呂 鵬 李 芮 劉曉明

(1 山東中醫(yī)藥大學(xué),濟(jì)南,250014; 2 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,濟(jì)南,250014)

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)是不明原因?qū)е碌姆伍g質(zhì)病變致使肺功能迅速惡化,并最終發(fā)展為呼吸衰竭甚至死亡[1-2],其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,主要病理因素涉及肺上皮細(xì)胞損傷、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生、成纖維細(xì)胞增殖、血管新生與重塑等多種過程[3-4]。關(guān)于IPF的治療,目前證明切實(shí)有效的治療方案不多。2022年由美國胸科學(xué)會(huì)(American Thoracic Society,ATS)、歐洲呼吸學(xué)會(huì)(European Respiratory Society,ERS)、日本呼吸學(xué)會(huì)(Japanese Respiratory Society,JRS)共同頒布的最新指南提出IPF的治療包括藥物如尼達(dá)尼布和吡非尼酮和非藥物如補(bǔ)充氧氣和(或)肺康復(fù)2種治療方案[5]。除吡非尼酮、尼達(dá)尼布有條件推薦使用外,此前治療方案中的大部分藥物因?yàn)榀熜Р幻黠@且不良反應(yīng)大,均被列為有條件不推薦使用或強(qiáng)烈不推薦使用范圍[5-6]。因此,發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì),探索驗(yàn)方補(bǔ)腎活血方延緩IPF進(jìn)展的分子機(jī)制,對(duì)下一步開發(fā)新藥,解決世界性的纖維化治療難題具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與細(xì)胞 10周齡健康新西蘭兔10只,體質(zhì)量2.5～3 kg,購自濟(jì)南西嶺羊角養(yǎng)殖繁育中心,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(魯)20150001。山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過了實(shí)驗(yàn)流程(倫理審批號(hào):AWE-2019-056)。飼養(yǎng)條件:室溫22～25 ℃、濕度40%～60%和12 h黑暗與光照交替的環(huán)境及正常飲食。在實(shí)驗(yàn)開始前進(jìn)行5 d的適應(yīng)性喂養(yǎng)。人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,貨號(hào):KG508)培養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。使用含10%的胎牛血清的不完全杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle Medium,DMEM),放入5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞,當(dāng)培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞生長達(dá)80%左右時(shí),用胰酶消化傳代,選擇第3～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物 補(bǔ)腎活血方:人參9 g、熟地黃15 g、黃芪30 g、虎杖12 g、山茱萸9 g、丹參15 g、當(dāng)歸15 g、川貝母6 g、五味子6 g、黃芩12 g、麥冬15 g、炙甘草6 g。購自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,產(chǎn)品質(zhì)量符合《中華人民共和國藥典》(2020年版)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.3 試劑與儀器 MEM培養(yǎng)基(GIBCO,美國,貨號(hào):11095080);胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)(GIBCO,美國,貨號(hào):10099141);轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)(上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司,貨號(hào):HY-P7118);二甲亞砜[阿拉丁試劑(上海)有限公司,貨號(hào):B1328005];1640培養(yǎng)液(GIBCO,美國,貨號(hào):1171219)。超凈工作臺(tái)(蘇州凈化,型號(hào):SW-CJ-IFD);二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(SANYO,日本,型號(hào):MCO-18AC);水平電泳儀(上海天能科技有限公司,型號(hào):EPS-300);蛋白轉(zhuǎn)膜儀(上海天能科技有限公司,型號(hào):VE-186);蛋白電泳儀(上海天能科技有限公司,型號(hào):VE-180)。

1.2 方法

1.2.1 補(bǔ)腎活血方成分及其靶點(diǎn)的獲取 補(bǔ)腎活血方中共有12味中藥,分別是人參、黃芪、熟地黃、山茱萸、麥冬、五味子、當(dāng)歸、丹參、黃芩、川貝母、虎杖、炙甘草,其所含化合物可視為補(bǔ)腎活血方的成分。本研究依據(jù)指南從草藥成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(Herbal Ingredients′ Targets Database,HIT)(http://lifecenter.biosino.org/hit/)、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)(https://tcmsp-e.com/)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在線數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicines Integrated Database,TCMID)(http://www.megabionet.org/tcmid)3個(gè)數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)檢索中收集到645個(gè)化合物[7]。在此基礎(chǔ)上,運(yùn)用化合物相互作用搜索工具(Search Tool for Interacting Chemicals,STITCH)數(shù)據(jù)庫(http://stitch.embl.de/)檢索上述化合物的靶點(diǎn),最終檢索到524個(gè)化合物和2 904個(gè)靶點(diǎn)之間形成了126 549個(gè)互作關(guān)系。

1.2.2 IPF相關(guān)疾病基因獲取 基于先前的臨床觀察及實(shí)驗(yàn)研究,發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血方對(duì)治療IPF效果顯著[8]。本研究從MalaCards人類疾病數(shù)據(jù)庫(The Human Disease Database)(https://www.malacards.org/)中獲得IPF的疾病標(biāo)準(zhǔn)ID:PLM134,并收集到IPF相關(guān)基因162個(gè)。

1.2.3 批準(zhǔn)的IPF藥物標(biāo)靶獲取 美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)的治療IPF的藥物有2種,分別是吡非尼酮和尼達(dá)尼布。本研究從DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(https://drugbank.com/)中分別提取2種藥物的相關(guān)靶點(diǎn)。其中吡非尼酮相關(guān)靶點(diǎn)5個(gè),尼達(dá)尼布相關(guān)靶點(diǎn)21個(gè)。

1.2.4 補(bǔ)腎活血方的活性成分篩選 補(bǔ)腎活血方是口服給藥,其發(fā)揮藥效受藥物“吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代謝(Metabolism)和外排(Excretion)(ADME)特性的限制,ADME值低,往往意味著藥物不能在相應(yīng)靶點(diǎn)發(fā)揮良好的藥效反應(yīng),而藥物ADME的性質(zhì)常?？梢酝ㄟ^類藥性指數(shù)(Quantitative Estimate of Drug-likeness,QED)反映[9]。該指標(biāo)整合了8個(gè)被普遍認(rèn)為對(duì)類藥性分析相對(duì)重要的分子描述符:1)分子質(zhì)量;2)氫鍵供體(Hydrogen Bond Donor,HBD)的數(shù)量;3)辛醇-水分配系數(shù)(Octanol-Water Partition Coefficien,AlogP);4)氫鍵受體(Hydrogen Bond Acceptor,HBA)的數(shù)量;5)旋轉(zhuǎn)鍵(Rotatable Bond,ROTB)的數(shù)量;6)芳環(huán)(AROM)的數(shù)量;7)分子的極性表面積(Polar Surface Area,PSA);8)結(jié)構(gòu)警報(bào)的數(shù)量。一般認(rèn)為,QED值越大類藥性越好,參考相關(guān)研究[10],將QED值設(shè)定為0.4以篩選出補(bǔ)腎活血方的活性成分。

1.2.5 補(bǔ)腎活血方的核心靶點(diǎn)篩選 首先運(yùn)用基于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)距離和路徑的重啟隨機(jī)游走算法(Random Walk with Restart,RWR)方法評(píng)價(jià)補(bǔ)腎活血方靶點(diǎn)與IPF疾病基因之間的相關(guān)性[11-12]。利用STITCH數(shù)據(jù)庫中的藥靶關(guān)聯(lián)性閾值對(duì)獲取的2 904個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選[13],該閾值設(shè)定為>400[14]?；谝陨辖Y(jié)果,按照二項(xiàng)分布理論計(jì)算靶點(diǎn)與k個(gè)以上活性成分具有相互作用的概率P(X≥k)[15],P越小篩到的靶點(diǎn)越重要,設(shè)P<0.001。最后,將獲取的上述靶點(diǎn)與IPF相關(guān)基因結(jié)果分別去重后取交集,得到補(bǔ)腎活血方的核心靶點(diǎn)。

1.2.6 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在String數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)中輸入核心靶點(diǎn),得到靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系,同時(shí)導(dǎo)出PNG格式和TSV格式。將TSV格式中Node1和Node2數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1軟件,構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)。將活性成分-靶點(diǎn).xlsx文件和中藥-活性成分-靶點(diǎn).xlsx文件分別導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1軟件,構(gòu)建網(wǎng)絡(luò),預(yù)測(cè)出補(bǔ)腎活血方治療IPF的活性成分-靶點(diǎn)和中藥-活性成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,利用Network Analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?在該網(wǎng)絡(luò)中,圓的大小(Size)、透明度(Transparency)及標(biāo)簽字號(hào)(Label Font Size)均根據(jù)Degree值定義。Degree值越高表明該靶點(diǎn)的作用越關(guān)鍵,與該節(jié)點(diǎn)的連線越多。邊的粗細(xì)(Width)、透明度(Transparency)均根據(jù)Combined Score值定義。Combined Score值越高,表明2個(gè)靶點(diǎn)之間的相互作用越強(qiáng),該節(jié)點(diǎn)起到的作用越為關(guān)鍵。其中,綠色圓形圖標(biāo)代表的是核心靶點(diǎn),黃色菱形圖標(biāo)分別代表12味中藥,方形圖標(biāo)代表中藥的活性成分,其中圍繞中藥的方形圖標(biāo)是其獨(dú)特的活性成分,藍(lán)色方形圖標(biāo)代表的是某幾種中藥共有的活性成分。中藥以各自首字母縮寫為標(biāo)簽,如“黃芪”的標(biāo)簽是“HQ”,因“黃芪”與“黃芩”首字母縮寫相同,故定義黃芩的標(biāo)簽為“HQIN”。為標(biāo)準(zhǔn)化活性成分名稱,更清晰地用網(wǎng)絡(luò)圖表現(xiàn)互作關(guān)系,本研究中的所用活性成分均轉(zhuǎn)化為PubChem CID號(hào)。

1.2.7 補(bǔ)腎活血方治療IPF核心靶點(diǎn)的基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析 運(yùn)用基因列表注釋和分析網(wǎng)站(Metascape)數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/),導(dǎo)入補(bǔ)腎活血方治療IPF的50個(gè)核心靶點(diǎn),GO富集分析和KEGG富集分析,限定物種為“homo sapiens”,篩選P<0.05的條目,最終富集結(jié)果包括:生物過程(Bioligical Process,BP)、細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)、分子功能(Mokecular Function,MF)相關(guān)過程。對(duì)富集排名靠前的20個(gè)條目作圖,并把核心靶點(diǎn)投射到KEGG通路圖中以預(yù)測(cè)補(bǔ)腎活血方治療IPF的分子機(jī)制。

1.2.8 分子對(duì)接分析 分子對(duì)接主要用于蛋白質(zhì)和小分子的結(jié)構(gòu)對(duì)接,并評(píng)估小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的親和力。若對(duì)接的Affinity值為負(fù)值,則提示小分子和蛋白質(zhì)的結(jié)合是自主有效的[16]。本研究在PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中對(duì)排名前10的靶基因胱天蛋白酶3(Caspase 3,CASP3)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)、Jun激酶(Jun Kinase,JNK)、腫瘤蛋白p53(Tumor Protein P53,TP53)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT Serine/Threonine Kinase 1,AKT1)、促分裂原活化的蛋白激酶3(Mitogen-Activated Protein Kinase 3,MAPK3)、C-X-C基序趨化因子配體8(C-X-C Motif Chemokine Ligand 8,CXCL8)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase 9,MMP9)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)、細(xì)胞間黏附分子(Intercellular Adhesion Molecule,ICAM)與補(bǔ)腎活血方中GED值排名靠前的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。首先,查找合適的蛋白構(gòu)象并準(zhǔn)備PDB文件,查找的基本原則[17]如下:1)來源于人(Homo Sapiens)的蛋白結(jié)構(gòu);2)構(gòu)象分辨率一般在2.5 ?以內(nèi),盡可能清晰;3)蛋白質(zhì)構(gòu)象序列要盡量完整,結(jié)構(gòu)復(fù)合體中必須要有小分子配體信息;4)結(jié)晶pH值應(yīng)盡量接近人體正常生理范圍;然后,運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫準(zhǔn)備相應(yīng)活性成分的結(jié)構(gòu)圖,以mol2格式保存;最后將二者導(dǎo)入采用AutoDock Vina軟件,加氫,去水,進(jìn)行分子對(duì)接。根據(jù)對(duì)接結(jié)果,選擇Affinity為負(fù)值且均方根差(Root Mean Square Deviation,RMSD)分值<2[18]的利用PyMol 2.5.2軟件進(jìn)行可視化分析。

1.2.9 補(bǔ)腎活血方與批準(zhǔn)藥物共同靶點(diǎn)的KEGG富集分析與分子對(duì)接 本研究對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行了KEGG富集分析,并通過PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)對(duì)IPF的分子機(jī)制進(jìn)行文獻(xiàn)檢索,將共同靶點(diǎn)中的血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)、血小板衍生生長因子(Platele Derived Growth Factor,PDGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)的受體以及Lyn原癌基因(LYN Proto-Oncogene,LYN)、細(xì)胞色素P450家族3亞家族A成員4(Cytochrome P450 Family 3 Subfamily A Member 4，CYP3A4)確定為本研究的關(guān)鍵靶點(diǎn)，將關(guān)鍵靶點(diǎn)與補(bǔ)腎活血方中對(duì)應(yīng)的QED值和藥靶相關(guān)性較高的活性化合物進(jìn)行分子對(duì)接。同時(shí)將吡非尼酮、尼達(dá)尼布與各自對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)每次對(duì)接進(jìn)行打分。

1.2.10 含藥(補(bǔ)腎活血方)血清制備 補(bǔ)腎活血方中藥湯藥制備:根據(jù)人的用藥量,結(jié)合人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比值表分別計(jì)算。將8倍新西蘭兔等效劑量的中藥準(zhǔn)確稱取,加入8倍量的水浸泡后煎煮,水沸后小火煎煮約30 min后濾出藥液;然后,再次加入6倍量的水繼續(xù)煎煮20 min濾出藥液。將2次藥液合并后過濾濃縮,濃度為3 g/mL,置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

制備過程:健康新西蘭兔按照隨機(jī)數(shù)字表法分為含藥血清組和正常血清組。給予8倍新西蘭兔等效劑量的中藥灌胃,給藥量為56 g/kg(生藥量),灌胃前禁食不禁水12 h,1次/d,連續(xù)給藥7 d后,第7天灌胃1次,給足1 d劑量。末次給藥后1 h在家兔自然清醒狀態(tài)下,以1%利多卡因5 mL腹腔內(nèi)注射麻后從腹主動(dòng)脈采血。血液于37 ℃下靜置1 h,待凝血后以5 000 r/min,離心半徑8 cm,離心10 min,常規(guī)分離血清,并將同組家兔的血清合并,56 ℃水浴30 min滅活補(bǔ)體,用0.22 μm醋酸纖維素膜過濾除菌,-20 ℃保存?zhèn)溆?。正常血清組:以生理鹽水灌胃,相同方法采血制備血清。

1.2.11 MTT法篩選含藥(補(bǔ)腎活血方)血清的最佳血藥濃度 將細(xì)胞隨機(jī)分為正常組(正常DMEM培養(yǎng)基)及不同稀釋濃度(1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128)含藥血清干預(yù)組等9組,每組8個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中,于培養(yǎng)24 h后,吸棄培養(yǎng)液,培養(yǎng)板每孔加入20 μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽液(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT),培養(yǎng)箱中孵育4 h后,吸取MTT液,加入DMSO,振蕩搖勻后在避光孵育15 min,選擇波長490 nm處,酶標(biāo)儀讀取各孔OD值并記錄。統(tǒng)計(jì)每組OD值,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次。

1.2.12 CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測(cè)含藥血清對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖及增殖抑制率的影響 增殖抑制率(%)=(1-觀察組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。將人胚肺成纖維細(xì)胞以1×105/孔接種于96孔板,培養(yǎng)24 h,空白對(duì)照組,TGF-β1處理組,TGF-β1處理+最佳濃度含藥血清干預(yù)1 h組(含藥血清組)分別加入不同溶液,空白對(duì)照組加入等量PBS溶液,作用24 h,吸去上清,除空白對(duì)照組外,每孔加入TGF-β1繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后將對(duì)應(yīng)孔更換100 μL新的培養(yǎng)基,分別加入10%的CCK-8,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),4 h后取出,放入酶標(biāo)儀中,450 nm測(cè)OD值。

1.2.13 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)檢測(cè)1型膠原(Type I Collagen,COL-Ⅰ)、IL-17A、輕鏈3Ⅱ(Light Chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ)(膜型自噬體)含量的變化 抽提總蛋白,具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。最后放入凝膠成像儀中顯影。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎活血方活性成分及核心靶點(diǎn) 在獲取的524個(gè)化合物經(jīng)過如前所述的篩選之后,最終有201個(gè)的補(bǔ)腎活血方的化合物和對(duì)應(yīng)的470個(gè)靶點(diǎn)被保留下來用于后續(xù)的分析。上述470個(gè)靶點(diǎn)與IPF疾病基因取交集,此時(shí)得到的靶點(diǎn)即為本研究中補(bǔ)腎活血方的50個(gè)交集靶點(diǎn)。見圖1。50個(gè)交集靶點(diǎn)分別是TGFB1、CCL2、CXCL8、CXCL5、IL-13、IL-1B、CXCR3、IFNG、EDN1、CXCL9、MMP9、CXCL12、TIMP1、CCR4、MMP1、CXCR2、CXCL10、CCR6、VCAM1、CXCR1、CXCL1、FN1、CCR7、TNF、AGT、COL1A1、IL-6、LPAR1、VEGFA、SERPINE1、ALOX5、CTNNB1、AKT1、IL-10、ACTB、ALB、CXCR4、CCR2、AGTR2、STAT3、TP53、TLR4、JNK、HIF1A、MMP2、MPO、MAPK3、ICAM1、PPARG、CASP3。另外,交集靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的補(bǔ)腎活血方活性成分共118個(gè)。

圖1 補(bǔ)腎活血方與IPF交集靶點(diǎn)示意圖

2.2 基于網(wǎng)絡(luò)的靶點(diǎn)相關(guān)性分析 分別計(jì)算Original Average Score和Random Average Score,這個(gè)過程被獨(dú)立重復(fù)了500次,P<0.01。見表1。

表1 基于網(wǎng)絡(luò)的靶點(diǎn)相關(guān)性分析結(jié)果

2.3 補(bǔ)腎活血方治療IPF的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 Degree值較高的核心靶點(diǎn)有CASP3、TNF、JNK、TP53、AKT1、MAPK3、IL-6、MMP9和CXCL8等。見圖2。

圖2 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 補(bǔ)腎活血方治療IPF的活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 通過前述篩選,共有118種補(bǔ)腎活血方的活性成分對(duì)應(yīng)50個(gè)核心靶點(diǎn)。見圖3?；钚猿煞?核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中,有168個(gè)節(jié)點(diǎn),801條作用關(guān)系。拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示,白藜蘆醇(CID445154)具有最多的潛在靶點(diǎn),有62個(gè);其次是槲皮素(CID5280343)和腺苷(CID60961),分別含有35個(gè)潛在靶點(diǎn)和32個(gè)潛在靶點(diǎn)。從蛋白靶點(diǎn)的角度分析,Degree值較高的靶點(diǎn)有:CASP3、TNF、JNK、TP53、AKT1、MAPK3、IL-6、MMP9、CXCL8、PPARG等。其中CASP3和TNF分別與58個(gè)化合物、43個(gè)化合物存在相互作用。

圖3 活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.5 補(bǔ)腎活血方治療IPF的中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中包含198個(gè)節(jié)點(diǎn),1 325條作用關(guān)系。見圖4。為了更好地表征中藥、活性成分與核心靶點(diǎn)的關(guān)系,分別在表2和表3中展示出了共有活性成分在補(bǔ)腎活血方中的分布以及活性成分和核心靶點(diǎn)在補(bǔ)腎活血方中的分布。其中,補(bǔ)腎活血方中的共有活性成分共有39種,以補(bǔ)腎藥山茱萸中分布的各種活性成分和核心靶點(diǎn)最多,其次為益氣活血藥,如黃芪、人參、當(dāng)歸、丹參、虎杖等,再次是斂陰潤肺止咳藥,如人參、麥冬、川貝、五味子等。諸藥配伍,加強(qiáng)共有活性成分及核心靶點(diǎn)發(fā)揮作用。

表2 共有活性成分在補(bǔ)腎活血方中的分布

表3 活性成分和核心靶點(diǎn)在補(bǔ)腎活血方中的分布(個(gè))

圖4 中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.6 核心靶點(diǎn)GO分析和KEGG分析結(jié)果 GO分析結(jié)果顯示共有1 464個(gè)BP,27個(gè)CC和60個(gè)MF相關(guān)過程。其中涉及BP富集排名靠前的有:運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)節(jié)、白細(xì)胞遷移、細(xì)胞成分的正向調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、血管發(fā)育、趨化性、反射運(yùn)動(dòng)等。涉及CC富集排名靠前的有:薄膜側(cè)面、質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞外基質(zhì)、外封裝結(jié)構(gòu)、含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)、分泌顆粒管腔、胞質(zhì)小泡腔、水泡腔、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、血小板α顆粒管腔區(qū)等。涉及MF富集排名靠前的有:信號(hào)受體調(diào)節(jié)活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活動(dòng)、信號(hào)受體激活物的活性、細(xì)胞因子活性、G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合、趨化因子受體結(jié)合、G蛋白耦聯(lián)肽受體活性、肽受體活性、生長因子活性等。見圖5。KEGG分析結(jié)果顯示P<0.05的富集排名前20位的條目進(jìn)行可視化展示,包括:細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、糖尿病患者年齡-RAGE信號(hào)通路的研究并發(fā)癥、癌癥中的通路、趨化因子信號(hào)通路、蛋白多糖與癌癥、IL-17信號(hào)通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、流體切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、甲型流感等。見圖6。

圖5 核心靶點(diǎn)GO分析(TOP10)

圖6 核心靶點(diǎn)的KEGG分析

2.7 補(bǔ)腎活血方活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接 結(jié)果顯示與CASP3蛋白構(gòu)象穩(wěn)定的小分子有:黃芩黃酮1,結(jié)合能為-6.6 kcal/mol(1 kcal/mol=4.184 kJ/mol),RMSD=1.4 ?。與TNF蛋白構(gòu)象穩(wěn)定的小分子有:漢黃芩素,結(jié)合能為-9.4 kcal/mol,RMSD=0.7 ?。與JNK蛋白構(gòu)象穩(wěn)定的小分子有:千層紙素,結(jié)合能為-9.3 kcal/mol,RMSD=0.8 ?。與TP53蛋白構(gòu)象穩(wěn)定的小分子有:漢黃芩素,結(jié)合能為-7.5 kcal/mol,RMSD=1.1?。與AKT1蛋白構(gòu)象穩(wěn)定的小分子有:漢黃芩素,結(jié)合能為-9.3 kcal/mol,RMSD=0.9 ?。與MAPK3蛋白構(gòu)象穩(wěn)定的小分子有:二氫木蝴蝶素A,結(jié)合能為-8.3 kcal/mol,RMSD=0.8 ?。與IL-6蛋白構(gòu)象穩(wěn)定的小分子有:千層紙素,結(jié)合能為-5.9 kcal/mol,RMSD=0.5 ?。與MMP9蛋白構(gòu)象穩(wěn)定的小分子有:漢黃芩素,結(jié)合能為-9 kcal/mol,RMSD=1.1 ?。與ICAM1蛋白構(gòu)象穩(wěn)定的小分子有:大豆苷元,結(jié)合能為-8.4 kcal/mol,RMSD=0.5 ?。以結(jié)合能對(duì)構(gòu)象的穩(wěn)定性進(jìn)行排序,得到前3位的對(duì)接模式。見圖7。

圖7 補(bǔ)腎活血方活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接模式注:A.漢黃芩素-TNF(PDBID:5wjj);B.千層紙素-JNK(PDBID:4EBV);C.漢黃芩素-AKT1(PDBID:4ENJ)

2.8 基于KEGG富集分析與分子對(duì)接比較補(bǔ)腎活血方與批準(zhǔn)藥物 尼達(dá)尼布和吡非尼酮的相關(guān)靶點(diǎn)與補(bǔ)腎活血方相關(guān)靶點(diǎn)交集包括血管內(nèi)皮生長因子受體1(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1,VEGFR1)、血小板衍生生長因子受體(Platelet Derived Growth Factor Receptor Alpha,PDGFRA)、成纖維細(xì)胞生長因子Ⅱ型受體(Fibroblast Growth Factor Receptor 2,FGFR2)、Lyn原癌基因(LYN Proto-Oncogene,LYN)、CYP3A4等。見表4。KEGG通路分類主要涉及新陳代謝、環(huán)境信息處理等方面。見圖8。其中Ras信號(hào)通路和PI3K-AKT信號(hào)通路富集最顯著。其中,與VEGFR2蛋白構(gòu)象穩(wěn)定的小分子有:白藜蘆醇,結(jié)合能為-9.1 kcal/mol,RMSD=1.1 ?;與FGFR2、LYN蛋白構(gòu)象穩(wěn)定的小分子有:環(huán)巴胺,結(jié)合能分別為-10 kcal/mol、-8.9 kcal/mol,RMSD=0.3 ?。見表5～6,圖9。

表4 補(bǔ)腎活血方與批準(zhǔn)藥物之間的共同靶點(diǎn)

表5 補(bǔ)腎活血方與批準(zhǔn)藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接參數(shù)

表6 補(bǔ)腎活血方及批準(zhǔn)藥物的活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

圖8 補(bǔ)腎活血方與批準(zhǔn)藥物共同靶點(diǎn)的KEGG富集分類

圖9 補(bǔ)腎活血方活性成分與批準(zhǔn)藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接模式注:A.白藜蘆醇-VEGFR2(PDB ID:3VHE);B.環(huán)巴胺-FGFR2(PDB ID:3RI1);C.環(huán)巴胺-LYN(PDB ID:6FMN)

2.9 MTT法篩選含藥(補(bǔ)腎活血方)血清的最佳血藥濃度 與對(duì)照組比較,隨含藥血清作用濃度的升高,對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞均有明顯的抑制作用,抑制程度逐漸增強(qiáng),呈劑量依賴性,當(dāng)含藥血清的藥物濃度達(dá)0.062 5倍(1/16)時(shí),使細(xì)胞抑制率達(dá)到10.06%,該藥物劑量下,細(xì)胞抑制率較低,對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞損傷小,藥物濃度相對(duì)安全,可以考慮將含藥血清濃度稀釋16倍后的濃度定為該實(shí)驗(yàn)的最佳血藥濃度。見圖10。

圖10 不同濃度含藥血清對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的抑制情況

2.10 CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測(cè)含藥血清對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖及增殖抑制率的影響 與空白對(duì)照組比較,TGF-β1處理組的人胚肺成纖維細(xì)胞增殖水平顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),增殖率為15.2%。與TGF-β1處理組比較,含藥血清組細(xì)胞增殖水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),并且用補(bǔ)腎活血方后的細(xì)胞增殖抑制率為22.7%。見表7。

表7 含藥血清對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖及增殖抑制率的影響

2.11 各組人胚肺成纖維細(xì)胞中COL-Ⅰ、IL-17A、自噬小體LC3-Ⅱ蛋白含量情況 COL-Ⅰ:TGF-β1處理組細(xì)胞中COL-Ⅰ蛋白含量較空白組明顯增多,而含藥血清組細(xì)胞中COL-Ⅰ蛋白含量較TGF-β1處理組明顯降低。IL-17A:TGF-β1處理組細(xì)胞中IL-17A蛋白含量較空白對(duì)照組明顯增多,而含藥血清組細(xì)胞中IL-17A蛋白含量較TGF-β1處理組明顯減少。LC3-Ⅱ:與TGF-β1處理組比較,含藥血清組細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白含量明顯增多。見圖11。

圖11 各組人胚肺成纖維細(xì)胞中COL-Ⅰ、IL-17、自噬小體LC3-Ⅱ蛋白含量情況

肺纖維化的發(fā)病機(jī)制尚未探明,現(xiàn)有的研究認(rèn)為反復(fù)的肺泡上皮損傷觸發(fā)了纖維化的早期發(fā)展。這些損傷,再加上失調(diào)的傷口修復(fù)和成纖維細(xì)胞功能障礙,導(dǎo)致終末期肺纖維化中持續(xù)的組織重塑和纖維化[19]。

在IPF循證指南中,推薦有條件地使用尼達(dá)尼布和吡非尼酮來治療IPF[6]。隨著時(shí)間的推移,這些藥物已被證明可以降低IPF患者用力肺活量的下降速度[20-25]。其中,尼達(dá)尼布是一種三重酪氨酸激酶的細(xì)胞內(nèi)抑制劑,包括抑制PDGF、FGF、VEGF等受體的激活[26]。吡非尼酮?jiǎng)t被證明是一種細(xì)胞因子和生長因子調(diào)節(jié)劑,對(duì)多條通路具有抑制作用[27]。但是,這2種藥物雖然可以防止IPF的惡化,卻不能改善病情,其效果與患者的耐受性相關(guān),現(xiàn)有的臨床研究發(fā)現(xiàn)惡心和皮疹是吡非尼酮治療中常見的不良反應(yīng),而腹瀉和肝功能異常在尼達(dá)尼布的治療中更常見[28]。而中藥在確定對(duì)抗纖維化有效的基礎(chǔ)上,可以通過個(gè)體化辨證、配伍或調(diào)整劑型等方法最大限度地減少不良反應(yīng),增強(qiáng)IPF患者對(duì)治療的依從性和耐受性,從而更好地改善病情。

在先前的臨床研究中已發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血方具有抗纖維化作用[29],但具體機(jī)制不明。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面表明了補(bǔ)腎活血方對(duì)治療IPF具有顯著特異性,另一方面發(fā)現(xiàn)CASP3、TNF、JNK、TP53、AKT1、MAPK3、IL-6、MMP9、CXCL8、PPARG靶點(diǎn)在補(bǔ)腎活血方治療IPF中發(fā)揮著重要作用。另外,漢黃芩素與核心靶點(diǎn)TNF、AKT1、MMP9、TP53均表現(xiàn)出良好的結(jié)合構(gòu)象,可能是該方發(fā)揮作用的關(guān)鍵活性成分。不僅如此,為了借助已認(rèn)證藥物尋找新藥,分子對(duì)接結(jié)果顯示,補(bǔ)腎活血方中的其他多種成分與已批準(zhǔn)藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)PDGF、FGF、VEGF的受體以及LYN,也具有穩(wěn)定的結(jié)合力,其親和力以及方均根偏差(Root-mean-square Deviation,RMSD評(píng)分與已批準(zhǔn)藥物的類似,由此推測(cè),補(bǔ)腎活血方的抗纖維化作用部分地通過阻斷PDGF受體、FGF受體、VEGF受體的激活來阻斷成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化,抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,抑制炎癥和血管生成而實(shí)現(xiàn),而白藜蘆醇、環(huán)巴胺最具此類功效。

從富集結(jié)果來看,補(bǔ)腎活血方大部分作用于感染和免疫類的通路,受影響較大的通路有細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine Recepetor Interaction)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。將補(bǔ)腎活血方的核心靶點(diǎn)投射到這些富集的通路中,受影響最大的通路是細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路,它參與細(xì)胞天然和適應(yīng)性的宿主炎癥防御、細(xì)胞生長、分化、細(xì)胞死亡、血管生成以及發(fā)育和修復(fù)過程,旨在恢復(fù)體內(nèi)平衡[30]。但是,病理狀態(tài)下,重復(fù)的上皮損傷修復(fù)帶來的慢性炎癥可能導(dǎo)致了纖維化的發(fā)生[31]。補(bǔ)腎活血方中的活性成分調(diào)控了這一通路中的27個(gè)靶點(diǎn),如趨化性細(xì)胞因子,涉及CXC、CC 2個(gè)亞族,包括關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)IL-1B、IL-6、TNF、IL-17,參與適應(yīng)免疫的細(xì)胞因子:IL-13,以及TGF-β1[32]。在纖維化早期,補(bǔ)腎活血方中的活性成分可能通過這一通路,發(fā)揮抗炎作用,減少炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子的積累,在纖維化的后期,補(bǔ)腎活血方中的活性成分可能通過抑制TGF-β1,調(diào)節(jié)成FGF,從而抑制成纖維細(xì)胞增殖、肌成纖維細(xì)胞分化、膠原和纖維連接蛋白的合成以及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。在治療IPF中這一通路主要是通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)發(fā)揮的作用,有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,在小鼠中,通過抑制IL-8作用來阻斷中性粒細(xì)胞趨化可減緩博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的發(fā)展[33],這佐證了抑制炎癥通路在治療IPF中的重要性。然而在臨床試驗(yàn)中,潑尼松、硫唑嘌呤和N-乙酰半胱氨酸三聯(lián)抗炎方案與安慰劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,甚至增加了患者的住院及死亡風(fēng)險(xiǎn)[34-35]。關(guān)于這一矛盾,有研究者認(rèn)為IPF患者的自然病史和臨床病程差異很大,尚不能確定炎癥在多大程度上是疾病的共同驅(qū)動(dòng)因素,還是僅僅是一種附帶現(xiàn)象,但可以預(yù)測(cè)會(huì)有一部分患者受益于額外的或者低劑量的抗炎療法[32],或者說,在一定程度上,部分患者可能通過藥物的抗炎機(jī)制獲益。

除了調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),這條通路中還包含了IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路中的基因,同時(shí)也是本研究富集到的2條關(guān)鍵通路,與免疫、腫瘤相關(guān)。TNF通過與IL-1β和IL-6協(xié)同誘導(dǎo)VEGF的產(chǎn)生,在血管生成中發(fā)揮作用[36]。另有研究表明IPF患者的肺泡灌洗液中的VEGF水平與蛋白通透性指數(shù)以及MMP3、7和9的水平正相關(guān)[37],而血清VEGF濃度則與IPF患者病情嚴(yán)重程度相關(guān),可以作為預(yù)測(cè)預(yù)后的一種生物標(biāo)志物[38],所以抑制TNF通路或者抑制VEGF受體的激活有望成為治療IPF的又一機(jī)制。通過分子對(duì)接發(fā)現(xiàn),補(bǔ)腎活血方中的漢黃芩素(CID5281703)與TNF有穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象,具有抗纖維化、抗癌作用[39-41],白藜蘆醇(CID445154)與VEGFR2也有著穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象,能夠通過抑制TGF-β/Smad/ERK信號(hào)通路來預(yù)防博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[42],在體內(nèi)外通過抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、衰老、纖維化和腫瘤等對(duì)肺部疾病有良好的治療作用[43]。當(dāng)然,除了補(bǔ)腎活血方中的活性成分在上述關(guān)鍵通路和核心靶點(diǎn)中發(fā)揮重要作用之外,傳統(tǒng)的“君、臣、佐、使”的配伍也使各個(gè)中藥發(fā)揮著更好的協(xié)同作用。此外,實(shí)驗(yàn)部分發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血方可有效的降低人胚肺成纖維細(xì)胞內(nèi)的膠原蛋白的含量,其作用途徑可能與阻斷IL-17A通路,激活細(xì)胞自噬有關(guān),部分驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)。

綜上所述,通過中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接以及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,為補(bǔ)腎活血方中的活性成分通過多靶點(diǎn)多通路治療IPF提供了客觀依據(jù),體現(xiàn)了中藥復(fù)方多通路多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn),在后續(xù)工作應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步完善中醫(yī)證候與生物信息之間的關(guān)系,將補(bǔ)腎活血方中的分子對(duì)接良好的活性成分,如白藜蘆醇、漢黃芩素、環(huán)巴胺等進(jìn)行深入的實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證其抗纖維化的作用機(jī)制。

利益沖突聲明:無。