鄧俊花，陳冬杰，魏 方，吳紹強(qiáng)

中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京100176

豬瘟(classical swine fever,CSF)是一種由經(jīng)典的豬瘟病毒（CSFV）引起的高度接觸性、傳染性疾病，為我國(guó)二類(lèi)動(dòng)物傳染病，同時(shí)也是OIE 必報(bào)疫病。該病的高發(fā)病率和高死亡率給全球范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的發(fā)展。目前，國(guó)內(nèi)豬瘟疫情的主要特點(diǎn)為溫和性、散發(fā)性、多種病原混合感染、隱性感染和亞病毒感染等，非典型豬瘟病理變化的情況時(shí)有發(fā)生[1]，這對(duì)CSF 的臨床診斷帶來(lái)了很大的困難。

目前，國(guó)內(nèi)外許多研究者建立了豬瘟病毒分子生物學(xué)診斷方法[2-12]。但是，由于缺乏安全穩(wěn)定的陽(yáng)性質(zhì)控品，使得豬瘟核酸檢測(cè)方法很難做到全程監(jiān)控。利用Amored RNA 技術(shù)制備的裝甲R(shí)NA 顆粒穩(wěn)定、易保存、安全性高，能模擬天然病毒結(jié)構(gòu)特性，與臨床樣本保持一致，可作為核酸提取、擴(kuò)增和擴(kuò)增后分析等各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)控，確保結(jié)果的真實(shí)可靠，可有效克服傳統(tǒng)RNA 物質(zhì)存在的缺陷[13-19]。本研究采用一種新型裝甲R(shí)NA 表達(dá)載體，將豬瘟檢測(cè)靶基因構(gòu)入其載體，制備的裝甲R(shí)NA 顆粒能夠代替真病毒或質(zhì)粒等物質(zhì)，用于該病核酸檢測(cè)的質(zhì)控，為豬瘟疫病監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑

豬瘟活疫苗（兔源）國(guó)家參考品，源自法國(guó)Thiverval 株(S0521207)，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；載體質(zhì)粒pTMACC，由中國(guó)檢科院實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；In-HD Cloning Kit (Clontech)及DNA 連接試劑盒(Takara)購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，RNeasy MiNi Kit（Qiagen）購(gòu)自北京宏捷科技有限公司；MagneHisTMprotein purification system（USA）購(gòu)自promega 公司。

1.2 pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 制備

豬瘟活疫苗提取RNA 核酸后，采用下列引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。引物序列為：CSFV-F：5’-CG GGGTACCTACGAGGTTAGTTCATTCTC-3’，CSFVR：5’CCCAAGCTTGTAGGTTCTTCAGTGTTG-3’。純化的PCR 產(chǎn)物與pTMACC 質(zhì)粒經(jīng)KpnI 和HindIII雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化，制備重組菌pTMACC-CSFV。該重組菌加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物加入終質(zhì)量濃度1.25 mg/L 溶菌酶37 ℃溫和裂解，上清采用噬菌體純化方式制備粗純的CSFV 裝甲R(shí)NA 顆粒。粗純產(chǎn)物采用Magne－HisTM protein purification system 系統(tǒng)純化后即為pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 物質(zhì)。

1.3 pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 結(jié)構(gòu)分析

采用SWISS-model 軟件對(duì)該顆粒外殼蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)合SDS-PAGE 電泳分析，以驗(yàn)證該顆粒為MS2 噬菌體-double CP 結(jié)構(gòu)；同時(shí)，該物質(zhì)經(jīng)80 ℃加熱5 min，觀察溶液變化，并采用瓊脂糖電泳分析，以驗(yàn)證該物質(zhì)內(nèi)含核酸類(lèi)型為RNA。

1.4 pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 形態(tài)學(xué)鑒定

CSFV 裝甲R(shí)NA 物質(zhì)經(jīng)1%醋酸雙氧鈾染色，利用透射電鏡（JEM1400）進(jìn)行形態(tài)觀察；同時(shí)，該物質(zhì)顆粒溶液借助動(dòng)態(tài)光散射儀，測(cè)定其粒子徑的大小以及溶液的均勻狀態(tài)。

1.5 pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 顆粒序列溯源性分析

CSFV 裝甲R(shí)NA 物質(zhì)送擎科生物測(cè)序公司進(jìn)行靶基因序列測(cè)定，并進(jìn)行序列溯源性分析。

1.6 pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA質(zhì)控品均勻性分析

pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 質(zhì)控品參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15000-3《樣品工作導(dǎo)則》分裝，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27540—2011《熒光RT-PCR 方法》進(jìn)行均勻性評(píng)價(jià)。隨機(jī)抽測(cè)10 份，每份重復(fù)檢測(cè)3 次，檢測(cè)數(shù)據(jù)采用方差統(tǒng)計(jì)分析，以評(píng)估該質(zhì)控品的均勻性。

1.7 pTMACC-CSFV 穩(wěn)定性分析

pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 質(zhì)控品在4、-20 ℃分別保存14 d、1 個(gè)月、2 個(gè)月、3 個(gè)月、6 個(gè)月、12個(gè)月、24 個(gè)月、36 個(gè)月。每種條件2 份，每份重復(fù)檢測(cè)3 次。檢測(cè)數(shù)據(jù)采用t 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，結(jié)合趨勢(shì)分析，評(píng)估該質(zhì)控品的穩(wěn)定性。

1.8 實(shí)用性能檢測(cè)

pTMACC-CSF 裝甲R(shí)NA 質(zhì)控品送豬瘟病毒W(wǎng)AOH 參考實(shí)驗(yàn)室中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所等8 家權(quán)威檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行性能評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CSFV 靶基因PCR 擴(kuò)增

以豬瘟活疫苗為模板提取RNA，并采用靶基因兩端特異性引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。瓊脂糖電泳顯示靶基因條帶為500～750 bp，與預(yù)期大?。?68 bp）相符（圖1）。

圖1 靶基因PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.2 pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 結(jié)構(gòu)分析

借助蛋白三維模擬器（SWISS-model）對(duì)pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 外殼蛋白（double-CP）結(jié)構(gòu)與野生型MS2 噬菌體中single-CP 結(jié)構(gòu)分別建模（圖2）。純化的裝甲R(shí)NA 顆粒進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析（圖3、圖4），顯示目的蛋白位于26～42 kμ，約是野生型MS2 噬菌體外殼蛋白分子質(zhì)量（13.7 kμ）的2 倍，與建模預(yù)測(cè)分析一致。該物質(zhì)溶液經(jīng)過(guò)80 ℃熱處理后，肉眼可見(jiàn)溶液由透明狀變?nèi)榘咨?，瓊脂糖電泳顯示：加熱后該物質(zhì)特征性條帶呈彌散性直至消失，源自該裝甲R(shí)NA 顆粒為RNA-蛋白復(fù)合物，熱處理后蛋白外殼變性，包裹RNA 核酸被釋放。

圖2 噬菌體MS2 中外殼蛋白改造的蛋白三維構(gòu)象模型對(duì)比分析

圖3 pTMACC-CSFV裝甲R(shí)NA顆粒SDS-PAGE 電泳分析

圖4 pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 顆粒核酸電泳分析

2.3 pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 形態(tài)學(xué)鑒定

純化的裝甲R(shí)NA 顆粒，經(jīng)1%醋酸雙氧鈾染色后，透射電鏡觀察（圖5）：顆粒為“外亮內(nèi)暗”規(guī)則的多邊形物質(zhì)，直徑約26 nm。該物質(zhì)經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射圖譜分析（圖6）：光譜單一，且顆粒粒徑主要分布于20～50 nm，且均值在26 nm 左右，表明溶液均勻分布，沒(méi)有顆粒聚集現(xiàn)象，且粒徑大小與透射電鏡數(shù)據(jù)吻合。

圖5 pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 顆粒透射電鏡圖

圖6 pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 顆粒動(dòng)態(tài)光散射圖譜

2.4 裝甲R(shí)NA 顆粒序列溯源性分析

該物質(zhì)測(cè)序后核酸序列圖譜分析表明，插入靶標(biāo)序列為豬瘟病毒5’UTR 特定序列，溯源至WAOH 豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室法國(guó)Thiverval 株（位點(diǎn)1～550 bp），二者同源性達(dá)99%。

2.5 pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 質(zhì)控品均勻性分析

pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 均勻性檢測(cè)數(shù)據(jù)分布如圖7。采用F 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，F(xiàn)=0.513<2.94，且P=0.848，表明該質(zhì)控品批內(nèi)精密度和總精密度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，呈均勻分布。

圖7 pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 質(zhì)控品均勻性分析圖

2.6 pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 質(zhì)控品保存穩(wěn)定性分析

pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 質(zhì)控品在不同的保存條件下，檢測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分布如圖8，檢測(cè)Ct 值采用t 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，冷藏條件下，該質(zhì)控品穩(wěn)定保存6 個(gè)月，-20 ℃保存條件下該質(zhì)控品能夠穩(wěn)定保存36 個(gè)月。

圖8 pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 質(zhì)控品保存穩(wěn)定性及趨勢(shì)分析圖

2.7 實(shí)用性能檢測(cè)

pTMACC-CSFV 裝甲R(shí)NA 質(zhì)控品經(jīng)8 家權(quán)威實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行性能評(píng)估。檢測(cè)Ct 值在20.12～22.07，符合豬瘟方法核酸陽(yáng)性質(zhì)控品的要求，能夠應(yīng)用于豬瘟臨床檢測(cè)。

3 討論

豬瘟和非洲豬瘟均是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的嚴(yán)重傳染病，在臨床和病理方面難以區(qū)分[20]。面臨非洲豬瘟疫情防控的嚴(yán)峻形勢(shì)，豬瘟疫病的監(jiān)測(cè)也刻不容緩。隨著豬瘟核酸檢測(cè)技術(shù)的普及，一種安全、穩(wěn)定、高效的陽(yáng)性質(zhì)控物質(zhì)迫切急需。

本研究依托改造后的Armored RNA 技術(shù)，采用了一種新型高效的裝甲R(shí)NA 表達(dá)載體。此載體不僅能表達(dá)高達(dá)2 000 bp 的外源RNA 片段，而且優(yōu)化了純化工藝，在保證簡(jiǎn)化工藝的同時(shí)提高了裝甲R(shí)NA 顆粒的產(chǎn)量。特定CSFV 靶基因插入該表達(dá)載體，制備了豬瘟裝甲R(shí)NA 物質(zhì)。該物質(zhì)為RNA-蛋白復(fù)合物，即豬瘟靶基因?qū)?yīng)的RNA 核酸被噬菌體外殼包裹，形成類(lèi)似天然病毒的結(jié)構(gòu)，即核酸不易降解、又無(wú)生物安全風(fēng)險(xiǎn)，是良好的核酸檢測(cè)質(zhì)控品，能夠監(jiān)測(cè)豬瘟病毒相關(guān)核酸檢測(cè)方法中核酸抽提、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增全流程，同時(shí)避免了質(zhì)粒作為質(zhì)控品易污染環(huán)境、干擾檢測(cè)結(jié)果等弊端。豬瘟病毒裝甲R(shí)NA 質(zhì)控品均勻性良好，且穩(wěn)定性強(qiáng)。在本研究中，-20 ℃保存環(huán)境下檢測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)t 檢驗(yàn)，t<0.05（df-1）,且0.01＜P＜0.05，有差異，源于36 個(gè)月檢測(cè)值與對(duì)照均值差異，但該差異程度在可接受范圍內(nèi)。因此，-20 ℃分裝保存至少可穩(wěn)定36 個(gè)月。該質(zhì)控品無(wú)生物傳染性，核酸RNA 不易降解，穩(wěn)定保存，且特殊結(jié)構(gòu)能夠?qū)NA 病原核酸檢測(cè)三步流程的全程質(zhì)控，更進(jìn)一步保障豬瘟疫病的臨床檢測(cè)的準(zhǔn)確性。