張光潔，全秀振，李小敏，譚 軍

1.湖南省衡陽(yáng)市畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心，湖南衡陽(yáng) 421001；2.湖北省黃石市佳興生物科技有限公司，湖北黃石 435100；3.湖南省衡陽(yáng)市病害豬無(wú)害化處理中心，湖南衡陽(yáng)421001

蛋鴨是我國(guó)的主要養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)之一，為滿足人民群眾的生活需求，養(yǎng)鴨規(guī)模加大，鴨病的發(fā)生率也顯著升高[1]。在眾多鴨病中，鴨坦布蘇病毒（DTMUV）和鴨疫里默氏桿菌（RA）這2 種病原體引起的疾病對(duì)蛋鴨和肉鴨經(jīng)濟(jì)造成了嚴(yán)重危害[2]，其中DTMUV會(huì)使產(chǎn)蛋量急劇下降，最嚴(yán)重的可導(dǎo)致絕產(chǎn)，RA 是目前養(yǎng)鴨業(yè)中最嚴(yán)重的致病菌之一，發(fā)病率高，疫苗交叉保護(hù)有限，二者影響了養(yǎng)鴨行業(yè)的健康發(fā)展[3]。在臨床實(shí)際情況中，鴨病的發(fā)生少見(jiàn)單個(gè)病原體感染，常為混合感染或繼發(fā)感染，為鴨病的診斷和防治帶來(lái)了很大的困難[4]。本研究運(yùn)用病理剖檢、細(xì)菌分離鑒定、病毒PCR 檢測(cè)等方法，對(duì)湖南省某鴨場(chǎng)患病鴨進(jìn)行疾病診斷，為這2 種病原體混合感染的診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備及試劑

無(wú)支原體胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；0.25%胰酶溶液（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；Taq DNA 聚合酶、Eastap Buffer、1dNTP（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；Omega 膠回收試劑盒（北京Solarbio 科技有限公司）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit(200)，OMEGA 公司，貨號(hào)D2500-02）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司，貨號(hào)RR047A）；TRIzol試劑（Invitrogen 公司，貨號(hào)15596-026）；Tris-Hcl、Maleic acid Mo375（Sigma 公司）；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅰ（Roche公司，貨號(hào)14761221）；全自動(dòng)脫水機(jī)、自動(dòng)染色封片一體機(jī)（德國(guó)萊卡公司），Nikon80i 生物光學(xué)顯微鏡為上海橫橋儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 病料的來(lái)源及處理

本研究中病鴨來(lái)源于湖南某鴨場(chǎng)發(fā)病的80 日齡蛋鴨，首先對(duì)病鴨的發(fā)病情況和臨床癥狀進(jìn)行了解，隨后對(duì)送檢發(fā)病蛋鴨進(jìn)行剖檢，觀察并記錄各組織器官的病理變化。取病鴨腦組織做細(xì)菌的分離培養(yǎng)；取腦和卵巢組織用于病毒檢測(cè)鑒定；取病鴨的腦、脊髓、坐骨神經(jīng)、肝臟、心臟、卵巢等器官組織置于10%中性福爾馬林溶液固定。

1.3 細(xì)菌的分離鑒定

1）細(xì)菌分離純化。無(wú)菌挑取病鴨的腦組織，參照文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行細(xì)菌的分離純化。

2）細(xì)菌16S rRNA。參照文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)上游引物F：5’-GAGTTT-GATCMTGGCTCAG-3’，下游引物R：5’-TACCTTGTTA-CGACTT-3’。參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行細(xì)菌DNA 提取、PCR 擴(kuò)增，測(cè)序，結(jié)果與Gen－Bank 上的序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，引物合成及測(cè)序均送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行。

1.4 病毒的分離鑒定

參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)上游引物F：5’-AGACTGCTG GTGCAATGAGAC-3’，下游引物R：5’-CGGTACCAT AATCCTCCATCTCAGC-3’，送至生工武漢技術(shù)部合成，其擴(kuò)增的預(yù)期片段大小為300 bp。參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行病毒特異性序列的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.5 病鴨的組織病理學(xué)觀察

采取的固定組織常規(guī)石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色。通過(guò)NIS-Elements 高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)配合Nikon80i 生物光學(xué)顯微鏡對(duì)組織病理變化進(jìn)行觀察記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病情況、臨床癥狀及剖檢變化

某鴨場(chǎng)自然發(fā)病的80 日齡蛋鴨，臨床癥狀主要表現(xiàn)精神萎靡不振，頭頸震顫，癱瘓，無(wú)法行走（圖1A）。剖檢可見(jiàn)肝、心表面有白色膜狀滲出物，其他各臟器未發(fā)生明顯異常（圖1B）。

圖1 病鴨的臨床癥狀和剖檢變化

2.2 細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果

腦病料無(wú)菌接種5%血清的TSA 培養(yǎng)皿，經(jīng)培養(yǎng)約36 h 后，在平板上有細(xì)小的圓形、凸起菌落生長(zhǎng)，呈透明露珠樣，革蘭氏染色顯示為陰性短桿菌。

提取分離細(xì)菌的DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果可見(jiàn)片段大小為1 500 bp 左右，與預(yù)期結(jié)果相符。將PCR 產(chǎn)物送去測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI BLAST 上分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)序列與鴨疫里默氏桿菌的相似度在98%以上。根據(jù)國(guó)際分類標(biāo)準(zhǔn)，可確定細(xì)菌為鴨疫里默氏桿菌。

2.3 鴨坦布蘇病毒的檢測(cè)與鑒定

從本試驗(yàn)的電泳結(jié)果中可以看出，擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶處于300 bp 的位置，與預(yù)期擴(kuò)增片段的大小一致。將PCR 產(chǎn)物送去測(cè)序，將序列在NCBI BLAST 上分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)序列與鴨坦布蘇病毒相似性在99%以上。根據(jù)國(guó)際分類標(biāo)準(zhǔn)，可確定病毒為鴨坦布蘇病毒。

2.4 病理組織學(xué)檢查結(jié)果

病鴨的主要病變是腦血管周圍間隙增大，水腫，淤血，腦組織出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象和噬神經(jīng)元現(xiàn)象（圖2A）；脊髓有局灶性出血和衛(wèi)星現(xiàn)象（圖2B）；坐骨神經(jīng)水腫，神經(jīng)纖維壞死、鈣化（圖2C）；卵巢血管周圍出現(xiàn)巨噬細(xì)胞、異嗜性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2D）；卵泡未見(jiàn)明顯異常；心外膜、肝被膜增厚，表面附有大量纖維素性滲出物，其中有大量異嗜性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2E、圖2F）。

3 討論

本研究通過(guò)細(xì)菌的分離鑒定和病毒的PCR 檢測(cè)，該群病鴨為鴨坦布蘇病毒和鴨疫里默氏桿菌的混合感染。鴨疫里默氏桿菌主要危害1～8 周齡尤其是1～3 周齡的雛鴨，最主要的臨床病理特征是廣泛的纖維素性漿膜炎[5]。鴨坦布蘇病毒病感染蛋鴨的主要癥狀表現(xiàn)為采食量下降，產(chǎn)蛋下降和神經(jīng)癥狀[7-8]。其中，雛鴨感染DTMUV 主要癥狀表現(xiàn)為采食量下降，共濟(jì)失調(diào)。鴨對(duì)鴨坦布蘇病毒的易感性與日齡呈相關(guān)性，且日齡越小越易感[9]。本研究中發(fā)病鴨為80 日齡蛋鴨，未到產(chǎn)蛋年齡，主要臨床癥狀為精神萎靡，出現(xiàn)劃水樣動(dòng)作，無(wú)法走路。病理組織檢查結(jié)果大腦、脊髓和坐骨神經(jīng)均有明顯病理?yè)p傷，卵巢有炎癥，肝、心漿膜有明顯的纖維素性炎，符合鴨坦布蘇病毒和鴨疫里默氏桿菌混合感染的病理特征。

雛鴨感染坦布蘇病毒，主要表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)損傷，感染該病毒后還會(huì)使病鴨免疫力下降，有免疫抑制作用[10-11]。因此，感染鴨坦布蘇病毒后，病鴨容易繼發(fā)感染其他病原體。分析推測(cè)本研究中病鴨感染鴨坦布蘇病毒病后免疫力下降，繼發(fā)鴨疫里默氏桿菌感染導(dǎo)致混合感染。在日常飼養(yǎng)中，應(yīng)加強(qiáng)鴨場(chǎng)的生物安全措施落實(shí)，做好疾病防控。在感染坦布蘇病毒時(shí)，應(yīng)及時(shí)隔離治療，避免繼發(fā)感染其他病原體。