夏春勇,丁玲,賀小艷,黃莉娟,常秋紅,秦麗娟,曹珍銘,劉潔

(重慶大學(xué)附屬江津醫(yī)院藥學(xué)部,重慶 402260)

靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism,VTE)是一類靜脈回流障礙性疾病,發(fā)病是因血液在靜脈內(nèi)不正常地凝結(jié),使血管完全或不完全阻塞所導(dǎo)致。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),惡性腫瘤患者為VTE發(fā)生的高危人群,惡性腫瘤患者VTE發(fā)生相較于非腫瘤患者高4～7倍,發(fā)病率為4%～20%[1]。近年來,隨著我國精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展,相關(guān)研究已證實VTE的發(fā)生、發(fā)展受纖溶酶原激活劑抑制物-1(plasminogen activetor inhibitor-1,PAI-1)基因4G/5G的多態(tài)性影響,PAI-1基因多態(tài)性會引起血漿中纖維蛋白溶解異常進(jìn)而導(dǎo)致VTE的形成[2]。但現(xiàn)有的關(guān)于PAI-1基因多態(tài)性與靜脈血栓的相關(guān)性研究在腫瘤患者群體中的研究較少且無藥物預(yù)防策略[2-6]。因此,為減少腫瘤患者VTE的發(fā)生,同時提高腫瘤患者的生存率,本課題通過選擇遺傳因子PAI-1基因多態(tài)性作為切入點,研究其與腫瘤患者VTE的相關(guān)性,同時對PAI-1基因指導(dǎo)VTE預(yù)防效果加以驗證,旨在為臨床VTE的診斷、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象 基因差異性比較對象為我院于2019年8月—2020年12月收治的148例惡性腫瘤患者;基因干預(yù)研究對象為2021年5—12月新收治的60例惡性腫瘤患者,患者在入組前均獲取知情同意并簽署知情同意書。本研究方案經(jīng)重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批件號:KY2020003)。基因差異性比較納入標(biāo)準(zhǔn):符合惡性腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)?；蚋深A(yù)研究納入標(biāo)準(zhǔn):①符合惡性腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn);②入院時非VTE患者。排除標(biāo)準(zhǔn):①病歷資料不全;②伴有血栓疾病史的患者;③入院前服用過抗血小板、抗凝藥物的患者;④凝血功能異常的患者。

1.2主要檢測試劑與設(shè)備 PAI-1基因測序反應(yīng)通用試劑盒(批號:20191216027,20200611027,20210816027,濟(jì)南廣音醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn));多通道熒光定量分析儀(型號:Fascan 48S,西安天隆科技有限公司生產(chǎn))。

1.3藥物 達(dá)肝素鈉注射液,每支0.2 mL:5 000 IU,批號:F409201106,河北常山生化藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn);低分子肝素鈣注射液,每支0.4 mL:4100 IU,批號:F402210504,河北常山生化藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn);依諾肝素鈉注射液,每支0.4 mL:40 mg,批號:A1E707V,南京健友生化制藥股份有限公司生產(chǎn)。

1.4方法

1.4.1患者臨床資料收集 通過我院醫(yī)院信息系統(tǒng)查閱和收集入組患者病歷資料,記錄患者年齡、性別、體質(zhì)量、吸煙史、飲酒史、血栓家族史、糖尿病史、高血壓史、冠心病史等。

1.4.2VTE診斷標(biāo)準(zhǔn) 深靜脈血栓(deep venousth-rombosis,DVT)與淺表血栓性靜脈炎診斷均依據(jù)靜脈超聲圖像或計算機(jī)斷層掃描(CT)靜脈血管造影判斷;肺栓塞(pulmonary embolism,PE)診斷通過CT肺血管造影或肺通氣灌注掃描證實。

1.4.3患者分組 基因差異性比較通過我院醫(yī)院信息系統(tǒng)查閱病歷,根據(jù)患者是否發(fā)生VTE分為靜脈血栓組和非靜脈血栓對照組?；蚋深A(yù)研究采用單盲、隨機(jī)數(shù)字表法將新收治的非VTE的腫瘤患者分為基因指導(dǎo)組和非基因指導(dǎo)組各30例。

1.4.4PAI-1 4G/5G基因多態(tài)性檢測 采集腫瘤患者外周靜脈血2 mL,送至藥學(xué)部藥物基因檢測實驗室。具體檢測方法為:①用移液槍取樣本萃取液1 mL,加入到一支新的離心管(1.5 mL)中;②將含有患者外周靜脈血的EDTA抗凝管上下顛倒10次;③用移液槍吸取200 μL血樣加入樣本萃取液中充分混勻;④靜置10 min后,將離心管放入小型離心機(jī)中(12 000 r·min-1,7 500×g)離心3 min,之后取出離心管,可觀察到管底部有1 mm×1 mm×1 mm的白細(xì)胞富集團(tuán);⑤用移液槍吸走并打掉離心管內(nèi)上層透明的紅色液體;⑥向離心管中加入細(xì)胞保存液400 μL,振蕩混勻;⑦用移液槍取白細(xì)胞樣本液2 μL,加入到PAI-1基因檢測探針中,離心20 s;⑦將檢測探針放入多通道熒光定量分析儀完成上機(jī)檢測。

1.4.5評價標(biāo)準(zhǔn)與干預(yù)措施制定 基因指導(dǎo)組根據(jù)PAI-1 4G/5G基因檢測結(jié)果并結(jié)合D-二聚體生化指標(biāo)來評價是否為VTE高風(fēng)險人群,采取的VTE預(yù)防措施參照《腫瘤相關(guān)靜脈血栓栓塞癥預(yù)防與治療指南(2019版)》制定[1]。非基因指導(dǎo)組無基因篩查未采取VTE預(yù)防措施。

1.4.6統(tǒng)計指標(biāo) 化療期間及化療后15 d內(nèi)進(jìn)行隨訪,觀察患者是否為靜脈血栓栓塞事件(深靜脈血栓、淺表血栓性靜脈炎、肺栓塞),統(tǒng)計例數(shù)和發(fā)生率。

2 結(jié)果

2.1基因差異性研究

2.1.1一般資料 基因差異性比較共納入腫瘤患者148例,其中發(fā)生VTE腫瘤患者30例,未發(fā)生VTE腫瘤患者118例。兩組經(jīng)一般資料比較,各項基線信息均差異統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 兩組患者的基線信息比較

2.1.2PAI-1 4G/5G基因檢測結(jié)果 148例進(jìn)行PAI-1 4G/5G基因檢測的患者,經(jīng)基因檢測結(jié)果為:靜脈血栓組(30例)中,PAI-1野生型基因 5G/5G4例(13.3%),雜合子型基因4G/5G11例(36.7%),純合子型基因4G/4G15例(50%),等位基因4G出現(xiàn)的頻率為68.3%,等位基因5G出現(xiàn)的頻率為31.7%;非靜脈血栓對照組(118例)中,PAI-1野生型基因 5G/5G57例(48.3%),雜合子型基因4G/5G 51例(43.2%),純合子型基因4G/4G10例(8.5%),等位基因4G出現(xiàn)的頻率為30.1%,等位基因5G出現(xiàn)的頻率為69.9%。靜脈血栓組與非靜脈血栓對照組基因分布頻率比較,基因型和等位基因差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 PAI-1等位基因分布頻率比較

2.1.3Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 靜脈血栓組與非靜脈血栓對照組的3種基因型分布頻率,經(jīng)統(tǒng)計檢驗,預(yù)測例數(shù)和實際例數(shù)之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),符合Hardy-Weinberg遺傳平衡,表明所選取的樣本具有群體代表性。見表3。

表3 靜脈血栓組和對照組PAI-1基因型 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗

2.2基因干預(yù)研究

2.2.1基因指導(dǎo)用藥情況 在基因干預(yù)研究中,共納入60例入院診斷為非VTE的腫瘤患者,隨機(jī)數(shù)字表法分為:基因指導(dǎo)組(30例)和非基因指導(dǎo)組(30例)。一般資料比較與“2.1.1”項相同。經(jīng)比較,兩組腫瘤患者基線水平一致。基因指導(dǎo)組均經(jīng)PAI-1 4G/5G基因檢測,其結(jié)果為:突變純合子(4G4G)6例,突變雜合子(4G5G)17例,野生型(5G5G)7例。根據(jù)PAI-1基因檢測結(jié)果采取的VTE預(yù)防措施:突變純合子(4G4G)給予肝素抗凝,突變雜合子(4G5G)中若入院D-二聚體高于正常值范圍給予肝素抗凝,其余情況不采取VTE預(yù)防措施?；蛑笇?dǎo)組中滿足上述干預(yù)情況的研究對象合計8例,分別為突變純合子(4G4G)6例,突變雜合子(4G5G)且D-二聚體高于正常值范圍2例。見表4。

表4 基因檢測指導(dǎo)腫瘤患者個體化用藥

2.2.2靜脈血栓栓塞事件比較 基因指導(dǎo)組經(jīng)PAI-1基因檢測并根據(jù)基因檢測和D-二聚體結(jié)果對患者進(jìn)行VTE預(yù)防后,發(fā)生靜脈血栓栓塞事件0例。非基因指導(dǎo)組中發(fā)生靜脈血栓栓塞事件4例(均為深靜脈血栓),發(fā)生率為13.33%?；蛑笇?dǎo)組靜脈血栓栓塞事件發(fā)生率明顯低于非基因指導(dǎo)組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

3.1PAI-1 4G/5G基因多態(tài)性 PAI-1是纖溶系統(tǒng)的主要生理抑制劑,其含量和活性增加可降低纖溶活性,促進(jìn)血栓的形成和發(fā)展。研究表明,PAI-1基因啟動子區(qū)-675位的4G/5G多態(tài)性與PAI-1表達(dá)水平密切相關(guān)[7]。PAI-1 4G/5G基因多態(tài)性是一種單核苷酸多態(tài)性,位于人類的基因啟動子區(qū)-675位,包括23個外顯子和22個內(nèi)含子,在該基因位點處由于鳥嘌呤的插入或缺失導(dǎo)致PAI-1基因多態(tài)性,包括突變純合子4G/4G,突變雜合子4G/5G以及野生型5G/5G[8]。在PAI-1基因相關(guān)研究中[9-10],PAI-1基因中的4G等位基因能夠通過上調(diào)PAI-1基因表達(dá)從而引起血漿PAI-1濃度升高,使患者處于髙凝狀態(tài),表現(xiàn)出血栓傾向。本課題第一部分基因差異性研究中,靜脈血栓栓塞組等位基因4G出現(xiàn)的頻率為68.3%,相較于非靜脈血栓栓塞組的等位基因4G出現(xiàn)頻率30.1%,明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。除等位基因4G與VTE風(fēng)險增加有關(guān)外,文獻(xiàn)研究中提到,突變純合子也會導(dǎo)致VTE風(fēng)險增加[11]。本研究靜脈血栓栓塞組中突變純合子4G/4G分布頻率為50%,也遠(yuǎn)高于對照組的8.5%。綜上所述,本研究PAI-1 4G/5G基因與VTE的相關(guān)性結(jié)論和文獻(xiàn)研究一致,且可適用于惡性腫瘤患者。此外,本研究顯示,靜脈血栓栓塞組與對照組的 4G/5G基因多態(tài)性和基因頻率均合Hardy-Weinberg遺傳平衡,所選樣本具有群體代表性。

3.2PAI-1 4G/5G基因檢測在腫瘤患者VTE預(yù)防中的價值 VTE是繼心肌梗死和腦卒中之后的第三大心血管死亡原因,每年全球因VTE死亡的人數(shù)超過300萬[12-13]。 腫瘤是VTE發(fā)生的高危險因素。相關(guān)研究表明,惡性腫瘤患者VTE發(fā)生相較于非腫瘤患者高4～7倍,其發(fā)病率為4%～20%[1]。盡管VTE在腫瘤患者中的發(fā)病率高,但事實上腫瘤患者住院期間接受血栓預(yù)防實施率卻很低[14]。究其原因,目前臨床上在用的血栓風(fēng)險評估量表(如:caprini模型)較為復(fù)雜,臨床上缺少一種快速、準(zhǔn)確且行之有效的VTE高危人群篩選手段。因此,為找到一種更佳的篩查方法,本課題第二部分采取基因干預(yù)研究,基因干預(yù)組首先通過PAI-1基因檢測結(jié)果并結(jié)合D-二聚體評估該患者是否為VTE高風(fēng)險人群。針對VTE高風(fēng)險人群,采取抗凝預(yù)防。最終結(jié)果表明,基因干預(yù)組靜脈血栓栓塞事件發(fā)生率明顯低于非基因干預(yù)對照組。

綜上所述,對于腫瘤患者可通過PAI-1 4G/5G基因篩查并結(jié)合D-二聚體識別出VTE高風(fēng)險人群,以便盡早采取VTE預(yù)防措施,減少腫瘤患者VTE的發(fā)生,大大提高腫瘤患者的生活質(zhì)量。本研究不足之處:由于納入的樣本量較少,缺乏對不同腫瘤類型及轉(zhuǎn)移做更深入的研究,PAI-1 4G/5G基因篩查作為腫瘤患者VTE高危人群的篩查手段有待進(jìn)一步研究驗證。