曹祚 羅世城 張攻孜 伍盛鑫 陳浩彬 張立海

骨質(zhì)疏松癥 (osteoporosis) 是由于多種原因?qū)е碌墓敲芏群凸琴|(zhì)量下降，骨微結(jié)構(gòu)破壞，造成骨脆性增加，從而容易發(fā)生骨折的全身性骨病[1-3]。骨質(zhì)疏松已成為困擾老年人群的主要疾病，其發(fā)病率已經(jīng)緊隨糖尿病、阿爾茨海默病，躍居老年病第三位[4]。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診療指南指出炎性疾病也是骨丟失的重要危險(xiǎn)因素，包括炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)、系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥、自身免疫性疾病 [ 如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis，RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (systemic lupus erythematosus，SLE) ]等[5]。Abu-Amer 等[6]指出脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS) 通常被認(rèn)為是溶骨性病變發(fā)病機(jī)制的核心，但是這種物質(zhì)促進(jìn)骨吸收的機(jī)制尚不清楚。LPS 作為常見的內(nèi)毒素起到關(guān)鍵作用，在體內(nèi)可以通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等，合成和釋放多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，進(jìn)而引起機(jī)體一系列的反應(yīng)。破骨細(xì)胞是骨吸收的主要功能細(xì)胞，是由骨髓中的髓系祖細(xì)胞分化而成的單核巨噬細(xì)胞相互融合所形成的多核巨細(xì)胞，在骨發(fā)育、生長(zhǎng)、修復(fù)、重建中具有重要的作用[7]，破骨細(xì)胞過度形成是炎癥性骨破壞的重要病理特征之一，且與 LPS 介導(dǎo)的炎性骨丟失密切相關(guān)[8]。研究表明，LPS 能刺激 CD4+T 細(xì)胞分化[9]，同時(shí) CD4+T 細(xì)胞刺激誘導(dǎo)破骨細(xì)胞[10]，盡管有研究表明 LPS 能刺激破骨細(xì)胞生成[11]及 T 細(xì)胞分化，但發(fā)揮作用的 T 細(xì)胞亞群及途徑尚未明確。為了進(jìn)一步探討 LPS 刺激 T 細(xì)胞的分化以及其對(duì)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化增殖的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用 LPS介導(dǎo)炎性骨丟失模型提取骨髓血中 T 細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)以及細(xì)胞共混培養(yǎng)的方法來探索發(fā)揮作用的T 細(xì)胞亞群及其機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性 C57bl / 6 小鼠 10 只 (購(gòu)于解放軍總醫(yī)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)，8 周齡，體重 17.8～18.8 g，平均 17.3 g。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK (軍)2017-2019。本研究已獲解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn) (2019-X15-44)。

二、主要試劑、材料和儀器

采用成骨細(xì)胞和單核細(xì)胞以及 RAW264.7 細(xì)胞誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞及配套專用培養(yǎng)基 (武漢普諾賽生命科技有限公司)，PerCP / Cyanine5.5 anti-mouse CD3 (Biolegend)，F(xiàn)ITC anti-mouse CD4 (Biolegend)，PE anti-mouse IL-17A (Biolegend)，APC anti-mouse TNF-α (Biolegend)，小鼠白介素 17A (interleukin-17A，IL-17A) 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 試劑盒 (武漢基因美科技有限公司)，抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartaric acidic phosphatase，TRAP) 試劑盒 (Sigma)，4% 多聚甲醛(Coolaber)，渦旋振蕩儀 (海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，分光光度計(jì) (Therno scientific)，離心機(jī) (Eppendorf)，酶標(biāo)儀 (北京凱奧公司)，激光共聚焦顯微鏡 (OLYMPUS FV1000-1X81)，micro-CT 設(shè)備 (SIEMENS)，影像數(shù)據(jù)分析軟件 Inveon Research Workplace (SIEMENS)，脫水機(jī) (武漢俊杰電子有限公司)，包埋機(jī) (武漢俊杰電子有限公司)，石蠟切片機(jī) (Leica)，凍臺(tái) (武漢俊杰電子有限公司)，組織攤片機(jī) (浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)，烤片機(jī) (常州國(guó)華電器有限公司)，烤箱 [ 邦西儀器科技 (上海) 有限公司 ]，倒置顯微鏡 (Nikon)，NikonCi-S 成像系統(tǒng) (Nikon)。

三、動(dòng)物及細(xì)胞分組

動(dòng)物分組：將 10 只雌性 C57bl / 6 小鼠編號(hào)后完全隨機(jī)分為兩組，LPS 組和對(duì)照組。LPS 組按2.5 mg / kg 隔天腹腔注射，對(duì)照組注射等量生理鹽水，共計(jì) 28 天。

細(xì)胞分組：將 Th17 TNF-α+細(xì)胞、CD4+IL-17-細(xì)胞分離出來，分別與成骨細(xì)胞、單核細(xì)胞體系及RAW264.7 細(xì)胞系進(jìn)行共混培養(yǎng)。

四、micro-CT 影像掃描及數(shù)據(jù)分析

小鼠安樂死后取右側(cè)股骨，經(jīng) 4% 多聚甲醛固定，隔夜后去除多余軟組織，將股骨固定于掃描管內(nèi)，調(diào)整三維位置，使用 micro-CT 進(jìn)行掃描 (掃描條件：60 kV、500 μA，分辨率為 9.08)，掃描數(shù)據(jù)以 DICOM 格式存儲(chǔ)。將掃描的影像數(shù)據(jù)導(dǎo)入影像分析軟件，分析股骨遠(yuǎn)端距離干骺端 0.5～1.0 mm 處，主要包括骨密度 (bone mineral density，BMD) 以及骨微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)中骨體積分?jǐn)?shù) (bone volume fraction，BV / TV)、骨小梁數(shù)目 (trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度 (trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁空隙 (trabecular separation，Tb.Sp)。

五、小鼠股骨干骺端 TRAP 染色

將固定好的股骨放在乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA) 脫鈣試劑里，密封，脫色搖床脫鈣。把脫鈣后的股骨放入包埋模中，將股骨梯度乙醇脫水，透明，浸蠟；組織切面向下包埋，待蠟塊冷卻后從模具中取出，修塊。待切片、烤片等工作完成后，按下列操作進(jìn)行 TRAP染色：二甲苯 10 min；二甲苯 10 min；二甲苯∶無水乙醇 = 1∶1，2 min；無水乙醇 5 min；90% 乙醇2 min；70% 乙醇 2 min；水洗 2 min；自然晾干，TRAP 固定液 4° 固定 3 min；水洗，晾干；浸入TRAP 孵育液，置于 37 ℃ 溫箱，浸染 60 min，水洗；復(fù)染：甲基綠染色液 3 min。水洗，晾干，中性樹膠封固。染色完成后切片顯微鏡拍照并對(duì)破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)。骨組織中的破骨細(xì)胞呈紫紅色。

六、流式細(xì)胞術(shù)

取小鼠骨髓血，加入含有 5% 胎牛血清 (fetal bovine serum，F(xiàn)BS) 和雙抗的 1640 培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為 107個(gè) / ml 備用。將檢測(cè)管加入細(xì)胞懸液100 μl，加入熒光標(biāo)記抗體，混勻后常溫避光反應(yīng)20 min；加入 0.5 ml 固定液，常溫避光放置 20 min；PBS 洗滌后加入合適量的細(xì)胞因子熒光標(biāo)記抗體混合均勻后，室溫避光反應(yīng) 30 min；沖懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析。

七、細(xì)胞共混培養(yǎng)

將 Th17 TNF-α+細(xì)胞以及 CD4+IL-17-細(xì)胞分別與成骨細(xì)胞 (osteoblasts) + 單核細(xì)胞 (monocytes)和 RAW264.7 細(xì)胞共混培養(yǎng)。細(xì)胞鋪板 24 孔板，以10% 的濃度分別加入破骨細(xì)胞前體培養(yǎng)液 (α-MEM +10% FBS + 100 U / ml 青霉素 + 100 μg / ml 鏈霉素 +35 ng / ml 巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (macrophage colonystimulating factor，M-CSF) (注：RAW264.7 細(xì)胞共培養(yǎng)體系中不加) 及 40 ng / ml 鼠重組核因子 κ-B 配體受體致活劑 (receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL) 處理 Osteoblasts + Monocytes 或者 RAW264.7 細(xì)胞 3 天，然后分別與各組的 Th17 TNF-α+細(xì)胞以及 CD4+IL-17-細(xì)胞共培養(yǎng) 4 天[12]。結(jié)束實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

八、炎癥細(xì)胞因子檢測(cè)

麻醉后眼球取血約 1.2 ml，離心后取上清，檢測(cè)采取酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，按照試劑說明書進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè) IL-17A 的表達(dá)。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 Graphpad prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)分析，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、LPS 介導(dǎo)骨丟失現(xiàn)象，破骨細(xì)胞變化和血清 IL-17A 變化

LPS 組小鼠的 BMD 顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜ 0.05)，BV / TV、Tb.N、Tb.Sp 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜ 0.05)，兩組小鼠 Tb.Th 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞ 0.05)。TRAP 染色結(jié)果，骨組織中的破骨細(xì)胞呈紫紅色，LPS 組小鼠股骨干骺端破骨細(xì)胞增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜ 0.05)。血清 ELISA 結(jié)果表明 LPS組IL-17A 有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.01) (圖1)。

二、骨髓血中 Th17 TNF-α+ 細(xì)胞表達(dá)增多

為了確定在骨髓血中潛在的具有促進(jìn)破骨細(xì)胞分化能力的 CD4+T 細(xì)胞亞群的性質(zhì)，分離 LPS組及對(duì)照組骨髓血中的 CD4+T 細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明 LPS 組的 Th17 TNF-α+/CD4+T 細(xì)胞比例明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。

三、Th17 TNF-α+ 細(xì)胞與兩種破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系共培養(yǎng)結(jié)果

將 LPS 誘導(dǎo)骨丟失小鼠骨髓中的 Th17 TNF-α+細(xì)胞，CD4+IL-17-細(xì)胞分離出來，與成骨單核細(xì)胞系及 RAW264.7 細(xì)胞系共培養(yǎng)，TRAP 染色結(jié)果顯示，Th17 TNF-α+細(xì)胞刺激破骨細(xì)胞分化數(shù)量增加(P＜ 0.05)，F(xiàn)-actin 環(huán)結(jié)果顯示，表明破骨細(xì)胞功能增強(qiáng) (P＜ 0.05) (圖3)。

圖3 a：TRAP 染色，Th17 TNF-α+ 細(xì)胞組顯示破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多；b：F-actin 結(jié)果，Th17 TNF-α+ 細(xì)胞組顯示破骨細(xì)胞 F-actin 環(huán)相對(duì)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；c：TRAP 染色觀察破骨細(xì)胞數(shù)目、肌動(dòng)蛋白環(huán)熒光強(qiáng)度的定量Fig.3 a: TRAP staining, the Th17 TNF-α+ cell group showed a significant increase in the number of osteoclasts; b: F-actin, the relative fluorescence intensity of F-actin ring in the Th17 TNF-α+ cells group was increased; c: TRAP staining to observe the number of osteoclasts and the fluorescence intensity of actin rings

討 論

骨質(zhì)疏松癥是重大的公共衛(wèi)生問題，發(fā)病率在我國(guó)逐年增加，骨質(zhì)疏松癥是一種骨密度降低和骨微結(jié)構(gòu)缺失的骨骼疾病，最嚴(yán)重的并發(fā)癥是骨折[13]。高昂的經(jīng)濟(jì)成本、逐年升高的發(fā)病率和病死率使骨質(zhì)疏松癥的早期預(yù)防和治療成為亟待解決的醫(yī)療難題[14]。炎癥性疾病作為骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素，有望成為骨質(zhì)疏松癥治療的重要靶點(diǎn)[15-16]。微生物及其產(chǎn)物與炎癥因子被認(rèn)為在炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，其中LPS 作為革蘭氏陰性細(xì)菌的重要組成部分，可以刺激機(jī)體炎性反應(yīng)的增強(qiáng)[17]。然而，LPS 參與炎癥性疾病誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的活化和骨丟失的具體機(jī)制尚不明確，缺乏 LPS 誘導(dǎo)系統(tǒng)性骨丟失的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究中使用 LPS 介導(dǎo)骨丟失模型，利用流式細(xì)胞術(shù)分選出 Th17 TNF-α+亞群，并明確了其在刺激破骨細(xì)胞的生成和調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

LPS 是一種存在于細(xì)菌細(xì)胞壁的高度免疫原性的分子，有研究表明，在人體中，LPS 通過與 Toll樣受體 4 (toll-like receptor 4，TLR4) 結(jié)合，激活固有免疫信號(hào)通路，增加炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而造成骨丟失[18-19]。有文獻(xiàn)指出，在膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者的血清和關(guān)節(jié)液中，都檢測(cè)到了 LPS，發(fā)現(xiàn) LPS與膝關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度及滑膜中巨噬細(xì)胞的活化都有著密切關(guān)系[20]。還有文獻(xiàn)報(bào)道，LPS 能促進(jìn)間隙鏈接蛋白 43 (connexin 43) 的表達(dá)，從而使破骨細(xì)胞的生成增多，導(dǎo)致骨吸收能力增強(qiáng)[21]。目前研究認(rèn)為 LPS 與 TLR4 的結(jié)合促進(jìn)了機(jī)體炎癥因子水平的表達(dá)和 M-CSF、RANKL 信號(hào)的激活，從而誘導(dǎo)了破骨細(xì)胞的分化，但缺乏相關(guān)的研究證明 LPS 與 TLR4的結(jié)合對(duì) T 淋巴細(xì)胞亞群在極化過程中的影響，TLR4 的激活與免疫系統(tǒng)的活化之間的聯(lián)系尚不明確[22]。本研究結(jié)果顯示，在 LPS 注射 1 個(gè)月后，相較于對(duì)照組，LPS 組小鼠骨丟失明顯增加，破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加，骨吸收作用明顯增強(qiáng)，這與之前的研究一致[23-24]，表明 LPS 是造成骨丟失的重要致病因素。LPS 組小鼠炎癥因子 IL-17A 的表達(dá)顯著升高，提示 Th17 細(xì)胞在這一過程發(fā)揮了作用。

T 淋巴細(xì)胞是骨重塑過程中的關(guān)鍵參與者，其產(chǎn)生的 RANKL 和 TNF-α 在許多病理和炎癥狀態(tài)下會(huì)導(dǎo)致骨破壞[25-26]。Th17 細(xì)胞是一種 T 淋巴細(xì)胞亞群，主要分泌 IL-17、IL-21 等，具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能。在骨代謝中，Th17 細(xì)胞被認(rèn)為是促進(jìn)骨丟失的關(guān)鍵細(xì)胞類型之一，Th17 細(xì)胞參與破骨細(xì)胞的活化和分化，釋放多種骨吸收因子如 RANKL、M-CSF等，導(dǎo)致骨質(zhì)流失[27]。還有文獻(xiàn)指出，Th17 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可以刺激成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生其它炎癥介質(zhì)，如前列腺素 E2、白介素-1β 和 TNF-α，從而間接促進(jìn)骨吸收[28]。此外，與其它炎癥性骨病 (RA、OA 等) 類似，Th17 / IL-17 軸還參與了牙周炎的發(fā)病機(jī)制[29-30]。本研究流式結(jié)果表明，Th17 TNF-α+細(xì)胞比例明顯增多，提示其在調(diào)控破骨細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用，為此筆者將 Th17 TNF-α+細(xì)胞和 CD4+IL-17-細(xì)胞與兩種破骨細(xì)胞誘導(dǎo)體系即成骨細(xì)胞、單核細(xì)胞體系，RAW264.7 細(xì)胞體系共混培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn) Th17 TNF-α+細(xì)胞不僅能夠誘導(dǎo) RAW264.7 細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞，還能夠增加RANKL 和 M-CSF 的外源性受體激活劑誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化。無論是在成骨細(xì)胞、單核細(xì)胞體系還是RAW264.7 細(xì)胞體系，與 Th17 TNF-α+細(xì)胞共培養(yǎng)中的破骨細(xì)胞的 F-actin 環(huán)的光強(qiáng)度更強(qiáng)，表明破骨細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移、吞噬等方面的功能更強(qiáng)。這些結(jié)果加強(qiáng)了炎癥、骨丟失與 Th17 TNF-α+細(xì)胞活性之間的聯(lián)系，炎癥環(huán)境募集了 Th17 細(xì)胞，刺激了破骨細(xì)胞的分化，從而導(dǎo)致骨丟失的惡性循環(huán)。

綜上所述，LPS 能刺激 Th17 TNF-α+細(xì)胞亞群的比例增高，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖分化，深入研究 LPS 與 Th17 細(xì)胞之間的相互作用，有助于深入理解免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，今后可能成為抑制炎癥造成骨丟失的潛在治療靶點(diǎn)。但本研究尚存在一些局限性，后續(xù)研究需進(jìn)一步探索 Th17 的細(xì)胞相關(guān)分子機(jī)制。