周皮膚組織NOD1、TLR4、核因子κB蛋白表達(dá)顯著上升(均P<0.01);與模型對照組比較,中藥組Hp陽性痤瘡小鼠口周皮膚組織蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01,P<0.05,P<0.05);西藥組Hp陽性痤瘡小鼠口周皮膚組織中NOD1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),TLR4、核因子κB蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05);中西醫(yī)結(jié)合組Hp陽性痤瘡小鼠口周皮膚組織NOD1、TLR4、核因子κB蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.01)。見表3。

表3 連樸飲加減方對Hp陽性痤瘡小鼠口周皮膚組織 NOD1、TLR4、核因子κB蛋白表達(dá)的影響

圖8 各組小鼠口周皮膚組織NOD1、TLR4核因子κB蛋白表達(dá)電泳條帶

3 討論

痤瘡是好發(fā)于青少年顏面部的毛囊皮脂腺部位的慢性的具有一定炎癥性表現(xiàn)的皮膚疾病[15],“T”區(qū)是毛囊及皮脂腺分布較多的部位,也是口周痤瘡多發(fā)區(qū)域,其發(fā)病內(nèi)外因素較多,人為干擾性大,臨床中口周反復(fù)發(fā)作的痤瘡伴見Hp極高,Hp是可能引起痤瘡的重要因素之一[16]。深入研究口周痤瘡與Hp相關(guān)性,及中藥治療Hp相關(guān)性口周痤瘡的發(fā)病機(jī)制有長遠(yuǎn)意義。

中醫(yī)認(rèn)為本病屬于外科瘡瘍病,是中醫(yī)外科疾病中的常見病癥。《黃帝內(nèi)經(jīng)》曰：“口唇者,脾之官也。脾開竅于口,其華在唇?！弊汴柮魑附?jīng)挾口環(huán)唇,下交承漿,故唇部疾病與脾胃關(guān)系密切。《諸病源候論》有云：“脾胃有熱,氣發(fā)于唇,則唇生瘡。”“脾與胃合足陽明之經(jīng),胃之脈也,其經(jīng)起于鼻,環(huán)于唇,其支脈入絡(luò)于脾,脾胃有風(fēng)熱邪氣乘之,而腫發(fā)于唇?！逼⑽覆∽冊诿娌勘憩F(xiàn)主要在口周,在《醫(yī)宗金鑒》中也有記載。脾胃之火,壅滯中焦,使其清陽不升,濁陰不降,脾胃功能失調(diào),發(fā)為口周皮膚病。人體氣機(jī)代謝的樞紐在于脾胃,脾胃和,則氣機(jī)暢,氣機(jī)不暢則濕邪內(nèi)生,濕久化熱。脾為濕土,則喜燥惡濕,所以濕邪最容易侵犯于脾;相反,胃為燥土,則喜潤惡燥,因此最易患燥邪之病,燥為熱之邪,脾胃互為表里,二者結(jié)合即成濕熱,則易侵犯脾胃。濕熱內(nèi)蘊(yùn),無力下達(dá),熏蒸于上發(fā)為皮膚病,濕為陰邪,黏滯重濁,阻遏氣機(jī);熱為陽邪,生風(fēng)動血,易生瘡瘍;兩邪交合,膠結(jié)難解,易使病情纏綿,反復(fù)易發(fā)?！捌㈤_竅于口”“脾在華為唇”“足陽明胃經(jīng)挾口環(huán)唇”,濕熱之邪上犯口唇是口周皮膚病常見的發(fā)病因素,因此祛濕熱法應(yīng)用于治療口周皮膚病變尤為關(guān)鍵。本研究所用連樸飲加減方中黃連燥濕清熱,厚樸宣暢氣機(jī)、化濕行滯,二者合用,濕化熱清,氣行胃和,升降復(fù)常;石菖蒲芳香化濕,半夏降逆燥濕,二者為臣;佐以梔子、豆豉宣發(fā)郁熱,蘆根清熱生津。全方辛開苦降,寒溫互用,共奏清熱化濕之效。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)分析,連樸飲治療Hp相關(guān)性痤瘡的活性成分主要包括脫氧隱丹參酮、新隱丹參酮Ⅱ、棕櫚堿、新橙皮苷、丹參醛。其可能在連樸飲治療Hp相關(guān)性痤瘡的過程中發(fā)揮著重要作用,脫氧隱丹參酮、新隱丹參酮Ⅱ均屬于隱丹參酮類,脫氧隱丹參酮具有抗炎的藥理活性[17],新隱丹參酮Ⅱ可通過作用于中性粒細(xì)胞,參與機(jī)體細(xì)胞化學(xué)趨化作用,增強(qiáng)機(jī)體中性粒細(xì)胞殺菌作用[18],二者均可通過降低炎癥介質(zhì)釋放量,增加機(jī)體殺菌作用,提高胰島素的敏感性,起到治療代謝紊亂的目的,減輕炎癥狀態(tài),延緩痤瘡的發(fā)展進(jìn)程[19-20]。羅煜等[21]研究發(fā)現(xiàn),棕櫚堿具有抗炎作用,通過提高機(jī)體的抗氧化作用、抑制炎癥介質(zhì)的釋放,改善皮膚損傷。另有研究發(fā)現(xiàn)棕櫚堿可以產(chǎn)生良好的體外抗菌作用,對90.9%的耐藥菌均表現(xiàn)為協(xié)同或者相加抑菌作用[22],治療Hp相關(guān)性痤瘡一定要重視棕櫚堿的利用。馮寶民等[23]發(fā)現(xiàn)新橙皮苷有較好的抑制皮膚炎癥作用,并且有一定的抗過敏性作用,對于Hp相關(guān)性痤瘡的皮膚炎癥及其他原因引起的過敏性皮膚炎癥有良好的治療效果,有研究表明在痤瘡局部炎癥時,其周圍的多數(shù)T細(xì)胞DR抗原陽性,呈激活狀態(tài)[24]。而丹參醛對于T細(xì)胞有激活作用[25],對于Hp相關(guān)性痤瘡的治療和減輕其炎癥損傷有積極效果。對預(yù)測得到連樸飲治療Hp陽性痤瘡的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal Transducers and Activators of Transcription 3,STAT3)、人絲裂原活化蛋白激酶1(Mitogen-activated Protein Kinase 1,MAPK1)、Src蛋白、E1A結(jié)合蛋白P300(EP300),1號染色體基因(JUN)等在網(wǎng)絡(luò)中處于重要地位。Hp感染是引起Hp陽性痤瘡的主要因素,其感染后可能會引起一系列痤瘡炎癥[26]。Hp感染與STAT3信號表達(dá)呈陽性時[27],Hp感染可大量激活STAT3,使其影響下游轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)的表達(dá)進(jìn)而引發(fā)一系列機(jī)體免疫反應(yīng)[28],通過下調(diào)STAT3從而起到減輕機(jī)體免疫反應(yīng)的作用。MAPK1屬于MAPK家族,MAPK通路屬于應(yīng)激激活的蛋白激酶信號通路,可以參與應(yīng)激狀態(tài)下表皮細(xì)胞的凋亡、轉(zhuǎn)分化及免疫炎癥反應(yīng)等過程,研究顯示MAPK參與了痤瘡的發(fā)病過程[29],其通過調(diào)控微炎癥的狀態(tài)、下調(diào)炎癥介質(zhì)的表達(dá)進(jìn)而延緩痤瘡炎癥的病程發(fā)展。Src蛋白在人類多種腫瘤細(xì)胞中被激活,并在腫瘤發(fā)病、發(fā)展過程中起重要作用。它在細(xì)胞中廣泛存在,當(dāng)其活化后可以進(jìn)一步激活STAT3促炎癥的信號通路[30],但基因突變和一些其他方式也可以調(diào)節(jié)其活性,在皮膚炎癥發(fā)生過程中具有重要意義,因此Src蛋白在治療Hp陽性痤瘡過程有不可忽視的作用。

對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析,發(fā)現(xiàn)連樸飲對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,細(xì)胞表面蛋白結(jié)合,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子功能、刺激蛋白酶的活性等生物過程具有調(diào)節(jié)作用。通過KEGG信號通路富集分析后認(rèn)為TLR信號通路可能為關(guān)鍵通路之一。研究表明皮脂腺微生態(tài)是皮膚微生態(tài)的重要組分,在皮膚防御功能上有著重要作用,其失衡與皮膚痤瘡的產(chǎn)生有著密切聯(lián)系[31],Hp陽性痤瘡不可忽視皮脂腺微生態(tài)平衡。皮脂腺微生態(tài)失衡,引起油脂分泌異常進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)及Hp陽性痤瘡的發(fā)生,TLR信號通路與痤瘡炎癥反應(yīng)和痤瘡瘢痕化密切相關(guān),其異常激活會導(dǎo)致痤瘡免疫反應(yīng)[32],加劇痤瘡炎癥的發(fā)生與免疫失衡[33]。其中TLR4和核因子κB是TLR信號通路中上下游較為重要的組分,故對TLR4和核因子κB信號通路進(jìn)行了動物實驗驗證分析。

實驗結(jié)果顯示,通過Hp聯(lián)合痤瘡丙酸桿菌移植感染制備出的口周皮損模型可以引起皮膚炎癥反應(yīng)、表皮細(xì)胞凋亡或壞死等,與以往研究結(jié)果相符[34-37],暴露于Hp陽性痤瘡中淋巴細(xì)胞浸潤明顯增多。而連樸飲加減方有效減少了小鼠皮膚組織的淋巴細(xì)胞浸潤,皮膚損傷過程中導(dǎo)致小鼠血清中IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)分泌增加,連樸飲加減方可有效下調(diào)小鼠IL-6、TNF-α的表達(dá)水平,與既往研究一致[38-39]。動物研究結(jié)果提示連樸飲加減方可以減輕小鼠Hp陽性痤瘡模型導(dǎo)致的皮膚組織病理損傷,改善表皮皮損,減輕全身炎癥反應(yīng),并減少皮膚組織中TLR4和核因子κB的蛋白表達(dá)。當(dāng)發(fā)生嚴(yán)重的痤瘡炎癥反應(yīng)時,損傷部位會匯集大量的白細(xì)胞,由此白細(xì)胞的浸潤被認(rèn)為是痤瘡炎癥反應(yīng)的征兆[40]。TLR4是Hp陽性痤瘡炎癥發(fā)展過程中關(guān)鍵的膜識別受體,同時作為核因子κB信號通路的上游重要的信號分子,有可能通過調(diào)節(jié)核因子κB信號通路調(diào)節(jié)Hp陽性痤瘡的炎癥的發(fā)展[41],探究TLR4和核因子κB在本疾病的具體作用和調(diào)控機(jī)制在Hp陽性痤瘡發(fā)生發(fā)展中十分重要。

綜上所述,連樸飲加減方對于Hp陽性口周痤瘡的治療,可能是通過TLR信號通路中的TLR4/核因子κB信號通路的失衡實現(xiàn)抑制皮膚組織炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮其治療Hp陽性口周痤瘡的作用。這些為進(jìn)一步研究連樸飲加減方提供了一定的藥理學(xué)基礎(chǔ),也為更進(jìn)一步探討中藥對口周痤瘡的干預(yù)途徑和防治痤瘡的新藥提供了新的思路。本研究僅得出連樸飲能夠?qū)p陽性口周痤瘡小鼠發(fā)揮抗炎作用,尚不能明確連樸飲是否通過改善Hp感染從而治療口周痤瘡,其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：本文無任何利益沖突。