劉源，惠以寧，姜冰，鄭艮子，王瑤

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院預(yù)防保健科，四川 瀘州（646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所，四川 瀘州（646000）；3.口頜面修復(fù)重建和再生瀘州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州（646000）；4.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州（646000）

人牙髓干細(xì)胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）是來源于人恒牙/乳牙牙髓的外胚層間充質(zhì)干細(xì)胞，適當(dāng)誘導(dǎo)下具有良好的多向分化能力，為組織再生提供細(xì)胞來源［1］。研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可影響hDPSCs增殖，低濃度LPS 促進(jìn)hDPSCs 合成期細(xì)胞增多，促進(jìn)其增殖、遷移；高濃度LPS 可使hDPSCs DNA 總量減少、蛋白合成降低、增殖能力降低、抑制堿性磷酸酶能力活性，減弱成骨向分化能力，嚴(yán)重可引起細(xì)胞死亡［2-3］。因此，積極探索有利于LPS 所致炎性環(huán)境下hDPSCs 分化的細(xì)胞干預(yù)條件，有助于為骨再生和牙齒再生提供新的治療思路。

發(fā)光二極管（light-emitting diode，LED）紅光亮度高、方向性強(qiáng)、相干性好，可對研究對象施加照射后產(chǎn)生光化學(xué)效應(yīng)，不會(huì)造成局部溫度明顯提高，并且不會(huì)對組織或細(xì)胞造成不可逆損傷［4］。有實(shí)驗(yàn)研究表明，LED 紅光影響牙髓干細(xì)胞生長速率、克隆潛能以及成骨和軟骨細(xì)胞分化［5］。由此可見LED 紅光可對牙髓干細(xì)胞的分化產(chǎn)生影響，但LED 紅光對LPS 所致炎性環(huán)境下hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)分化的影響鮮有報(bào)道。

細(xì)胞的分化受到信號(hào)通路和細(xì)胞因子的調(diào)控，有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)誘導(dǎo)的核反應(yīng)，有4 個(gè)亞族：細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶5（extracellular regulated protein kinases 5，ERK5），在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子，調(diào)節(jié)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)中起著重要作用［6］。本實(shí)驗(yàn)擬通過LPS 構(gòu)建體外炎性環(huán)境，探究LED 紅光調(diào)控hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)分化及作用機(jī)制，為牙和頜骨缺損修復(fù)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

本實(shí)驗(yàn)已通過西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理審批（批號(hào)：20211119003）。

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM（BI，以色列）；優(yōu)級胎牛血清（四季青生物，中國）；0.25%胰酶細(xì)胞消化液（碧云天生物，中國）；LPS（索萊寶，中國）；BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（碧云天生物，中國）；0.2%茜素紅染液（索萊寶，中國）；一抗（鼠抗人）：CD34-APC、CD44-PE、CD45-FITC、CD73-PE、CD90-PE 抗 體（Ebioscience，美國）；二抗（羊抗鼠）：HRP-Goat anti Mouse（ASPEN，中國）；一抗（兔抗人）：GAPDH（ab181602, Abacam，英國）、JNK、p-JNK（#9252，#4668，CST，美國）、p38、p-p38（AF6456，#4511，Affbiotech，美 國）、ERK1/2、p - ERK1/2（ab184699，ab201015，Abacam，英國）、ERK5、p-ERK5（#3552，#3371，CST，美國）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）（ab133602，Abacam，英國）、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（osterix，OSX）（DF7731，Affbiotech，美國）、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1（dentin matrix protein-1，DMP-1）（PA5-120492，Thermofisher，美國）、牙本質(zhì)涎 磷 蛋 白（dentin sialo phospho protein，DSPP）（DF14398，Affbiotech，美國）；二抗（羊抗兔）：HRPGoat anti Rabbit（AS1107，ASPEN，中 國）；U0126（MCE，美國）；SB203580（MCE，美國）；SP600125（MCE，美國）；BIX02189（MCE，美國）；CCK-8 試劑盒（APExBIO，美國）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）（碧云天生物，中國）；堿性磷酸酶檢測試劑盒（碧云天生物，中國）；SYBR Green PCR 試劑盒（ELK，中國）；ELISA 試劑盒（凡科維，中國上海）；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（碧云天生物，中國）。LED 紅光燈（T6，芮森，中國）；酶聯(lián)免疫檢測儀（MultiskanTMFC，Thermo，美國）；倒置相差熒光顯微鏡（DMi8，Leica，德國）；熒光定量PCR 儀（QuantStudio6 Flex System，Life Technologies，美國）；SDSPAGE 電泳儀（165-8000，Bio rad，美國）。

1.2 hDPSCs 的分離、培養(yǎng)、鑒定

取西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科拔除的新鮮健康的第三磨牙或因正畸治療需要拔除的前磨牙，用含20%（v/v）青霉素-鏈霉素的PBS 清洗至無明顯血污，無菌條件下沿牙髓長軸劈開，拔髓針取出牙髓組織，PBS 沖洗后眼科剪剪碎組織，Ⅰ型膠原酶消化、終止、離心重懸后得到單細(xì)胞懸液。加入含15%（v/v）青霉素-鏈霉素FBS、1%（v/v）青霉素-鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)，隔3 d 半換液。細(xì)胞長出后記為原代，當(dāng)生長密度達(dá)80% ～85%時(shí)，用胰酶消化傳代，取生長狀態(tài)好的P3 代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取第3 代細(xì)胞，適量PBS 重懸細(xì)胞，各加入CD34-APC、CD44-PE、CD45-FITC、CD73-PE、CD90-PE 抗體，避光條件下孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測表面抗原標(biāo)志物。取第3 代細(xì)胞以2×104個(gè)/mL 密度接種于6 孔板中，待細(xì)胞長至80%密度后開始成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)。誘導(dǎo)7 d 行ALP 染色，21 d 行茜素紅染色和油紅O 染色，并分別采集鏡下圖。

1.3 LPS 濃度篩選

hDPSCs 經(jīng)0.25%胰酶消化，離心，終止后以2×103個(gè)/孔、200 μL/孔均勻接種細(xì)胞至96 孔板中，接種完畢后在接種有細(xì)胞的孔周圍封閉一圈PBS。37 ℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)過夜后，次日更換為含不同濃度LPS（0、1、5、10 μg/mL）的普通培養(yǎng)基，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，隔2 d 換液。分別于培養(yǎng)第1、3、5、7 天同一時(shí)間使用CCK-8 試劑盒檢測細(xì)胞增殖活力，使用酶標(biāo)儀測定在450 nm 波長處OD 值。

1.4 LED 紅光能量測定

根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)測量［7］，當(dāng)LED 紅光發(fā)射燈距離高精度光功率計(jì)2 cm 時(shí)，根據(jù)公式：光功率密度（W/cm2）=光總功率（W）/單位面積（cm2），測定光功率密度為66.7 mW/cm2，通過公式輻照曝光量（J/cm2）=光功率密度（W/cm2）×?xí)r間（s），計(jì)算得出輻照曝光量分別為2、4、6、8、10 J/cm2時(shí)，所需輻照時(shí)間為30、60、90、120、150 s。輻照第一天記為1 d，隔48 h 輻照一次。

1.5 LED 紅光對炎癥環(huán)境下hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)分化的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)1.3 結(jié)果，10 μg/mL 為后續(xù)LPS 刺激濃度。設(shè)置CG（礦化誘導(dǎo)）組、LPS+CG 組及LPS+CG+不同能量（2、4、6、8、10 J/cm2）光照組；礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基為10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+50 μg/mL 維生素C+10 mol/L 地塞米松+10%（v/v）FBS+1%（v/v）青霉素-鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)基。hDPSCs 經(jīng)0.25%胰酶消化、終止、離心后，加入完全培養(yǎng)基以2×104個(gè)/mL 密度接種至培養(yǎng)皿中，細(xì)胞融合至70%后按分組加入相應(yīng)誘導(dǎo)液并進(jìn)行光照。

1.5.1 ALP 染色及活性測定 細(xì)胞處理第7 天根據(jù)BCIP/NBT 顯色試劑盒說明書，細(xì)胞清洗、固定后進(jìn)行堿性磷酸酶避光染色15 min，倒置顯微鏡下采集各組圖像。處理第7 天，細(xì)胞漂洗后每皿加入細(xì)胞裂解液，12 000 rpm 離心5 min，收集總蛋白溶液。根據(jù)BCA 試劑盒說明書，酶標(biāo)儀測定波長為562 nm 的各孔OD 值，繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算各處理組蛋白濃度。根據(jù)堿性磷酸酶檢測試劑盒說明書，96 孔板設(shè)置空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔以及樣品孔并加入相應(yīng)工作液，每孔設(shè)置2 個(gè)副孔。輕吹混勻后37 ℃孵育10 min，酶標(biāo)儀測定波長為450 nm 的各孔OD 值。根據(jù)公式計(jì)算各處理組ALP 活性。

1.5.2 qRT-PCR 檢測hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)分化相關(guān)基因 細(xì)胞處理第7 天，Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，將已提取的總RNA 65 ℃變性5 min，立即轉(zhuǎn)入冰上操作。依次加入2 μL 的5*RT Master Mix、RNA template，Nuclease-free Water 補(bǔ) 足 至10 μL。溶解混勻后，以37 ℃，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min；4 ℃程序進(jìn)行反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)SYBR Green PCR 試劑盒說明書進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng) 程 序 為：95 ℃，3 min；95 ℃，5 s；56 ℃，10 s，72 ℃，25 s，循環(huán)40 次；65 ℃，5 s；95 ℃，50 s。引物序列見表1。根據(jù)公式2-ΔΔCT計(jì)算ALP、OSX、DMP-1、DSPP 基因相對表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.5.3 茜素紅染色及鈣結(jié)節(jié)定量測定 細(xì)胞處理第21 天根據(jù)茜素紅染色說明書，細(xì)胞清洗、固定后使用茜素紅S 染液染色5 min，倒置顯微鏡下采集各組圖像。每組培養(yǎng)皿中加入1 mL 氯化十六烷吡啶溶液，充分溶解，根據(jù)分組向96 孔板中加入200 μL 溶解液，每實(shí)驗(yàn)組設(shè)置2 個(gè)復(fù)孔，調(diào)零孔加入200 μL 氯化十六烷吡啶溶液。使用酶標(biāo)儀測定在562 nm 波長處OD 值。根據(jù)公式計(jì)算各處理組鈣結(jié)節(jié)。

1.6 ELISA 法測定炎癥細(xì)胞因子表達(dá)

根 據(jù) 實(shí) 驗(yàn)1.5 結(jié) 果，4 J/cm2是LED 紅 光 調(diào) 節(jié)10 μg/mL LPS 所致炎性環(huán)境下成骨/成牙本質(zhì)分化的最佳能量，后續(xù)選擇4 J/cm2對細(xì)胞進(jìn)行輻照。設(shè)置分組：LPS+CG 組，LPS+CG+LED 組。

取hDPSCs 以2×104個(gè)/mL、2 mL/皿接種于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞融合至70%后按分組加入相應(yīng)誘導(dǎo)液并進(jìn)行LED 紅光輻照，記為實(shí)驗(yàn)第1 天，每3 d 更換培養(yǎng)基。分別于實(shí)驗(yàn)第1、3、5、7 天無菌管收集培養(yǎng)基液體（包括已換液培養(yǎng)基），3 500 rpm × 20 min離心，仔細(xì)收集上清液，吹打混勻后分別收集1 mL上清液。根據(jù)ELISA 試劑盒說明書，96 孔酶標(biāo)包被板進(jìn)行加樣與加酶，每孔設(shè)置2 個(gè)副孔。封板后37 ℃溫育60 min，重復(fù)洗滌5 次并拍干，加入顯色劑后37 ℃避光顯色15 min，終止反應(yīng)后酶標(biāo)儀上測定波長為450 nm OD 值。根據(jù)公式計(jì)算各處理組在1、3、5、7 天細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）濃度。

1.7 Western blot測定MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

細(xì)胞處理第7 天，提取各處理組細(xì)胞總蛋白。SDS-PAGE 電 泳 將20 μg 蛋 白 轉(zhuǎn) 移 到PVDF 膜 上。5%脫脂牛奶封閉1h，去除封閉劑后，4 ℃加入一抗（p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK5、ERK5、GAPDH）過夜。TBST 洗滌3 次，加入稀釋的二抗，室溫孵育30 min。TBST 洗滌4 次后，配制ECL 溶液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，并通過Alpha-EaseFC 軟件分析目標(biāo)帶的OD 值。GAPDH 作為參考蛋白，計(jì)算LPS+CG組與LPS+CG+LED組ERK1/2、p38、JNK、ERK5 及磷酸化蛋白相對表達(dá)量。

設(shè)置LPS+CG 組、LPS+CG+LED 組、LPS+CG+LED+U0126（抑 制ERK1/2）組、LPS+CG+LED+SB203580（抑制p38）組、LPS+CG+LED+SP600125（抑制JNK）組、LPS+CG+LED+BIX02189（抑制ERK5）組。細(xì)胞處理第7 天，Western blot 法檢測各處理組ALP、OSX、DMP-1、DSPP 蛋白相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 27.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，兩組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism 6繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 hDPSCs 的培養(yǎng)與鑒定

牙髓組織培養(yǎng)第7 天鏡下可見組織塊周圍有細(xì)胞貼壁長出，從中央向四周放射狀生長，細(xì)胞形態(tài)為梭形，類似成纖維細(xì)胞樣。傳代后可見細(xì)胞生長狀態(tài)良好，形態(tài)均勻一致（圖1a& 1b）。

Figure 1 Culture and identification of hDPSCs圖1 hDPSCs 的培養(yǎng)與鑒定

第三代hDPSCs 表面抗原檢測結(jié)果為：間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物呈陽性表達(dá)：CD44、CD73、CD90 的表達(dá)率依次為99.93%、93.75%、99.81%：造血系統(tǒng)來源細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物陰性表達(dá)：CD34、CD45 的表達(dá)率依次為0.68%、0.09%（圖1c）。成骨誘導(dǎo)7 d 后，ALP 染色鏡下細(xì)胞呈藍(lán)紫色（圖1d）。成骨誘導(dǎo)21 d 后，茜素紅染色鏡下見大小不一的紅染鈣結(jié)節(jié)分布于細(xì)胞之間（圖1e）。成脂誘導(dǎo)21 d后，油紅O 染色示鏡下細(xì)胞復(fù)層排列，橘紅色脂滴出現(xiàn)在部分細(xì)胞胞漿內(nèi)（圖1f）。

2.2 不同濃度LPS 溶液對hDPSCs 增殖的影響

CCK-8 示第1、3、5、7 天，0 μg/mL LPS 組與1 μg/mL LPS 組增殖無顯著差異（P= 0.894，P=0.998，P= 0.965，P= 0.870）。5 μg/mL LPS 組在第5 天增殖低于0 μg/mL LPS 組、1 μg/mL LPS 組（P＜0.001，P＜0.001）。10μg/mL LPS 組在第5、7 天增殖低于0 μg/mL LPS 組、1 μg/mL LPS、5 μg/mL LPS組（第5 天：P＜0.001，P＜0.001，P= 0.009，第7 天：P＜0.001，P＜0.001，P= 0.002）（圖2）。由此可見，LPS 濃度為5、10 μg/mL 時(shí)，均可降低hDPSCs增殖能力，但10 μg/mL LPS增殖抑制作用強(qiáng)于5 μg/mL，因此本實(shí)驗(yàn)選擇10 μg/mL 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)炎癥微環(huán)境的刺激濃度。

Figure 2 Effect of different concentrations of lipopolysaccharides on the proliferation of human dental pulp stem cells圖2 不同濃度脂多糖溶液對人牙髓干細(xì)胞增殖的影響

2.3 LED 紅光對炎癥環(huán)境下hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)分化的影響

LED 紅光輻照hDPSCs 7 d 后，ALP 染色結(jié)果顯示LPS+CG 組較CG 組稍淺，光照組藍(lán)染程度均高于LPS+CG 組（圖3a）。ALP 定量結(jié)果顯示LPS+CG組ALP 活力低于成骨組（P= 0.007），光照組ALP 活力均高于CG 組與LPS+CG 組（均P＜0.001），LPS+CG+4 J/cm2組ALP 活力高于其他光照組（均P＜0.001）（圖3b）。

第7天qRT-PCR檢測礦化基因ALP、OSX、DMP-1、DSPP 表達(dá)結(jié)果顯示，CG 組與LPS+CG 組無顯著差異（P= 0.968，P= 0.267，P= 0.902，P= 0.449）。LPS+CG+2 J/cm2、4 J/cm2、6 J/cm2、8 J/cm2組均高于CG 組與LPS+CG 組（P＜0.05）。LPS+CG+4 J/cm2組高于LPS+CG+2 J/cm2、6 J/cm2、8 J/cm2、10 J/cm2組（vs.LPS+CG+6 J/cm2，ALP：P= 0.017；OSX：P=0.001；DMP-1：P= 0.007；DSPP：P= 0.013，其余均P＜0.001）。且LPS+CG+8 J/cm2組OSX、DMP-1、DSPP 表達(dá)低于LPS + CG + 6 J/cm2組（P= 0.016，P= 0.013，P＜0.001），LPS+CG+10 J/cm2組ALP 表達(dá)低于LPS+CG+8 J/cm2組（P= 0.004）（圖4）。

Figure 4 Effect of LED red light on the expression of mineralization related genes in human dental pulp stem cells in inflammatory environment圖4 LED 紅光對炎癥環(huán)境下人牙髓干細(xì)胞礦化相關(guān)基因表達(dá)的影響

LED 紅光輻照21 d 后，茜素紅染色結(jié)果顯示CG 組鈣結(jié)節(jié)數(shù)目多于LPS+CG 組，LPS+CG+4 J/cm2鈣結(jié)節(jié)染色數(shù)目多且較大，較其他LPS+CG+光照組鈣結(jié)節(jié)染色深（圖5a）。鈣結(jié)節(jié)定量結(jié)果顯示LPS+CG 組鈣結(jié)節(jié)定量少于CG 組（P＜0.001），LPS+CG+光照組鈣結(jié)節(jié)定量均多于LPS+CG 組與CG 組（均P＜0.001），LPS+CG+4 J/cm2組鈣結(jié)節(jié)定量多于其他LPS+CG+光照組（均P＜0.001）（圖5b）。

Figure 5 Effect of LED red light on the formation of calcium nodules in osteogenic/odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells in inflammatory environments圖5 LED 紅光對炎性環(huán)境下人牙髓干細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)分化鈣結(jié)節(jié)形成的影響

2.4 LED 紅光影響炎性環(huán)境下hDPSCs 礦化時(shí)炎癥因子的表達(dá)

ELISA 結(jié)果顯示，細(xì)胞分泌TNF-α 與IL-1β 的趨勢均為先升后降。第1 天，TNF-α 與IL-1β 的分泌無明顯差異（P= 0.887，P= 0.066）。第3 天，LPS+CG 組的TNF-α 與IL-1β 的分泌表達(dá)量均高于第1 天（P＜0.001，P= 0.034），LPS+CG+LED 組的TNF-α 與IL-1β 分 泌 量 高 于 第1、5、7 天（P＜0.001），且LPS+CG 組的分泌量低于LPS+CG+LED組（P＜0.001）。第5 天，LPS+CG 組的TNF-α 與IL-1β 的 分 泌 表 達(dá) 量 高 于 第1、3、7 天（均P＜0.001），LPS+CG 組的分泌量高于LPS+CG+LED 組（P＜0.001）。第7 天，LPS+CG 組與LPS+CG+LED組的TNF-α 與IL-1β 的分泌表達(dá)量低于第5 天（P＜0.001），且LPS+CG+LED 組的分泌表達(dá)量低于LPS+CG 組（P= 0.002，P= 0.011）（圖6）。

Figure 6 Effect of LED red light on the expression of inflammatory factors during mineralization of human dental pulp stem cells in inflammatory environment圖6 LED 紅光對炎性環(huán)境下人牙髓干細(xì)胞礦化時(shí)炎癥因子表達(dá)的影響

2.5 LED 紅光介導(dǎo)MAPK 信號(hào)通路調(diào)控炎癥環(huán)境下牙髓干細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)分化

MAPK 信號(hào)通路蛋白表達(dá)如圖7，第7 天，LPS+CG+LED 組的p-ERK1/2、p-p38、p-JNK 的相對表達(dá)量高 于LPS+CG 組（P＜0.001），LPS+CG+LED 組的p-ERK5 相對表達(dá)量高于LPS+CG 組（P=0.003）。

Figure 7 Effect of LED red light on the expression of MAPK signaling pathway during mineralization of human dental pulp stem cells in inflammatory environment圖7 LED 紅光對炎性環(huán)境下人牙髓干細(xì)胞MAPK 信號(hào)通路表達(dá)的影響

未加MAPK 通路阻滯劑時(shí)，LPS+CG 組ALP、OSX、DMP-1、DSPP 蛋白表達(dá)量均低于LPS+CG+LED 組（P＜0.001）;加 入MAPK 通 路 阻 滯 劑 后，LPS+CG+LED+U0126（抑 制ERK1/2)、LPS+CG+LED+SP600125（抑制JNK)、LPS+CG+LED+BIX02189（抑制ERK5)組ALP、OSX、DMP-1、DSPP 蛋白表達(dá)量均低于LPS+CG+LED 組（ALP：LPS+CG+LEDvs.LPS+CG+LED+SP600125（抑制JNK），P= 0.004，其余均P＜0.001）；LPS+CG+LED+SB203580（抑制p38）組的ALP、OSX、DMP-1 蛋白表達(dá)量與LPS+CG+LED 組相比較無顯著差異（P= 0.065，P=0.193，P= 0.099），DSPP 蛋白表達(dá)量低于LPS+CG+LED 組（P＜0.001）（圖8）。

Figure 8 Effects of LED red light on the osteogenic/odontoblastic differentiation proteins of human dental pulp stem cells in inflammatory environment through MAPK signaling pathway圖8 LED 紅光調(diào)控MAPK 信號(hào)通路對炎性環(huán)境下人牙髓干細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)分化蛋白的影響

3 討 論

hDPSCs 來源于人牙髓組織，免疫原性低，具有高增殖能力，提供合適的外部誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)因素胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子和物理因子等作用下，可以被定向誘導(dǎo)分化，是再生醫(yī)學(xué)中具有前景的間充質(zhì)干細(xì)胞［8］。有研究報(bào)道，LED 紅光影響牙髓干細(xì)胞的細(xì)胞周期、線粒體膜電位和衰老［9］；5 J/cm2的LED紅光促進(jìn)高糖環(huán)境下牙周膜干細(xì)胞增殖和成骨分化，減 輕 氧 化 損 傷［10］；2 J/cm2、4 J/cm2LED 紅 光（850 nm，80 mW/cm2）顯著提升乳牙牙髓干細(xì)胞活力、總蛋白產(chǎn)量、ALP 活力以及ALP、Col-I 基因表達(dá)［11］。不同能量密度LED 紅光對間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化有影響。低或不足的能量密度，未達(dá)到生物刺激閾值，不會(huì)發(fā)生細(xì)胞反應(yīng)；較高則可能破壞光感受器，導(dǎo)致生物調(diào)節(jié)效應(yīng)降低［12］，合適的LED 紅光輻射劑量才能對間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生積極的生物學(xué)效應(yīng)。

成骨/成牙本質(zhì)分化是牙齒形成的基礎(chǔ)，也是骨生成的關(guān)鍵步驟。在hDPSCs 生長分化的炎性環(huán)境中，由于0、1μg/mL LPS 的增殖速率無明顯差異，5、10 μg/mL 的增殖速率依次降低，與劉影等［13］研究結(jié)果一致，因此選擇10 μg/mL LPS 誘導(dǎo)炎癥微環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)中hDPSCs 在10 μg/mL LPS 刺激下的礦化誘導(dǎo)比單純礦化誘導(dǎo)7 d ALP 染色稍淺及活力測定稍低，說明10 μg/mL LPS 對hDPSCs 的成骨/成牙本質(zhì)分化效應(yīng)為抑制，與Sattari 等［2］報(bào)道的LPS 對DPSCs 的分化效應(yīng)一致。LED 紅光輻照LPS致炎環(huán)境下的hDPSCs，比LPS 礦化誘導(dǎo)下和單純礦化誘導(dǎo)下ALP 染色、茜素紅染色更深，ALP 活力和鈣結(jié)節(jié)定量測定值更高，RT-PCR 檢測的成骨特異性基因ALP、OSX 與成牙本質(zhì)特異性基因DMP-1、DSPP 相對表達(dá)量更高，說明LED 紅光正向調(diào)控炎性環(huán)境下的hDPSCs 的成骨/成牙本質(zhì)分化。其中，4 J/cm2能量密度LED 紅光輻照hDPSCs，ALP 染色、ALP 活力測定、RT-PCR、茜素紅染色及鈣結(jié)節(jié)定量測定結(jié)果最佳，說明4 J/cm2能量密度是LED 紅光上調(diào)10 μg/mL LPS 致炎環(huán)境下促成骨/成牙本質(zhì)分化的最佳輻照能量。

有研究報(bào)道4 J/cm2LED 紅光上調(diào)牙周膜干細(xì)胞ALP、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等基因和蛋白表達(dá)，促進(jìn)干細(xì)胞成骨和成血管分化［7，14］。還可以上調(diào)牙乳頭干細(xì)胞的DMP-1、DSPP、BSP、ALP 和Runx2 基因和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)干細(xì)胞成牙本質(zhì)和成骨分化［15-16］。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)4 J/cm2LED 紅光促成骨/成牙本質(zhì)分化能力最強(qiáng)，隨能量密度的增加，其成骨向分化能力呈依賴式下降，符合物理治療中Arndt-Schulze 法則：弱刺激引起生命活動(dòng)，中等刺激促進(jìn)生命活動(dòng)直到達(dá)峰值，強(qiáng)烈刺激抑制生命活動(dòng)直到產(chǎn)生負(fù)反應(yīng)，最強(qiáng)刺激使生命活動(dòng)停止［17］。

研究報(bào)道LPS 可以通過TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞分泌TNF-α、IL-8、IL-12，引起牙髓損傷［18］；Zhai 等［19］研究發(fā)現(xiàn)LPS 刺激hDPSCs 后，炎癥介質(zhì)IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α 基因和蛋白表達(dá)升高。本實(shí)驗(yàn)中LPS 作為炎癥刺激源，處理hDPSCs 后釋放TNF-α 和IL-1β 等炎性介質(zhì)，培養(yǎng)液中炎性介質(zhì)濃度升高則會(huì)引起hDPSCs 增殖與分化的緩慢抑制，與前面報(bào)道一致。本研究示10 μg/mL LPS 成骨/成牙本質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)下，非光照組TNF-α 和IL-1β 分泌量在第5 天達(dá)到高峰，第7 天炎癥反應(yīng)得到緩解；4 J/cm2LED 紅光組炎性介質(zhì)分泌在第3 天達(dá)到高峰且高于非光照組，第5 天炎癥反應(yīng)得到緩解，可能是由于4 J/cm2LED 紅光加速了炎癥反應(yīng)的進(jìn)程。第5、7 天時(shí)，4 J/cm2LED 紅光組TNF-α 和IL-1β 分泌量低于非光照組。說明4 J/cm2LED 紅光在促進(jìn)炎性環(huán)境下成骨的同時(shí)，減少了炎癥因子TNF-α 和IL-1β 的釋放，從而達(dá)到抗炎的目的，該結(jié)果與其他研究［20］報(bào)道的LED 紅光光療下調(diào)炎性因子與趨化因子的表達(dá)一致。

間充質(zhì)干細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)分化是一個(gè)由多種礦化基因調(diào)控、多種信號(hào)通路共同參與的一個(gè)復(fù)雜分化過程。MAPK 信號(hào)通路有4 個(gè)亞族：ERK1/2、JNK、p38 與ERK5。其中ERK 信號(hào)通路主要調(diào)控細(xì)胞生長和分化，p38 與JNK 信號(hào)通路的主要生理效應(yīng)主要與炎癥、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)［21］。因此，物理刺激因素可能激活部分或全部MAPK 亞族通路。本研究中LED 紅光促進(jìn)MAPK信號(hào)通路蛋白p-ERK1/2、p-JNK、p-p38、p-ERK5 表達(dá)增高，提示ERK1/2、JNK、p38、ERK5 可能參與了LED 紅光促進(jìn)炎癥環(huán)境下hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)分化的過程。LED 紅光分別聯(lián)合信號(hào)通路ERK1/2特異性阻滯劑U0126、JNK 特異性阻滯劑SP600125以及ERK5 特異性阻滯劑BIX02189 干預(yù)hDPSCs時(shí)，ALP、OSX、DMP-1、DSPP 礦化蛋白相對表達(dá)量低于LPS+CG+LED 組，說明LED 紅光激活了ERK1/2、JNK、ERK5 亞通路，也有可能MAPK 阻滯劑加入后誘導(dǎo)干細(xì)胞凋亡，成骨/成牙本質(zhì)分化向分化細(xì)胞數(shù)目減少，導(dǎo)致礦化蛋白部分表達(dá)下調(diào)有關(guān)［22］。然而LED 紅光聯(lián)合信號(hào)通路p38 特異性阻滯劑SB203580 干預(yù)hDPSCs 時(shí)，LPS+CG+LED+SB203580 組與LPS+CG+LED 組礦化蛋白表達(dá)量無明顯差異，可能是由于LED 紅光未激活p38 信號(hào)通路，或者是因?yàn)镾B203580 有效抑制炎癥因子（如IL-1β、TNF-α）誘導(dǎo)的部分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［23］，逆轉(zhuǎn)了炎性因子所導(dǎo)致的成骨抑制。因此LED 紅光可能通過激活MAPK 信號(hào)通路中的ERK1/2、JNK、ERK5 亞通路，來促進(jìn)炎癥環(huán)境下hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)分化。這些MAPK 亞通路的激活與Yamauchi 等［24］研究LED 紅光所激活的通路一致。

綜上，本研究探討了能量密度為2 ～10 J/cm2的LED 紅光調(diào)控10 μg/mL LPS 致炎環(huán)境下hDPSCs成骨/成牙本質(zhì)分化，其中4 J/cm2的LED 紅光促成骨/成牙本質(zhì)分化效應(yīng)最佳，且減少炎癥因子分泌，同時(shí)ERK1/2、JNK、ERK5 通路參與LED 紅光調(diào)控炎性微環(huán)境下hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)分化。不同的參數(shù)指標(biāo)（光源、波長、能量密度、輸出功率、照射頻率、細(xì)胞與光源發(fā)射器之間的距離等）對干細(xì)胞具有不同的生物學(xué)效應(yīng)，探索治療的最佳參數(shù)有利于為牙髓干細(xì)胞的體外處理技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

【Author contributions】Liu Y designed the study, performed the experiments and wrote the article.Hui YN, Jiang B, Zheng GZ designcd the study, performed the experiments and analyzed the data.Wang Y designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.