范心怡，劉蒼維，周怡君，任飛龍，史冊，孫宏晨

1.吉林大學口腔醫(yī)院病理科，吉林 長春（130021）；2.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點實驗室，吉林 長春（130021）；3.中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔病理科，遼寧 沈陽（110001）

人牙髓干細胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）是一種顱神經嵴來源的間充質干細胞，通常位于成牙本質細胞層的內側和牙髓血管系統(tǒng)周圍，在牙本質受損時可以分化為成牙本質細胞形成牙本質［1］。體內研究表明，將hDPSCs 聚集體充填于人牙根管，移植到免疫缺陷小鼠皮下，hDPSCs能夠分化為成牙本質細胞樣細胞，形成牙髓-牙本質樣結構［2］。體外實驗表明，hDPSCs 在不同種信號分子和生長因子的誘導下，可以分化為多種細胞，如成牙本質細胞樣細胞、軟骨細胞和神經元等［3-4］。這些發(fā)現(xiàn)使hDPSCs 成為組織再生和細胞治療的良好候選者，然而生長因子及其受體途徑與hDPSCs 分化之間的信號網絡尚未完全闡明。識別能夠促進牙髓干細胞成牙本質向分化的生長因子可為牙本質再生的研究提供新靶點［5］。

血管生成素4（angiopoietin 4，ANGPT4），是內皮細胞特異性受體酪氨酸激酶TIE2 的配體［6］。血管生成素及其受體間的信號轉導是影響細胞活性和胚胎干細胞分化的關鍵機制。有研究報道，血管生成素1（angiopoietin 1，ANGPT1）重組蛋白可促進間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向軟骨細胞和成骨細胞分化［7］，體內利用可吸收膠原海綿作為載體植入ANGPT1 重組蛋白可促進顱骨缺損的骨修復與再生［8］。ANGPT4 作為血管生成素家族成員，具有與ANGPT1 相似的功能，能夠通過TIE2 途徑誘導體內血管形成，并且具有調節(jié)血管重塑和成熟的功能［9］。在牙髓中，血管生成為成牙本質細胞提供氧氣、磷酸鹽和成牙本質細胞因子，以支持其成熟和成牙本質發(fā)生［10］。本實驗旨在探討ANGPT4 對hDPSCs 成牙本質向分化的影響。

1 材料和方法

本研究通過中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院倫理委員會審查批準，批號：中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院（2019）科倫審字（K2019037）號。

1.1 試劑與儀器

多聚甲醛（天津光復，中國）；快速脫鈣液（0500-0052，北 京 卓 鼎，中 國）；Anti-ANGPT4（MAB964，R&D，美國）；Anti-β-actin（66009-1，Proteintech，美國），Alexa-594 標記山羊抗小鼠二抗（66009-1，Proteintech，美國）；DAPI（C0060，索萊寶，中國）；Ⅰ型膠原酶（LSOO4196，Worthington，美國）；Dispase Ⅱ酶（D4693，Sigma，美國）；胎牛血清（FB15015，Clark，美國）；高糖培養(yǎng)基（8122377，Gibco，美國）；Anti-Human CD90（Invitrogen，美國）；Anti-Human CD105（Invitrogen，美國）；Anti-Human CD34（Proteintech，美國）；Anti-Human CD45（Biolegend，美國）；HifairⅡ1stStrand cDNA Synthesis Super-Mix For qPCR 試劑盒（翊圣，中國）；Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 試劑盒（翊圣，中國）；BCA蛋白檢測試劑盒（碧云天，中國）；PVDF 膜（Millipore，美國）；山羊抗兔二抗（SA00001-2，Proteintech，美國）；山羊抗小鼠二抗（SA00001-1，Proteintech，美國）；ALP 染液（Sigma，美國）；茜素紅S 染液（索萊寶，中國）。激光共聚焦顯微鏡（OLS4000，Olympus，日本）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（Phcbi，日本）；倒置相差顯微鏡（BX53，Olympus，日本）；流式細胞儀（MACSQaunt VYB，Miltenyi，德國）。

1.2 HE 和免疫熒光染色

在獲得患者知情同意后，收集臨床年齡在18 ～25 周歲患者因正畸拔除的前磨牙。人健康前磨牙拔除后立即在4%多聚甲醛中固定24 h，然后在快速脫鈣液中脫鈣4 ～5 周，經脫水，透明，石蠟包埋后，行5 μm 連續(xù)切片。每組選取3 張石蠟切片，經過脫蠟水化后行HE 或免疫熒光染色。HE 染色：切片用蘇木精染液染色1 ～2 min 后進行分化和返藍，再用伊紅染液染色10 ～30 s。切片染色后用流動水沖洗2 min，最后進行脫水，透明和封片。免疫熒光染色：切片用胃酶修復液在37 ℃下修復10 min。修復后在每張切片上滴加50 μL 濃度為2%的牛血清白蛋白封閉液，室溫封閉1 h。然后在每張切片上滴加50 μL Anti-ANGPT4（1∶100）一抗，4 ℃條件下孵育過夜。次日，在每張切片上滴加50 μL Alexa-594 標記的山羊抗小鼠二抗（1∶200），室溫避光孵育1 h。用DAPI 進行核染色，并用抗淬滅封片劑封片。使用共聚焦激光掃描顯微鏡成像。

1.3 hDPSCs 的分離培養(yǎng)與鑒定

牙拔除后用酒精棉球擦拭3～4 次，然后敲開牙釉質和牙本質，暴露牙髓。將牙髓組織從髓室和根管中輕輕分離，將牙髓組織剪成0.5 mm ×0.5 mm × 0.5 mm 大小的組織碎片。加入200 μL 6 mg/mL Ⅰ型膠原酶和200 μL 8 mg/mL Dispase Ⅱ酶溶液，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中消化30 ～60 min。終止消化后轉移至細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，即為hDPSCs。根據(jù)細胞生長狀態(tài)定期更換培養(yǎng)基。倒置顯微鏡下觀察hDPSCs 生長狀況，當細胞密度達到80%融合時，進行細胞傳代。后續(xù)選擇第3 代hDPSCs 用于實驗。

1.3.1 細胞表面標記物鑒定 hDPSCs 培養(yǎng)至80%融合，棄除培養(yǎng)基后，PBS 洗3 次。經消化、離心后，用流式染色緩沖液（FACS buffer）重懸至細胞濃度為1 × 107個/mL。每組取100 μL 細胞重懸液，分別加入Anti-Human CD90、Anti-Human CD105、Anti-Human CD34 和Anti-Human CD45 的抗體，4 ℃避光孵育30 min。抗體孵育后用FACS buffer 清洗3 次，400 g 離心3 min。離心后重懸于100 μL FACS buffer 中。檢測前，細胞通過70 μm 孔徑的細胞過濾器過濾，去除細胞團。使用流式細胞儀檢測細胞表面標記物CD90、CD105、CD34 和CD45 的表達。

1.3.2 多向分化能力鑒定 取生長狀態(tài)良好的hDPSCs，經消化、離心、重懸后，接種到12 孔板或24 孔板，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞融合至80%時，更換為成牙本質向分化誘導培養(yǎng)基或成脂向分化誘導培養(yǎng)基。成牙本質向誘導7 d 后進行堿性磷酸酶染色，14 d 后進行茜素紅S 染色；成脂向誘導30 d 進行油紅O 染色。

1.4 RT-qPCR

Trizol 法提取細胞總RNA，室溫干燥后用DEPC水溶解。利用Nanodrop 軟件測RNA 濃度。使用HifairⅡ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix For qPCR 試劑盒進行逆轉錄。用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 試劑盒行RT-qPCR。以ACTB 為內參檢測ANGPT4 以及成牙本質細胞標記物Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、牙本質基質蛋白1（dentin matrix protein 1，DMP1）和牙本質涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）基因的相對表達量。引物序列見表1，引物由生工生物技術有限公司（上海，中國）合成。目的基因Ct 值與內參基因比較，采用2-△△Ct方法計算。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.5 在hDPSCs 中沉默ANGPT4

用載有si-ANGPT4（終濃度為75 pmol/mL）的轉染復合物瞬時轉染hDPSCs 以沉默ANGPT4 的表達，以轉染Scrambled siRNA 為陰性對照。hDPSCs以2 × 104個/cm2接種到24 孔板或12 孔板，接板后置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h 后，細胞融合至80%左右，開始轉染siRNA。將轉染試劑GP-transfect-Mate 與siRNA 混 合 后 轉 染 細 胞，孵 育4 h 后 換成正常培養(yǎng)基。利用熒光標記的FAM siRNA 評估轉染效率。siRNA 序列見表2。

表2 siRNA 序列Table 2 siRNA sequences

1.6 Western blot

細胞用PBS 沖洗后，加RIPA 緩沖液裂解細胞獲取總蛋白。使用BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后將等量蛋白質（20 μg）加入10%聚丙烯酰胺凝膠中，進行電泳分離。然后轉移到PVDF 膜上。轉膜后用10%脫脂牛奶封閉1 h，隨后4 ℃條件下一抗孵育過夜。一抗如下：Anti-ANGPT4 抗體（1∶100）、Anti-β-actin 抗體（1∶5 000）。次日，將膜與羊抗兔二抗（1∶5 000）和山羊抗小鼠二抗（1∶5 000）在室溫下孵育1 h。用增強化學發(fā)光（ECL）系統(tǒng)觀察蛋白條帶。重復3 次實驗。使用ImageJ 軟件分析蛋白的表達。

1.7 堿性磷酸酶（ALP）染色

成牙本質向分化誘導液培養(yǎng)hDPSCs 7 d 后，棄培養(yǎng)基，PBS 清洗3 次。室溫下檸檬酸-丙酮-甲醛固定劑固定細胞40 s，去離子水清洗3 次，每孔加入300 μL ALP 染液。室溫下避光孵育15 min，去離子水輕輕洗滌3 次。于倒置顯微鏡下觀察。

1.8 茜素紅S 染色

成牙本質向分化誘導液培養(yǎng)hDPSCs 14 d 后，棄培養(yǎng)基，PBS 清洗3 次。在室溫下用70%冰乙醇在4 ℃條件下固定細胞1 h，去離子水清洗3 次，每孔加入300 μL 40 mM 茜素紅S 染液。室溫下置于搖床避光輕輕搖晃10 min，去離子水輕輕洗滌5 次。掃描后于倒置顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計學分析

計量資料以均數(shù)± 標準差表示。采用方差分析進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義，采用Excel 和Graphpad Prism（8.0.1）軟件進行比較及作圖分析。

2 結 果

2.1 人前磨牙中ANGPT4 的表達

人前磨牙HE 染色結果可見牙髓和牙本質結構。免疫熒光顯示ANGPT4 在成牙本質細胞及下層多細胞區(qū)中高表達（圖1）。

Figure 1 Results of HE and ANGPT4 immunofluorescence staining of human premolars圖1 人前磨牙HE 和ANGPT4 免疫熒光染色結果

2.2 hDPSCs 的分離培養(yǎng)與鑒定

采用酶消組織塊法分離培養(yǎng)hDPSCs，14 d 后觀察到細胞集落，呈成纖維細胞樣形態(tài)（圖2a）。hDPSCs 傳代后增殖迅速，呈旋渦狀排列（圖2b）。利用流式細胞術對hDPSCs 表面標記物進行分析，結果顯示hDPSCs 表面標志物CD90（97.15%）和CD105（90.42%）陽性，而造血標志物CD34（0.08%）和CD45（0.01%）陰性（圖2c-2f）。細胞多向分化能力檢測發(fā)現(xiàn)，hDPSCs 經過成牙本質向誘導7 d后，ALP 染色呈陽性（圖2g）；成牙本質向誘導14 d后，茜素紅S 染色可見紅色鈣結節(jié)形成（圖2h）；經過成脂向誘導30 d 后，油紅O 染色可見紅色脂滴形成（圖2i）。以上結果證實分離得到的hDPSCs 高表達間充質干細胞表面標記物，低表達造血細胞表面標志物，并且具有多向分化潛能。

Figure 2 Isolation, cultivation and identification of hDPSCs圖2 hDPSCs 的分離培養(yǎng)與鑒定

2.3 ANGPT4 在hDPSCs 成牙本質向分化過程中的表達

為明確ANGPT4 基因在hDPSCs 體外成牙本質向分化過程中的表達，將hDPSCs 在成牙本質向分化誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)0、1、5、7、11、14 d。提取總RNA 后，利用RT-qPCR 檢測ANGPT4 和成牙本質細胞分化相關基因mRNA 水平的表達。在成牙本質向誘導后，與第0 天相比，ANGPT4 基因的表達量增加，在成牙本質向誘導的第5 天達到峰值（P＜0.001），第7 天時開始下降，但仍高于第0 天（P＜0.01），說明hDPSCs 成牙本質向分化過程中ANGPT4的表達上調。在hDPSCs分化過程中，RUNX2的mRNA水平在第5天達到峰值，第7 天維持較高水平，第11天開始下降，而DMP1和DSPP的mRNA水平在第5 天達到峰值，此后維持在較高水平（圖3）。

Figure 3 Expression of ANGPT4 and odontoblast marker genes during odontogenic differentiation of hDPSCs圖3 hDPSCs 成牙本質向誘導分化過程中ANGPT4 和成牙本質細胞標記基因的表達

2.4 在hDPSCs 中沉默ANGPT4 的表達

首先，為了明確轉染條件，利用熒光標記（FAM）的siRNA（75 pmol/mL）進行轉染，以加入相同體積的GP-transfect-Mate 轉染試劑作為對照（Con），24 h 后熒光顯微鏡下可見轉染組hDPSCs 幾乎均呈綠色，而對照組未見綠色熒光，與對照組相比，轉染組細胞生長狀態(tài)未見異常（圖4a），說明該轉染條件可行，可用于后續(xù)實驗。用相同的條件轉染si-ANGPT4，以轉染Scrambled siRNA（NC）為對照組。結果發(fā)現(xiàn)，與NC 組相比，si-ANGPT4 組ANGPT4 的mRNA 表達水平在24 h 開始顯著下調（P＜0.01）（圖4b）。同時，Western blot 結果顯示，與NC 組 相 比，轉 染96 h 后si-ANGPT4 組ANGPT4的蛋白表達水平也下調，且具有顯著差異（P＜0.05）（圖4c-4d）。這說明通過siRNA 沉默ANGPT4具有較高的沉默效率，可用于后續(xù)實驗。

Figure 4 Silencing ANGPT4 expression in hDPSCs圖4 hDPSCs 中沉默ANGPT4 的表達

2.5 沉默ANGPT4 降低了hDPSCs 成牙本質向分化的能力

為了探討ANGPT4 在hDPSCs 成牙本質向分化過程中的作用，利用ALP 染色和茜素紅S 染色分別檢測成牙本質向誘導7 d 和14 d 的NC 組及si-ANGPT4 組hDPSCs 的ALP 活性和礦化結節(jié)形成（圖5）。ALP 染色結果顯示，與NC 組相比，si-ANGPT4 組ALP 染色強度和面積明顯降低。茜素紅S 染色結果顯示，與NC 組相比，si-ANGPT4 組未見明顯紅染的礦化結節(jié)。這些結果表明，沉默ANGPT4 后hDPSCs 的成牙本質向分化能力受到抑制。

Figure 5 Silencing ANGPT4 inhibits the odontogenic differentiation of hDPSCs圖5 沉默ANGPT4 抑制hDPSCs 成牙本質向分化

3 討 論

牙髓是一種具有血管供應和神經支配的結締組織，在各種刺激和創(chuàng)傷下具有一定的自我愈合的能力，這主要歸因于其內部的牙髓干細胞在特定信號分子和生長因子的作用下可以分化為成牙本質細胞、形成修復性牙本質，以維持牙的正常生理功能［11］。然而，當牙髓受到強烈的刺激時，可能導致牙髓壞死，喪失再生潛力［12］。目前，研究多基于組織工程原理，利用細胞、支架和生物活性分子實現(xiàn)牙髓-牙本質再生［13］。其中，基于牙髓干細胞的組織工程已成為臨床治療中新的研究熱點［14］。

hDPSCs 的成牙本質向分化是牙髓-牙本質再生中牙本質再生的關鍵。研究發(fā)現(xiàn)hDPSCs 來源的外泌體可顯著促進hDPSCs成牙本質向分化［15］。MicroRNA和LncRNA 在調控hDPSCs 成牙本質向分化中發(fā)揮重要作用［16-17］。研究表明，機械加壓通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路可以促進hDPSCs 的成牙本質向分化［18］。更重要的是，多種生長因子在調節(jié)hDPSCs 成牙本質向分化中起重要作用，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP2）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）、成纖維細胞生長因子-2（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF2）、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等均可調控hDPSCs的成牙本質向分化［19-20］。生長因子不僅能促進hDPSCs 的成牙本質向分化，并可在體內改善hDPSCs 介導的牙髓-牙本質復合體再生［21］。然而生長因子及其受體途徑與hDPSCs 分化之間的信號網絡尚未完全闡明。從應用治療的角度來看，鑒定調節(jié)hDPSCs 成牙本質向分化的新分子對于組織工程治療牙髓-牙本質再生是必要的。ANGPT4 是一種特定的生長因子，通過TIE2 途徑產生穩(wěn)定和成熟的血管系統(tǒng)。在本實驗中，明確了ANGPT4 在人前磨牙中的成牙本質細胞中特異性表達，并且證實ANGPT4 是hDPSCs 成牙本質向分化所必需的，從而為生長因子調節(jié)成牙本質細胞分化提供了實驗依據(jù)。

本實驗對人前磨牙進行ANGPT4 免疫熒光染色，結果顯示，ANGPT4 在人前磨牙成牙本質細胞及成牙本質細胞下層多細胞區(qū)中高表達。以往研究表明，牙髓祖細胞位于成牙本質細胞下層的多細胞區(qū)，當它們受到特定信號分子的刺激時，它們的DNA 沒有任何復制，被認為參與了細胞分化過程，這些細胞可能來源于分化為成牙本質細胞之前正在分裂的前成牙本質細胞［22］。這提示ANGPT4可能在成牙本質細胞分化過程中發(fā)揮重要作用。這提示ANGPT4 可能在成牙本質細胞分化過程中發(fā)揮作用。此外，免疫熒光染色結果顯示ANGPT4在小鼠下頜切牙和人前磨牙牙髓血管周圍均有表達。由于牙髓血管生成和牙本質形成之間存在相互調控，并且本課題組前期的研究結果證實hDPSCs表達ANGPT4 的受體TIE2，因此，筆者推測血管內皮細胞產生的ANGPT4 可能參與牙發(fā)生早期血管周圍hDPSCs 的分化。

hDPSCs 作為牙髓-牙本質再生組織工程重要的干細胞來源，是神經嵴來源的間充質干細胞，表達間充質干細胞表面標志物，并且具有類似于間充質干細胞的多向分化潛能［23］。為了證實從第三磨牙中分離出的細胞為hDPSCs，本實驗對其表面標志物和分化潛能進行了驗證。流式細胞術檢測結果顯示，hDPSCs 表達間充質干細胞標記物CD105 和CD90，而不表達造血干細胞標記物CD45和CD34。將hDPSCs 進行成牙和成脂向分化誘導，染色結果顯示ALP 活性增高并且形成了礦化結節(jié)和脂滴，證明其具有多向分化潛能。以上結果證實了hDPSCs 的間充質干細胞的特性。

為了探究ANGPT4 在hDPSCs 成牙本質向分化過程中的表達，將hDPSCs 在體外進行成牙本質向誘導，選取不同時間點提取RNA，檢測ANGPT4 及成牙本質細胞相關基因的表達。結果表明，ANGPT4 在hDPSCs 體外成牙本質向誘導過程中呈高表達，在第5 天時表達水平最高，隨后呈下降趨勢，與RUNX2 基因的表達模式相似。RUNX2 基因是成牙本質細胞分化的重要轉錄因子，在牙髓干細胞分化早期表達上調，并且可以調控DSPP 等礦化相關基因的表達，而在終末分化的成牙本質細胞中表達下調，有利于牙本質的形成［24-25］。這提示ANGPT4 可能促進了hDPSCs 的早期分化，并可能進一步調控分化晚期和礦化相關基因的表達。

為探究ANGPT4 在hDPSCs 成牙本質向分化中的作用，采用siRNA 基因沉默技術沉默hDPSCs 中ANGPT4 的表達。ALP 和茜素紅S 染色結果顯示，沉默ANGPT4 后抑制了hDPSCs 中ALP 的活性和礦化結節(jié)的形成。上述結果表明，ANGPT4 可能促進了hDPSCs 成牙本質向分化。

以往研究表明，ANGPT4 可通過TIE2/PI3K 途徑促進靜脈發(fā)育［26］，血管生成素家族成員ANGPT1可通過TIE2 介導的PI3K/AKT 信號通路促進MSCs的成軟骨和成骨分化［27］。由于PI3K/AKT 信號通路 參 與hDPSCs 分 化［28］，因 此 推 測ANGPT4 促 進hDPSCs 分化可能與激活上述信號通路有關，但具體機制有待進一步探究。同時，本實驗發(fā)現(xiàn)ANGPT4在牙髓血管內皮細胞中表達。由于ANGPT4 是一種分泌蛋白，前期研究表明hDPSCs 表達其受體TIE2，因此推測ANGPT4 可以通過旁分泌的方式作用于血管周hDPSCs，這一點將在接下來的研究中進行驗證。綜上，本實驗發(fā)現(xiàn)了人牙中的成牙本質細胞及下層多細胞區(qū)表達ANGPT4，并且通過體外實驗提示ANGPT4 可能促進hDPSCs 的成牙本質向分化，其具體分子機制以及潛在的臨床應用有待進一步探究。

【Author contributions】Fan XY designed the study, performed the experiments and wrote the article.Liu CW, Zhou YJ, Ren FL, Shi C,Sun HC designed the study, performed the experiments and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.