孫永生，蔣欣陶，劉愛群，李凌欣，張逸鳴，劉靜，王國(guó)政*

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，遼寧 沈陽 110161；2.葫蘆島市南票區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 葫蘆島 125027；3.遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心，遼寧 沈陽 110161）

遼寧地處中國(guó)東北地區(qū)南部，四季分明，光照充足，晝夜溫差適度，非常適合保護(hù)地果菜類生產(chǎn)，尤其適合番茄生產(chǎn)。遼寧省番茄種植面積約2.91 萬hm2，占遼寧省蔬菜種植面積的32.4%[1]。由于種植模式單調(diào)，連作障礙、土傳病害逐年加重。同時(shí)由于種苗來源廣泛，土壤環(huán)境惡化，細(xì)菌性病害日趨盛行，遼寧省番茄主產(chǎn)區(qū)死秧問題呈逐年上升趨勢(shì)，造成番茄大幅減產(chǎn)，嚴(yán)重影響了番茄種植戶的收入和生產(chǎn)積極性。

近年來，遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院專家采集了省內(nèi)番茄主產(chǎn)區(qū)北票、莊河、黑山、建平、南票、遼中等地的番茄死秧植株，運(yùn)用鏡檢，采用病菌分離培養(yǎng)、致病性鑒定和分子鑒定的方法，鑒定造成番茄死秧的主要原因是番茄潰瘍病、枯萎病和根腐病以及根結(jié)線蟲病。研究發(fā)現(xiàn)，遼寧地區(qū)不同茬口抽樣番茄植株發(fā)病癥狀并不一致。越冬茬、早春茬口抽樣病株主要是番茄潰瘍病，潰瘍病的病原菌為密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis）。發(fā)病植株表現(xiàn)的主要癥狀是下部葉片首先發(fā)病，發(fā)病初期葉片邊緣出現(xiàn)褐色病斑，并伴有黃色暈圈，隨病情加重，病斑顏色加深變?yōu)楹诤稚?，并逐漸向內(nèi)擴(kuò)大，導(dǎo)致整個(gè)葉片黃化[2]。果實(shí)染病，果面出現(xiàn)網(wǎng)狀或大理石紋理。

秋延茬口抽樣病株死秧的主要原因是番茄枯萎病，其病原菌為尖胞鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。發(fā)病植株表現(xiàn)的癥狀是植株從近地面的葉序開始發(fā)病，逐漸向上蔓延。發(fā)病初期，植株中下部葉片出現(xiàn)枯萎，隨著病害發(fā)生，植株中上部葉片陸續(xù)發(fā)病，葉片萎蔫但不脫落，直至最后全株葉片枯萎發(fā)黃，整株枯死。造成遼寧地區(qū)番茄死秧的另一個(gè)主要病害就是番茄腐霉根腐病，其病原菌是瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）。發(fā)病植株的癥狀是植株莖基部及地面處呈褐色橢圓形病斑，濕度大時(shí)，病斑迅速向上、向下擴(kuò)展，1～2 d 后可繞莖一周，呈灰褐色變軟凹陷，病莖上部葉片迅速萎蔫。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，整個(gè)植株萎蔫或枯死。田間濕度大時(shí)莖基部呈水漬狀腐爛并長(zhǎng)出白色絮狀霉層，根部變黑、腐爛。

隨著病原菌鑒定技術(shù)的不斷更新，鑒定手段從形態(tài)學(xué)鑒定到分子生物學(xué)鑒定。番茄潰瘍病形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明，發(fā)病初期，葉片邊緣或葉脈間有淡綠色斑塊，呈水漬狀，隨后逐漸壞死變干，并擴(kuò)展至整個(gè)葉片。成株期發(fā)病，葉片從下至上葉緣褪綠變褐并向上卷曲，隨病情發(fā)展，葉柄或主莖上產(chǎn)生灰白色至灰褐色條狀枯斑，莖部開裂并壞死，剖莖可見髓部中空，維管束褐變，病害擴(kuò)展緩慢時(shí)，病莖略變粗，其表面生出較多不定根或刺狀突起，造成全株枯死，但果實(shí)未出現(xiàn)“鳥眼斑”；此外，把發(fā)病植株的發(fā)病部位做成切片，在顯微鏡下觀察，能看到有膿狀的液體在顯微鏡下緩慢移動(dòng)，據(jù)此斷定是細(xì)菌性病害。本研究分析了番茄死秧的具體原因以及形成番茄死秧問題的一套鑒定體系，為更準(zhǔn)確鑒定致病菌類型，還采用序列分析方法進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，以期為遼寧設(shè)施番茄生產(chǎn)中存在的死秧現(xiàn)象提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從遼寧省內(nèi)主要番茄產(chǎn)區(qū)采集番茄潰瘍病病葉、病果以及病莖，帶回實(shí)驗(yàn)室用于后續(xù)病菌分離[3]。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar，NA）：蛋白胨10.0 g，牛肉粉3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15～25 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0。

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（nutrient broth，NB）：蛋白胨10.0 g，牛肉粉3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0[4]。

1.2 儀器與設(shè)備

電磁爐，SH2128B，廣東美的生活電器制造有限公司；DTY-900 型超凈工作臺(tái)、過濾網(wǎng)，北京德天佑科技發(fā)展有限公司；搖床，HTS420，上海赫田科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

剪取染病葉片或莖段（壞死組織）病健交界處，置于培養(yǎng)皿內(nèi)。用75%酒精浸泡30 s，無菌水清洗2 遍，第一遍清洗后倒出無菌水，第二遍加少量無菌水清洗。用剪刀將其在無菌水中剪碎。用無菌接種環(huán)（或牙簽）在NA培養(yǎng)基表面劃線培養(yǎng)。然后置于細(xì)菌培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)72 h，當(dāng)培養(yǎng)基上出現(xiàn)單菌落時(shí)挑取單菌落于NB 液體培養(yǎng)基中，于260 r/min 的搖床中28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，用無菌水配制成濃度為1×108CFU/mL 的菌懸液，備用。

1.4 致病性的鑒定方法

1.4.1 病原菌的分離

選擇播種后培育21～28 d 的2～3 片真葉期番茄幼苗。用打頂法將番茄苗生長(zhǎng)點(diǎn)剪斷，選取兩片較大葉片，用剪刀剪一刀，噴菌懸液，然后保濕，葉片濕度保持在90%以上，以利于發(fā)病[5]。接種后14 d 開始觀察發(fā)病情況，如果接種潰瘍病菌的番茄植株均不同程度出現(xiàn)葉片萎蔫變黃、維管束變軟、莖壞死、植株死亡等典型細(xì)菌性潰瘍病癥狀時(shí)，認(rèn)為此病菌即是番茄死秧的致病菌。如果接種后14～28 d 內(nèi)沒有出現(xiàn)番茄潰瘍病的發(fā)病癥狀，認(rèn)為此病菌不是致病菌，要選擇新的單菌落做成菌懸液，重新做致病性鑒定[6]。

1.4.2 致病性的分子鑒定

取致病性鑒定成功后的單菌落，按照Dreier[6]報(bào)道的番茄細(xì)菌性潰瘍病菌一對(duì)特異性引物Cmm 5、Cmm 6（引物序列：Cmm 5 為5＇-GCGAATAAGCCCATAT-CAA-3＇；Cmm 6 為5＇CGTCAGGAGGTCGCTA-ATA-3＇），對(duì)1.4.1中分離物的菌懸液直接進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)采用25 μL 體系，包括細(xì)菌單菌落，10×PCR 緩沖液（含15 mmol/L Mg2+）2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL（每種dNTP 終濃度為200 μmol/L），10 μmol/L 上下游引物各1 μL（終濃度為200 nmol/L），5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.2 μL，加超純水至終體積為25 μL。

PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35 次循環(huán)；72 ℃延伸5 min。在1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，經(jīng)溴化乙錠染色后在紫外燈下觀測(cè)是否得到特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。如果得到特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，認(rèn)為此病菌即為番茄細(xì)菌性潰瘍病。

1.5 致病菌的鑒定方法

1.5.1 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃濕熱滅菌20 min。

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（potato sucrose agar，PSA）：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.5.2 病原菌的分離

將感病的番茄組織（根莖處）用75%酒精擦洗干凈，投入3%次氯酸鈉溶液中消毒，在病健組織交界處用消毒的解剖刀切取1～2 mm 的病組織小塊，然后用無菌水沖洗數(shù)次，最后用消毒的鑷子將組織小塊轉(zhuǎn)移到PDA 培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿放一塊病樣組織塊，將培養(yǎng)皿放入28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.3 致病性鑒定

取適量的番茄種子，用3%次氯酸鈉稀溶液浸泡消毒，然后用清水投洗，藥劑除干凈后，再用50～60 ℃的溫水浸種30 min 左右，撈出后用清水浸種，用紗布將種子包好，然后放置到28 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)催芽，定期投洗，待胚根露出白頭后開始播種。將種子播到滅菌的育苗土中，待2～3 片真葉展平時(shí)，用濃度為105個(gè)孢子/mL 的孢子懸浮液浸根接種，放置到相對(duì)濕度大于85%的保濕棚中，7 d 后進(jìn)行病害調(diào)查[7-8]。對(duì)發(fā)病植株按照柯赫氏法則進(jìn)行病原菌再次分離與鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 遼寧地區(qū)番茄死秧的致病菌確定

一是番茄潰瘍病。遼寧省內(nèi)主要番茄產(chǎn)區(qū)采集的番茄潰瘍病樣，并從中分離獲得純化菌株。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，證實(shí)所得菌株均為密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種（Cmm）。這與其它地區(qū)所報(bào)道的番茄潰瘍病菌一致[7-8]。然而，本鑒定方法采集的樣本僅來自遼寧省，存在一定局限性。但引起番茄潰瘍病的病原菌并沒有生理小種分化，只是致病力有所差異。這與前人的研究基本一致[9-11]。二是番茄枯萎病和根腐病。首先，通過觀察植株的表現(xiàn)癥狀，番茄整株萎蔫，觀察近地面莖部腐爛程度，莖基部腐爛初步認(rèn)定為根腐病，枯萎病莖基部不腐爛，剖開近地面的莖，如果維管束變褐，初步認(rèn)定是枯萎病，枯萎病只有近地面部分維管束變褐而不是整個(gè)植株維管束都變褐。然后通過顯微鏡鏡檢認(rèn)定是鐮刀菌，最后通過形態(tài)學(xué)和分子鑒定。

2.2 遼寧地區(qū)番茄死秧致病菌的致病性

2.2.1 病原菌的形態(tài)觀察

發(fā)病菌株在PDA 培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)5 d，挑取菌絲轉(zhuǎn)移至PSA 培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)，4 d 后觀察菌落形態(tài)及顏色的變化，記錄菌落直徑；觀察大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子形狀及著生方式，產(chǎn)孢細(xì)胞形態(tài)特征，分生孢子座的產(chǎn)生等情況，測(cè)量30～50 個(gè)大型分生孢子和小型分生孢子的長(zhǎng)度和寬度[12-13]。

2.2.2 病原菌及病害的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定

發(fā)病菌絲在PSA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d 后，菌落平均直徑為4.0 cm，菌株間存在差異，氣生菌絲絨狀或氈狀，白色或粉色，常帶有紫色或紅色。小型分生孢子較多，卵形或腎形，0～1 個(gè)隔膜，假頭狀著生在產(chǎn)孢細(xì)胞上，大小5～11.5 μm×2～4 μm。大型分生孢子美麗型，較勻稱，基細(xì)胞足跟明顯，多數(shù)為3～4 個(gè)隔膜，大小13～38 μm×2.3～4.5 μm。厚垣孢子頂生或串生，球形。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗，較短，單生或具分枝。表現(xiàn)出尖孢鐮刀菌的特征，初步鑒定為番茄枯萎病。

如果發(fā)病菌絲在PSA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d 后，菌落平均直徑為3.9 cm，氣生菌絲較少，薄絨狀，白色至淺灰色；背面在菌落中心形成褐色。小型分生孢子數(shù)量多，假頭狀著生，卵形或腎形，大小5.5～11 μm×2.2～4 μm。大型分生孢子馬特型，兩端較鈍，頂胞稍彎。2～8 個(gè)隔膜，大小10～60 μm×3～4.9 μm。厚垣孢子球形，單生、對(duì)生、頂生或串生。產(chǎn)孢細(xì)胞較長(zhǎng)，長(zhǎng)筒形，單瓶梗，大多數(shù)瓶梗長(zhǎng)于50 μm，可達(dá)到200 μm?？僧a(chǎn)生土黃色分生孢子座。表現(xiàn)出茄病鐮刀菌的特征，初步鑒定為番茄根腐病。

（2）分子鑒定

選取51 株代表菌株進(jìn)行分子鑒定。采用CTAB 法提取菌株基因組DNA。利用真菌核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）通用引物ITS1 和ITS4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL：模板DNA 2 μL（10～50 μg/L），ITS1 和ITS4 引物各1 μL（10 μmol/L），Mix 25 μL，ddH2O 21 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送測(cè)序公司測(cè)序。通過NCBI 核酸數(shù)據(jù)中的BLAST 程序，提交測(cè)定得到的ITS-r DNA 序列與GENBANK 中核酸序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)經(jīng)形態(tài)鑒定的種類進(jìn)行分子驗(yàn)證[14]，進(jìn)而鑒定為番茄枯萎病和根腐病。

3 番茄死秧的綜合防控措施

3.1 選用抗病或耐病品種

選用抗病或耐病品種是植物病害防治最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一。選擇抗枯萎病和根腐病的番茄品種，如‘維也納F1’‘奧地利2 號(hào)’‘吉麗2 號(hào)’‘羅拉’等。

3.2 種子消毒

種子消毒是防治番茄潰瘍病的有效途徑之一。先把種子放在35～38 ℃溫水預(yù)熱8～10 min，后放在55 ℃熱水浸種30 min，待水溫下降到室溫再浸泡20 min，清洗干凈，于25～28 ℃恒溫箱催芽；或用0.5%的消毒劑1 號(hào)浸泡種子1 h，撈出后用清水沖洗30 min 后播種；或用3%次氯酸鈉浸種20 min 后用清水洗凈藥液，稍晾干后再催芽播種。

3.3 藥劑防治

在定植時(shí)，使用防治鐮刀菌和細(xì)菌的藥劑蘸根或灌根，可選用甲霜·噁霉靈加四霉素灌根或者咯菌腈加硫酸銅鈣灌根。定植后10～15 d 使用以上藥劑灌根一次。定植后25～30 d 使用以上藥劑再灌根一次，防治效果非常好。

根結(jié)線蟲可以通過對(duì)不同殺線蟲藥劑單劑和復(fù)配藥劑的篩選，篩選出遼寧地區(qū)防治線蟲效果比較好的藥劑是41.7%氟吡菌酰胺（路富達(dá)）、5%氟鈴脲+30%噻蟲胺、3%辛硫磷+5%阿維菌素。

3.4 培育健壯植株

培育健壯植株是解決土傳病害的一種常見方法，也是植株抵御外界病原菌侵染的一種有效方法[15]。從蔬菜栽培角度，防治病害最實(shí)用的方法就是培育健壯植株，提高植株免疫力。首先要培育健壯的苗，其次是培養(yǎng)發(fā)達(dá)的根系，最后在植株生長(zhǎng)期調(diào)節(jié)好莖葉和果實(shí)之間的平衡生長(zhǎng)。

3.5 嫁接

嫁接是防治土傳病害最主要的措施之一[16-18]。選擇抗鐮刀菌的番茄砧木嫁接可以降低枯萎病和根腐病的發(fā)生。由于番茄嫁接常用的砧木是番茄，篩選抗病砧木比較困難，嫁接成本也高，所以番茄嫁接技術(shù)在遼寧省內(nèi)應(yīng)用并不廣泛。

3.6 土壤消毒

土壤消毒是防治土傳病害、細(xì)菌性病害和根結(jié)線蟲的重要方式。目前生產(chǎn)中比較常用的土壤消毒劑是氰胺化鈣、棉隆和威百畝。氰氨化鈣作為一種高效的土壤消毒劑，可有效地防治鐮刀菌屬引起的番茄枯萎病、根腐病和線蟲。棉隆是一種光譜性的土壤熏蒸、消毒劑，低毒、使用范圍廣，在土壤中能分解出異硫氰酸甲酯、甲醛和硫化氫等，這些氣體能迅速擴(kuò)散至土壤團(tuán)粒間，能殺滅土壤中的細(xì)菌、真菌和線蟲。威百畝是一種低毒、高效、使用范圍廣的農(nóng)藥，在土壤中降解產(chǎn)生異硫氰酸甲酯，能有效殺滅土壤中的真菌、細(xì)菌和線蟲[19]。使用氰氨化鈣和棉隆熏蒸消毒時(shí)，注意澆水不易過多，土壤含水量60%～70%即可，土壤含水量過多，氣體在土壤里不易流動(dòng)，影響消毒效果。土壤消毒還需要盡量提高棚內(nèi)溫度和土壤溫度、延長(zhǎng)消毒時(shí)間，提高土壤消毒劑的利用率和使用效果。

3.7 施用生防菌劑

生防菌劑作為一種環(huán)境友好型的防治土傳病害的方法，已經(jīng)在生產(chǎn)中被廣泛的應(yīng)用。目前遼寧地區(qū)生產(chǎn)中應(yīng)用比較多的是熒光假單胞桿菌500～670 g/667 m2，M22 枯草芽孢桿菌500 g/667 m2[20]，哈茨木霉菌T～22 用量1 000 g/667m2，l0 億孢子枯草芽孢桿菌可濕性粉劑500 倍液灌根。

4 小結(jié)

番茄死秧問題已成為阻礙遼寧省設(shè)施番茄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要問題之一，部分地區(qū)、部分番茄種植戶談番茄色變，遇到番茄死秧，束手無策。遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜栽培、植物保護(hù)、土壤與肥料專家聯(lián)合攻關(guān)，對(duì)遼寧省番茄死秧問題進(jìn)行了細(xì)致的研究與分析，基本摸清了遼寧省番茄死秧的主要原因，并提出了科學(xué)的防治方法。解決遼寧地區(qū)番茄死秧問題，重在通過選擇抗病品種、種子消毒，定植后的藥劑防治、培育健壯植株、選擇抗病砧木嫁接、土壤消毒及有效利用生防菌劑的綜合防治措施。