姚鈺寧 韓趙成 曹光昭 樊歡歡 曹克剛,5

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京,100007; 2 河南中醫(yī)藥大學(xué),鄭州,450046; 3 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京,100091; 4 北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院,北京,101300; 5 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腦病研究院,北京,100027)

偏頭痛(Migraine)是最常見(jiàn)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一,被世界衛(wèi)生組織列為全球第二大致殘性神經(jīng)系統(tǒng)疾病和第三大流行疾病,困擾著全世界約15%的人口[1-2]。其發(fā)病年齡主要在10～14歲和22～44歲,易導(dǎo)致缺勤、誤工、誤產(chǎn)[3-5]。偏頭痛與腦血管病等多種疾病密切相關(guān),同時(shí)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,其發(fā)病與治療機(jī)制研究是目前醫(yī)學(xué)界的重點(diǎn)任務(wù)之一[6-9]。

一次典型的偏頭痛發(fā)作,包括前驅(qū)期(Premonitory)、先兆期(Aura)、頭痛期(Headache)和頭痛后期(Postdrome)4個(gè)時(shí)期,臨床上在不同時(shí)期進(jìn)行干預(yù)能獲得不同的療效[10]。這一特點(diǎn)也得到血管源性學(xué)說(shuō)中血管先收縮(收縮相)后舒張(舒張相)導(dǎo)致頭痛發(fā)生的理論支持。為進(jìn)行偏頭痛的相關(guān)研究,目前主要根據(jù)不同的發(fā)病機(jī)制學(xué)說(shuō)建立動(dòng)物模型,主要包括基于皮層擴(kuò)散性抑制(Cortical Spreading Depression,CSD)學(xué)說(shuō)的CSD模型、基于三叉神經(jīng)血管學(xué)說(shuō)的硬腦膜神經(jīng)炎癥模型以及基于血管源性學(xué)說(shuō)的硝酸甘油模型[11-21]。

基于對(duì)偏頭痛最佳干預(yù)時(shí)間點(diǎn)的研究需求,為解決目前動(dòng)物模型對(duì)偏頭痛完整病程模擬不足的問(wèn)題,團(tuán)隊(duì)基于經(jīng)典的硝酸甘油大鼠模型,篩選各類具有血管收縮作用的藥物,并構(gòu)建具有血管收縮-舒張時(shí)相性特點(diǎn)的偏頭痛大鼠模型[22-23],即首先通過(guò)皮下注射多巴胺(Dopamine,DA)(20 mg/kg),45 min后皮下注射硝酸甘油(Glyceryl Trinitrate,GTN)(10 mg/kg),該模型經(jīng)過(guò)了穩(wěn)定性評(píng)價(jià)和藥物反證驗(yàn)證。因此,本研究基于該動(dòng)物模型,采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)相性偏頭痛模型大鼠的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行探究,以期為后續(xù)偏頭痛的發(fā)病機(jī)制與治療研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠36只,體質(zhì)量190～210 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2017-0033。動(dòng)物飼養(yǎng)條件如下：室溫為(24±2)℃,濕度為55%±5%,每日光暗環(huán)境各12 h,普通飼料喂養(yǎng),可自由飲水進(jìn)食。本研究通過(guò)倫理委員會(huì)審批(倫理審批號(hào)：21-07)。

1.1.2 試劑與儀器 鹽酸多巴胺注射液(上海禾豐制藥有限公司,貨號(hào)：33200314),硝酸甘油注射液(北京益民藥業(yè)有限公司,貨號(hào)：20200823),TMTpro16標(biāo)記試劑盒(ThermoScientific公司,美國(guó),貨號(hào)：A44520),SDS裂解液(碧云天,貨號(hào)：P0013G),二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)試劑盒、質(zhì)譜水、質(zhì)譜級(jí)乙腈、甲酸(ThermoScientific公司,美國(guó),貨號(hào)：23225、W6-4、A955-4、FCMA117-50),未染色蛋白分子量marker(ThermoScientific,美國(guó),貨號(hào)：26610),預(yù)制膠(GenScript,貨號(hào)：M00669),苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonyl Fluoride,PMSF)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽[Tris(hydroxymethyl)aminomethane Hydrochloride,Tris-HCl](pH=6.8;pH=8.8)、三乙醇胺硼酸酯(Triethanolamine Borate,TEAB)(生工,貨號(hào)：A510932-0500),Tris飽和酚(Solarbio life sciences,貨號(hào)：T0250),二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)(上海泰坦科技股份有限公司,貨號(hào)：01064272),吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic Acid,IAA)(生工,貨號(hào)：A600539-0005),胰酶(華利世,貨號(hào)：HLS TRY001C),無(wú)水乙醇、異丙醇(GENERAL-REAGENT,貨號(hào)：G73537B,G75885B),色譜級(jí)丙酮(沃凱,貨號(hào)：40064485);質(zhì)譜儀(ThermoFisher,美國(guó),型號(hào)：Q Exactive HF),液相系統(tǒng)(ThermoFisher,美國(guó),型號(hào)：Easy-nLC 1200),臺(tái)式冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀,型號(hào)：TGL-16A),超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝,型號(hào)：SCIENTZ-II D),SDS-PAGE凝膠電泳儀(北京市六一儀器廠,型號(hào)：DYY-6C),酶標(biāo)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司,型號(hào)：ST-360),恒溫混勻儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司,型號(hào)：JXH-100),全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司,型號(hào)：Tanon-1600),eStain LG蛋白染色儀(南京金斯瑞生物科技有限公司,型號(hào)：L00760C),電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司,型號(hào)：FA2004B),凍干機(jī)(寧波新芝,型號(hào)：SCIENTZ-10N),高pH分離液相色譜儀(Agilent,美國(guó),型號(hào)：Agilent 1100 series)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 時(shí)相性偏頭痛大鼠模型制備：稱重后于大鼠頸部皮下注射DA,20 mg/kg,45 min后頸部皮下注射GTN,10 mg/kg,大鼠出現(xiàn)痛苦面容即為造模成功。大鼠痛苦面容包括：眼眶緊縮、耳朵豎起、臉頰凸起、鼻子凸起和胡須改變。

36只雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組、DA注射后11 min取材DA-11組、DA注射后22 min取材DA-22組、DA注射后33 min取材DA-33組、GTN注射后1 h取材GTN-1組、GTN注射后2 h GTN-2組,每組6只。除空白對(duì)照組外,對(duì)剩余30只大鼠進(jìn)行模型制備,于不同時(shí)間點(diǎn)取三叉神經(jīng)節(jié),并用止血鉗和眼科鑷將其從周圍組織中輕柔分開(kāi),剔除表面血液與筋膜,存入凍存管后放入液氮中保存,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。此外,空白對(duì)照組與GTN-2組同時(shí)間點(diǎn)取材。本研究中僅GTN-1組和GTN-2組大鼠完整造模,DA-11組、DA-22組、DA-33組均在造模過(guò)程中處死取材。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1)蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)序：a.蛋白提取,取出適量冷凍樣品,轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,加入SDS裂解液,并加入蛋白酶抑制劑PMSF使其終濃度為1 mmol/L。置于冰上超聲破碎,12 000×g,離心10 min,取上清,所得上清即為樣品的總蛋白溶液,采用BCA蛋白濃度法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定并分裝后儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆肹24]。b.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,取10 μg蛋白,采用12% SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離,分離后的凝膠使用eStain ?LG蛋白染色儀進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色,染色后的凝膠應(yīng)用全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)成像。c.胰蛋白酶酶解,根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度,每個(gè)樣品取50 μg,并用裂解液將不同組的樣品稀釋調(diào)整到相同的濃度和體積。將DTT加入蛋白溶液中,使得DTT的終濃度為5 mmol/L,混勻后于55 ℃孵育30 min。在冰上冷卻至室溫,加入相應(yīng)體積的碘乙酰胺,使得終濃度為10 mmol/L,充分混勻,室溫避光放置15 min。在上述溶液中加入6倍體積的丙酮沉淀蛋白,-20 ℃放置4 h以上或者過(guò)夜。4 ℃,8 000×g,離心10 min并收集沉淀,揮發(fā)丙酮2～3 min。加入100 μL TEAB(200 mmol/L)復(fù)溶沉淀,加入1/50樣品質(zhì)量的胰酶Trypsin-TPCK(1 mg/mL),并于37 ℃消化過(guò)夜,酶解后的樣品凍干后于-80 ℃保存。d.肽段標(biāo)記,將50 μL 100 mmol/L TEAB緩沖液加入到凍干樣品中,混勻后于1.5 mL離心管中進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。從冰箱中取出TMTpro試劑,平衡至室溫,加入20 μL無(wú)水乙腈,渦流5 min,8 000×g離心。取10 μL TMTpro試劑加入樣品中,渦流混勻,室溫放置1 h。加入5 μL 5%羥胺終止反應(yīng)15 min,凍干后于-80 ℃保存。2)反相色譜分離：本研究使用Agilent 1100 HPLC高pH分離液相色譜儀,通過(guò)Agilent Zorbax Extend-C18窄徑柱(2.1 mm×150 mm,5 μm)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行梯度分離,流速為300 μL/min,收集8～60 min的樣品,收樣凍干。肽段分離后應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS)系統(tǒng),收集數(shù)據(jù)并保存為原始格式,進(jìn)行質(zhì)譜分析。數(shù)據(jù)采用Proteome Discover 2.4(Thermofisher公司)分析。質(zhì)譜檢索參數(shù)見(jiàn)表1。

1.2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析 1)差異蛋白篩選：根據(jù)DA-11組、DA-22組、DA-33組、GTN-1組、GTN-2組和空白對(duì)照組蛋白表達(dá)水平,篩選出差異蛋白。篩選條件為：logfold change≥1 andP<0.05,其中l(wèi)ogfold change用來(lái)評(píng)估某一蛋白在樣品間的表達(dá)水平變化倍數(shù)。2)富集分析：基因本體(Gene Ontology,GO)是對(duì)基因和蛋白功能進(jìn)行限定和描述的數(shù)據(jù)庫(kù),富集分析可以得到差異表達(dá)蛋白在GO節(jié)點(diǎn)中的富集顯著性。本研究通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)與空白對(duì)照組比較,對(duì)DA-11組、DA-22組、DA-33組、GTN-1組、GTN-2組的差異蛋白進(jìn)行GO富集分析,選取與偏頭痛相關(guān)且P<0.05的生物學(xué)過(guò)程繪制氣泡圖。3)關(guān)鍵蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：首先以兩倍度中心性(Degree)中位數(shù)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選,接下來(lái)以度中心性,接近中心性(Closeness),中介中心性(Betweenness)中位數(shù)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選,所獲得的靶點(diǎn)即為關(guān)鍵靶點(diǎn),并將獲得的核心靶點(diǎn)采用Cytoscape 3.7.1進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,將網(wǎng)絡(luò)圖像可視化。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 大鼠在造模前探索行為和運(yùn)動(dòng)如常;在造模后,大鼠出現(xiàn)明顯嗜臥,探索行為減少,運(yùn)動(dòng)減少,并出現(xiàn)痛苦面容,提示時(shí)相性偏頭痛大鼠模型造模成功。

2.2 蛋白質(zhì)組分析 差異蛋白分析結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比較,DA-11組有1 323個(gè)差異蛋白;DA-22組有1 392個(gè)差異蛋白;DA-33組有961個(gè)差異蛋白;GTN-1組有1 051個(gè)差異蛋白;GTN-2組有1 102個(gè)差異蛋白。見(jiàn)圖1。

2.3 差異蛋白功能富集分析及關(guān)鍵蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

富集分析結(jié)果表明,DA注射后11 min取材、DA注射后22 min取材差異蛋白富集在氧化應(yīng)激反應(yīng)(Response to Oxidative Stress)、代謝過(guò)程(Metabolic Process)等生物學(xué)過(guò)程,DA注射后33 min取材仍以氧化應(yīng)激反應(yīng)為關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程;GTN注射后1 h取材以炎癥反應(yīng)(Inflammatory Response)、凋亡(Apoptotic Process)為關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程;GTN注射后2 h取材中代謝過(guò)程再次發(fā)生。

2.3.1 DA注射后11 min取材差異蛋白分析結(jié)果 DA注射后11 min取材差異蛋白富集分析結(jié)果表明,氧化應(yīng)激反應(yīng)、代謝過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程為注射DA 11 min后關(guān)鍵的生物學(xué)過(guò)程,另有微管(Microtubule)、細(xì)胞代謝過(guò)程(Cellular Metabolic Process)、對(duì)外部刺激的反應(yīng)(Response to External Stimulus)、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)(Response to Extracellular Stimulus)、氧化還原過(guò)程(Oxidation-reduction Process)、應(yīng)激反應(yīng)(Response to Stress)等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程發(fā)生。此外,熱休克蛋白90α家族A類成員1(Heat Shock Protein HSP 90-alpha,HSP90aa1)、熱休克70 kDa蛋白4(Heat Shock 70 kDa Protein 4,Hspa4)、熱休克70 kDa蛋白5(Heat Shock 70 kDa Protein 5,Hspa5)、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白[Guanine Nucleotide Binding Protein(G Protein) beta Polypeptide 2-like 1,Gnb2l1]、趨化因子(C-X-C基元)配體2(Recombinant Human C-X-C Motif Chemokine 2,Cxcl2)被鑒定為核心蛋白。見(jiàn)圖2～3。

圖3 DA注射后11 min取材核心蛋白網(wǎng)絡(luò)

2.3.2 DA注射后22 min取材差異蛋白分析結(jié)果 DA注射后22 min取材差異蛋白富集分析結(jié)果表明,代謝過(guò)程、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程依舊為注射DA 22 min后關(guān)鍵的生物學(xué)過(guò)程,另有蛋白結(jié)合(Protein Binding)、細(xì)胞黏附分子結(jié)合(Cell Adhesion Molecule Binding)、氧化還原過(guò)程、線粒體部分(Mitochondrial Part)、小分子代謝過(guò)程(Small Molecule Metabolic Process)、微管等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程發(fā)生。此外,Hsp90aa1、Gnb2l1、真核翻譯延伸因子1γ(Eukaryotic Translation Elongation Factor 1 gamma,Eef1g)、Hspa4、ATP合成酶,H+轉(zhuǎn)運(yùn),線粒體F1復(fù)合體,α亞基1,心肌(ATP Synthase,H+Transporting,Mitochondrial F1 Complex,alpha Subunit 1,Cardiac Muscle,Atp5a1)被鑒定為核心蛋白。見(jiàn)圖4～5。

圖4 DA注射后22 min取材GO富集分析結(jié)果

圖5 DA注射后22 min取材核心蛋白網(wǎng)絡(luò)

2.3.3 DA注射后33 min取材差異蛋白分析結(jié)果 DA注射后33 min取材差異蛋白富集分析結(jié)果表明,氧化應(yīng)激反應(yīng)依舊為注射DA 33 min后關(guān)鍵的生物學(xué)過(guò)程,另有氧化還原過(guò)程、抗氧化活性(Antioxidant Activity)、凋亡、細(xì)胞質(zhì)(Cytoplasm)、蛋白結(jié)合、分子結(jié)構(gòu)活性(Structural Molecule Activity)、ATP代謝過(guò)程(ATP Metabolic Process)等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程發(fā)生。此外,β-肌動(dòng)蛋白(Beta Actin,Actb)、整聯(lián)蛋白,β3(Integrin,Beta 3,Itgb3)、白蛋白(Albumin,Alb)、黏著斑蛋白(Vinculin,Vcl)、肌動(dòng)蛋白,α2,平滑肌,主動(dòng)脈(Actin,Alpha 2,Smooth Muscle,Aorta,Acta2)被鑒定為核心蛋白。見(jiàn)圖6～7。

圖6 DA注射后33 min取材GO富集分析結(jié)果

圖7 DA注射后33 min取材核心蛋白網(wǎng)絡(luò)

2.3.4 GTN注射后1 h取材差異蛋白分析結(jié)果 GTN注射后1 h取材差異蛋白富集分析結(jié)果表明,炎癥反應(yīng)、凋亡為注射GTN 1 h后關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程,另有蛋白結(jié)合、應(yīng)激反應(yīng)、小分子代謝過(guò)程、氧化還原酶活性(Oxidoreductase Activity)、對(duì)外部刺激的反應(yīng)、血液循環(huán)(Blood Circulation)等生物學(xué)過(guò)程發(fā)生。此外,Actb、Hspa4、Gnb2l1、伴侶蛋白含TCP1,亞基5(ε)(Chaperonin Containing TCP1,Subunit 5,Cct5)、Hspa5被鑒定為核心蛋白。見(jiàn)圖8～9。

圖8 GTN注射后1 h取材GO富集分析結(jié)果

圖9 GTN注射后1 h取材核心蛋白網(wǎng)絡(luò)

2.3.5 GTN注射后2 h取材差異蛋白分析結(jié)果 GTN注射后2 h取材差異蛋白富集分析結(jié)果表明,注射GTN 2 h后,代謝過(guò)程再次發(fā)生,另有細(xì)胞黏附(Cell Adhesion)、應(yīng)激反應(yīng)、氧化還原過(guò)程、氧化還原酶活性、分子功能調(diào)節(jié)(Regulation of Molecular Function)、細(xì)胞發(fā)育過(guò)程(Cellular Developmental Process)、鈣離子結(jié)合(Calcium Ion Binding)等生物學(xué)過(guò)程發(fā)生。此外,Actb、Hsp90aa1、Alb、熱休克蛋白90 kDa α(胞漿),類B成員1[Heat Shock Protein 90 kDa alpha(cytosolic),Class B Member 1,Hsp90ab1]、Hspa4被鑒定為核心蛋白。見(jiàn)圖10～11。

圖10 GTN注射后2 h取材GO富集分析結(jié)果

圖11 GTN注射后2 h取材核心蛋白網(wǎng)絡(luò)

2.3.6 收縮相和舒張相的主要生物學(xué)過(guò)程 時(shí)相性偏頭痛大鼠模型模擬了偏頭痛發(fā)作時(shí)血管收縮-舒張時(shí)相性特點(diǎn),注射DA后至注射GTN前為收縮相,本研究中DA注射后11 min、22 min和33 min取材均屬于收縮相;注射GTN后,大鼠血管舒張,為舒張相,本研究中GTN注射后1 h和2 h取材屬于舒張相。將收縮相、舒張相的差異蛋白進(jìn)行富集分析,結(jié)果表明,收縮相以氧化應(yīng)激反應(yīng)、ATP代謝過(guò)程為關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程,另有對(duì)鈣離子的響應(yīng)(Response to Calcium Ion)、對(duì)過(guò)氧化氫的反應(yīng)(Response to Hydrogen Peroxide)、過(guò)氧化氫分解代謝過(guò)程(Hydrogen Peroxide Catabolic Process)、ATP酶活性正調(diào)控(Positive Regulation of ATPase Activity)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)(Cellular Response to Oxidative Stress)、急性期反應(yīng)(Acute-phase Response)等生物學(xué)過(guò)程發(fā)生。見(jiàn)圖12。舒張相以瞬時(shí)受體電位(Transient Receptor Potential,TRP)通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)(Inflammatory Mediator Regulation of TRP Channels)、細(xì)胞黏附為關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程，另有氧化應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(Response to Endoplasmic Reticulum Stress)、過(guò)氧化氫分解代謝過(guò)程、維持血腦屏障的滲透性(Maintenance of Permeability of Blood-brain Barrier)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控(Negative Regulation of Apoptotic Process)、急性期反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程發(fā)生。見(jiàn)圖13。

圖12 收縮相富集分析

圖13 舒張相富集分析

3 討論

時(shí)相性偏頭痛大鼠模型繼承了硝酸甘油模型的優(yōu)點(diǎn),易于制備和復(fù)制,且同樣能在清醒狀態(tài)下觀察到大鼠的自主行為與行為學(xué)改變,同時(shí)基于血管源性學(xué)說(shuō),對(duì)于偏頭痛伴隨的先兆期-收縮相和發(fā)作期-舒張相有更好的擬合效果。

本研究基于時(shí)相性偏頭痛模型大鼠血管收縮相-舒張相的變化,選擇5個(gè)時(shí)間點(diǎn)和空白對(duì)照組的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果表明在偏頭痛發(fā)作過(guò)程中,大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中顯著表達(dá)的差異蛋白主要富集在氧化應(yīng)激反應(yīng)、代謝、TRP通道、炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)等相關(guān)生物學(xué)過(guò)程。在血管收縮相時(shí),偏頭痛大鼠整體處在氧化應(yīng)激的狀態(tài)中,血管持續(xù)收縮;在血管舒張相時(shí),偏頭痛大鼠發(fā)生TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程。提示偏頭痛大鼠在發(fā)病過(guò)程中存在炎癥反應(yīng)與能量代謝變化。

代謝過(guò)程是偏頭痛發(fā)作過(guò)程中的重要環(huán)節(jié),其中能量代謝對(duì)偏頭痛的發(fā)生和加重都具有影響,該假說(shuō)于1982年被提出,研究表明腦能量代謝障礙與偏頭痛的發(fā)作關(guān)系密切,其中線粒體酶功能異常是導(dǎo)致腦能量代謝障礙的常見(jiàn)原因[25-26]。偏頭痛的發(fā)病與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān),本研究結(jié)果提示偏頭痛可能在先兆期處于氧化應(yīng)激狀態(tài),激活的炎癥反應(yīng)或能量代謝異常導(dǎo)致偏頭痛的發(fā)生[27]。也有研究顯示硝酸甘油注射液誘導(dǎo)的偏頭痛模型大鼠體內(nèi)存在氧化應(yīng)激反應(yīng),抗氧化通路核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2/抗氧化響應(yīng)元件(Nuclear Factor-erythroid 2-related Factor 2/Antioxidant Response Element,Nrf2/ARE)被激活,疲勞狀態(tài)可以加重偏頭痛模型大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[28]。

偏頭痛的發(fā)作與TRP通道的動(dòng)態(tài)調(diào)控密切相關(guān)。TRP通道是位于細(xì)胞膜上的一類重要的陽(yáng)離子通道,參與疼痛、炎癥反應(yīng)、新陳代謝等各種生理和病理過(guò)程[29-30]。其中瞬時(shí)受體電位香草酸1(Transient Receptor Potential Vanilloid 1,TRPV1)和瞬時(shí)受體電位錨蛋白1(Transient Receptor Potential Ankyrin 1,TRPA1)是TRP通道大家族的成員,廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。TRPV1介導(dǎo)溫度覺(jué)和痛覺(jué),TRPA1常與TRPV1共表達(dá),感受傷害性冷刺激和疼痛感覺(jué)[31]。TRPV1和TRPA1可以被廣泛的內(nèi)源性和外源性刺激激活,產(chǎn)生降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin Generelated Peptide,CGRP)等神經(jīng)肽,并通過(guò)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多個(gè)信號(hào)通路參與偏頭痛的過(guò)程[32-33]。

人體在勞累、失眠或寒冷等刺激下,激活氧化應(yīng)激反應(yīng),激活三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元TRPA1/TRPV1通道及其調(diào)控因子磷脂酶B(Phospholipase B,PLB)、蛋白激酶A(Protein Kinase A,PKA)、PKG等,啟動(dòng)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),釋放CGRP、P物質(zhì)(Substance P,SP)等神經(jīng)遞質(zhì),并通過(guò)三級(jí)神經(jīng)元將傷害性信號(hào)向上傳遞至大腦皮質(zhì),導(dǎo)致頭痛[34-35];同時(shí)CGRP、SP等神經(jīng)遞質(zhì)不斷刺激肥大細(xì)胞脫顆粒,導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放,反饋刺激TRPA1/TRPV1不斷開(kāi)放,持續(xù)生成痛覺(jué)信號(hào),使頭痛越來(lái)越劇烈[36-37]。同時(shí)機(jī)體自我調(diào)控,通過(guò)激活內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng),升高抗氧化酶的活性,并產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)性蛋白,對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng),使大腦抗氧化能力恢復(fù)平衡,以緩解偏頭痛[38-39]。

偏頭痛的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及多種生物學(xué)過(guò)程,分子-機(jī)制隨疾病進(jìn)展而產(chǎn)生變化,可能與能量代謝、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、血管舒張和收縮等過(guò)程密切相關(guān),相關(guān)的TRP通道也是偏頭痛機(jī)制研究的重要方向。本研究同時(shí)體現(xiàn)了對(duì)發(fā)作-緩解類疾病動(dòng)態(tài)認(rèn)識(shí)的重要性,基于該思想的機(jī)制及干預(yù)療效研究,將推動(dòng)偏頭痛精準(zhǔn)醫(yī)療的進(jìn)展。

利益沖突聲明：無(wú)利益沖突。