陸瓊 ， 李睿， 宋鴿鴿， 馬克學(xué)

（1. 漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南 漯河 462002； 2. 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；3. 河南省營養(yǎng)與健康工程研究中心，河南 漯河 462002）

干細胞是動物組織和器官再生的重要細胞來源，但干細胞穩(wěn)態(tài)受到一些外在的（如電離輻射、重金屬和藥物等）和內(nèi)在的（如活性氧等）有害因素的影響（Cie?lar-Pobudaet al.，2017；Salvettiet al.，2020）。因此，干細胞維持在細胞世代中的穩(wěn)定性和持續(xù)的自我更新能力必然受到一系列蛋白質(zhì)的保護（Fan，2012）。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一類在細胞應(yīng)激狀態(tài)下表達的蛋白質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)該類蛋白質(zhì)在各類干細胞中高表達，對維持干細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)具有重要的保護作用（Shendeet al.，2019）。淡水渦蟲作為研究再生的經(jīng)典模式動物，逐漸受到國內(nèi)學(xué)者的廣泛關(guān)注（王志紅等，2019；馬克學(xué)等，2021；張芬熙等，2021）。渦蟲強大的再生能力基于其體內(nèi)被稱為“Neoblasts”的多能干細胞（宇文延青等，2016；Reddien，2018），它可以分化形成神經(jīng)細胞、肌肉細胞、腸道細胞和表皮細胞等。HSP60是熱休克蛋白家族中的重要成員，研究發(fā)現(xiàn)其對魚鰭再生及造血干細胞、胚胎干細胞的穩(wěn)態(tài)維持很重要（Makinoet al.，2005；Seoet al.，2018；Choiet al.，2022）。但HSP60 在渦蟲再生中的研究還不深入。本文從日本三角渦蟲Dugesia japonica中克隆了HSP60 的cDNA 全長序列，初步研究了其在渦蟲再生中的表達模式，以及干擾HSP60 表達對渦蟲再生的影響。上述工作為深入研究HSP60 在渦蟲再生和抗逆性中的作用機制奠定了良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

日本三角渦蟲為本實驗室無性繁殖獲得的單克隆品系，18 ℃避光培養(yǎng)，每2周喂食一次牛肝，實驗前至少饑餓1 周。再生用渦蟲沿咽前咽后切割成3段，置于20 ℃培養(yǎng)，分別于再生1 d、3 d、5 d、7 d 收集渦蟲提取RNA 和進行原位雜交實驗，以整體渦蟲為對照。

1.2 總RNA提取和Djhsp60 cDNA克隆

將渦蟲于液氮中研磨成粉末后加入Trizol 試劑，按照試劑盒操作說明提取總RNA，然后將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模板進行PCR 擴增。根據(jù)本實驗室篩選的Djhsp60EST 序列設(shè)計3’-RACE 和5’-RACE 特異性引物（表1），按照RACE cDNA 試劑盒（Clontech）進行PCR 擴增。PCR 片段經(jīng)純化后連接pMD19-T 載體，篩選陽性克隆送蘇州金唯智生物科技有限公司測序分析，根據(jù)測序結(jié)果拼接出Djhsp60全長cDNA序列。

表1 本實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 Djhsp60基因組結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)Djhsp60cDNA 全長序列，設(shè)計1對特異性引物（表1），以DNA為模板進行PCR擴增。PCR片段經(jīng)純化后連接pMD19-T 載體，篩選陽性克隆送蘇州金唯智生物科技有限公司測序分析。通過比較Djhsp60基因DNA序列和cDNA 序列即可獲得基因組內(nèi)含子信息。

1.4 生物信息學(xué)分析

序列同源性比對和相似性搜索在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行，多序列比對采用DNAMAN6.0，開放閱讀框預(yù)測和氨基酸序列分析采用DNAstar 5.0，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析采用Expert Protein Analysis System（http：//www.expasy.org），HSP60 親緣關(guān)系樹采用Clustal x 1.83 和Mega 3.1構(gòu)建，以人Homo sapiens為外群，系統(tǒng)樹各分支的置信度由Bootstrap 1 000次循環(huán)檢驗。

1.5 qPCR分析

總RNA 提取和cDNA 合成同前。PCR 反應(yīng)體系為20 μL：2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（ROX plus）10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 模板1 μL，滅菌超純水7.4 μL。PCR反應(yīng)在ABI 7500系統(tǒng)中進行：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。以持家基因Djef2為內(nèi)參，以2–ΔΔCT法計算mRNA 相對表達量，實驗重復(fù)3 次。采用SPASS 10.0進行單因子方差分析，P<0.05表示差異顯著。

1.6 整體原位雜交和雙熒光原位雜交實驗

整體原位雜交根據(jù)King 和Newmark（2013）的操作并稍作修改，主要實驗步驟如下：1、渦蟲用2%HCl 處死后立即用4%甲醛溶液固定30 min；2、樣品經(jīng)50%甲醇溶液和100%甲醇洗滌后，?20 ℃凍存24 h；3、樣品經(jīng)過含6%H2O2的甲醇溶液漂白過夜；4、樣品經(jīng)PBST 洗滌后用蛋白酶K 處理，然后用4%甲醛溶液固定30 min；5、樣品經(jīng)PBST 洗滌后加入預(yù)雜交液，然后加入雜交液，56 ℃雜交>16 h；6、樣品經(jīng)過充分洗滌后加入anti-DIG-AP抗體，4 ℃孵育過夜，雜交信號用BCIP/NBT顯色，Leica DFC300FX 顯微鏡拍照后用Adobe Pho?toshop處理。

雙熒光原位雜交實驗樣品處理步驟同前，雜交液中含Dig-標(biāo)記的Djhsp60探針和Fluorescein-標(biāo)記的DjwiA探針。雜交完成樣品洗滌后先用anti-DIG-POD（1∶2 000 稀釋；Roche，Catalog No. 11207733910）抗體4 ℃孵育過夜，用Rhodamine-tyramide避光顯色。樣品再次洗滌后用anti-fluorescein-POD（1∶2 000 稀釋；Roche，Catalog No. 11426346910）抗體4 ℃孵育過夜，用FITC-tyramide 避光顯色。蔡司體式熒光顯微鏡（Axio Zoom. V16）拍照后用附帶的軟件處理。

1.7 RNAi實驗

雙鏈RNA（dsRNA）的合成按照Rouhana 等（2013）提供的方法進行。將合成的10 μg dsRNA與20 μL 牛肝勻漿混合后，喂食25 條左右長度為3～4 mm 渦蟲，間隔3 d 喂食一次，共喂食5 次。以GFP dsRNA 作對照。當(dāng)渦蟲頭部開始退化時切割渦蟲觀察再生表型，用Leica DFC300FX 顯微鏡拍照，圖片用Adobe Photoshop 處理。收集再生5 d 的個體用于qPCR檢測和原位雜交實驗。

2 結(jié)果

2.1 日本三角渦蟲hsp60基因的分子特征

采用RACE 技術(shù)獲得日本三角渦蟲hsp60基因的全長cDNA 序列1 851 bp，5’-有50 bp 的非翻譯區(qū)，3’-有73 bp 的非翻譯區(qū)并含有polyA 尾，在polyA 尾上游14 bp 處可見AATAAA 的加尾信號（圖1）。將該序列命名為Djhsp60，并在GenBank 注冊（GenBank 登錄號：MH509193）。Djhsp60基因的開放閱讀框長度1 728 bp，編碼575個氨基酸，分子量61.7 kD，理論等電點5.79。DjHSP60 的蛋白質(zhì)序列中N 端含有進入線粒體的導(dǎo)肽序列，C 端含有典型的GGM 重復(fù)序列，中間區(qū)域含有HSP60 蛋白家族高度保守的標(biāo)簽序列（AAVEEGIVPGGG）和ATP 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。亞細胞定位分析顯示（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/），該蛋白定位于線粒體，屬于線粒體HSP60 蛋白家族。此外還測序了Djhs60的DNA 序列，發(fā)現(xiàn)該基因結(jié)構(gòu)區(qū)僅有1 個內(nèi)含子，位于第56 位賴氨酸密碼子AAA 和第57 位甘氨酸密碼子GGT 之間，內(nèi)含子的5’-和3’-拼接位點符合典型的“GT-AG”法則（圖2）。

圖2 Djhsp60基因結(jié)構(gòu)（方框示內(nèi)含子）Fig. 2 Structure of Djhsp60 gene （intron between AAA codon and GGT codon was boxed）

圖3 基于鄰接法建立的扁形動物門HSP60家族親緣關(guān)系樹Fig. 3 Phylogenetic tree of HSP60 family members from Platyhelminthes based on the Neighbour-Joining

2.2 DjHSP60的親緣關(guān)系分析

NCBI Blast 檢索分析顯示，DjHSP60 氨基酸序列與已經(jīng)報道的脊椎動物和無脊椎動物HSP60s的氨基酸序列高度同源，與人、小鼠Mus musculus和斑馬魚Danio rerio的同源性分別是71.4%、71.8%和71.7%，與果蠅Drosophila melanogaster和日本血吸蟲Schistosoma japonicum的同源性分別是73.4%和78.9%。地中海渦蟲Schmidtea mediterranea基因組數(shù)據(jù)庫（http：//smedgd.neuro.utah.edu）的檢索結(jié)果顯示，其同源性基因Smedhsp60編碼的也是575 個氨基酸的蛋白質(zhì)，與DjHSP60 的一致性為95.1%。HSP60 親緣關(guān)系樹顯示，所有的吸蟲和絳蟲分別聚類形成2個獨立的姊妹分支，而自由生活的渦蟲則從寄生蟲中獨立出來形成一個單獨的分支，與人的親緣關(guān)系更近。

2.3 Djhsp60的表達模式分析

整體原位雜交顯示，Djhsp60陽性細胞在除咽以外的組織中均有表達（圖4：A），尤其是在實質(zhì)組織中表達量較高，且陽性細胞成簇分布（圖4：A1）。雙熒光原位雜交顯示，Djhsp60與渦蟲干細胞marker基因DjwiA的表達模式非常相似，存在明顯的共表達現(xiàn)象（圖4：B）。原位雜交顯示，渦蟲再生1 d，Djhsp60的陽性表達信號在傷口下的組織中顯著增強（圖4：C）。隨再生進行，Djhsp60的陽性表達信號逐漸減弱（圖4：C）。qPCR 檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，Djhsp60表達量在再生1 d后升高了約5.3 倍，然后隨再生進行表達量逐漸下降（圖4：D）。

圖4 Djhsp60的表達模式Fig. 4 Expression pattern of Djhsp60

2.4 干擾Djhsp60對渦蟲再生的影響

干擾20 d 后，渦蟲頭部逐漸退化直至消失（圖5：A1～A3）。進一步研究發(fā)現(xiàn)，干擾組渦蟲喪失了再生能力（圖5：B1～B4）。qPCR 檢測結(jié)果顯示，干擾后內(nèi)源性Djhsp60表達量降低了約60%（圖5：C1）。原位雜交結(jié)果顯示，干擾后的蟲體Djhsp60轉(zhuǎn)錄本的表達信號顯著減少（圖5：C2、C3）。

圖5 干擾Djhsp60對渦蟲再生和組織穩(wěn)態(tài)的影響Fig. 5 Effects of RNAi-Djhsp60 on planarian regeneration and homeostasis

2.5 干擾Djhsp60 對渦蟲干細胞相關(guān)基因表達的影響

原位雜交結(jié)果顯示，干擾組幾乎檢測不到渦蟲干細胞標(biāo)志基因DjwiA的陽性表達（圖6：A）。

圖6 干擾Djhsp60對渦蟲干細胞相關(guān)基因表達的影響Fig. 6 Effects of RNAi-Djhsp60 on the expression of planarian stem cell-related genes

qPCR 結(jié)果顯示，干擾組渦蟲DjwiA的表達量是對照組的0.18 倍，表達量減少約80%；其他渦蟲干細胞marker 基因Djmcm2、Djpcna和Djh2b的表達量也顯著降低，分別是對照組的0.25 倍、0.33 倍和0.13倍（圖6：B）。

3 討論

HSP60是熱休克蛋白家族中的重要成員，主要分布在線粒體，對線粒體穩(wěn)態(tài)的維持發(fā)揮重要作用（Duanet al.，2020）。Seo 等（2018）發(fā)現(xiàn)，HSP60在干細胞中表達較高，參與干細胞增殖的調(diào)控。淡水渦蟲是研究再生的經(jīng)典模式動物，渦蟲再生依賴其體內(nèi)的多能干細胞。已有研究發(fā)現(xiàn)，一些熱休克蛋白家族成員如HSP90、HSP70和HSP40在渦蟲干細胞表達且是渦蟲再生所必需的基因（Donget al.，2018；Wanget al.，2019；Wanget al.，2022）。但HSP60 在渦蟲中的研究較少。本文首先采用RACE 技術(shù)從日本三角渦蟲中克隆出hsp60基因的全長cDNA 序列，并推導(dǎo)出其編碼的氨基酸序列。經(jīng)檢索分析，無論是核苷酸序列還是蛋白質(zhì)序列，都與目前報道的HSP60 高度同源，且DjHSP60 含有HSP60 家族的標(biāo)簽序列和C-端高度保守的GGM 重復(fù)序列。研究還發(fā)現(xiàn)，Djhsp60僅含有1 個內(nèi)含子。內(nèi)含子少便于轉(zhuǎn)錄本的快速加工剪切，以應(yīng)對環(huán)境應(yīng)急做出快速反應(yīng)，這可能是渦蟲熱休克蛋白基因的共性特征（馬克學(xué)等，2013；Maet al.，2014）。HSP60 系統(tǒng)進化樹顯示，渦蟲比絳蟲和吸蟲更接近人類，這與最新提出的渦蟲的分類地位一致（陳廣文，馬克學(xué)，2008）。

渦蟲干細胞屬于未分化細胞，主要在實質(zhì)組織中分布。而高度分化的組織如肌肉質(zhì)的咽中的干細胞較少。本研究發(fā)現(xiàn)，Djhsp60轉(zhuǎn)錄本主要在皮下實質(zhì)組織中表達，且成簇分布，與Orri 等（2005）報道的渦蟲干細胞分布模式非常相似。此外，Djhsp60與渦蟲干細胞marker 基因DjwiA共表達。且地中海渦蟲信息學(xué)數(shù)據(jù)庫（https：//plano?sphere.stowers.org/feature/Schmitea/mediterranea-sex ual/transcript/SMED30025522）檢索表明，HSP60 在Smedwi?1（地中海渦蟲干細胞標(biāo)志基因，與DjwiA同源）陽性細胞中表達，進一步說明Djhsp60陽性細胞具有干細胞的特征。渦蟲切割后1 d，Djhsp60強陽性表達信號出現(xiàn)在傷口下組織中，說明此處干細胞增殖活躍，急需產(chǎn)生大量的新生細胞來再生出缺失的組織和器官。隨渦蟲再生進行，新再生組織（如前端頭部）細胞逐漸分化，Djhsp60陽性表達信號逐漸減弱。這種表達模式與Seo 等（2018）報道的基本一致，即HSP60 在干細胞中的表達量高而在分化細胞中表達量低，敲除HSP60 表達影響干細胞增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)，干擾后的渦蟲耳突結(jié)構(gòu)消失、頭部逐漸退化。干擾Djhsp60的表型與干擾地中海渦蟲干細胞標(biāo)志基因Smedwi?1的表型非常相似（Reddienet al.，2005）。因為渦蟲耳突前的組織缺乏干細胞，干擾很可能影響了渦蟲干細胞的增殖，導(dǎo)致頭部組織不能有效地進行細胞更新，所以干擾后渦蟲頭部組織逐漸退化消失。此外，干擾后絕大多數(shù)蟲子喪失了再生能力，進一步說明干擾很可能影響了干細胞的功能。原位雜交和qPCR 技術(shù)研究干細胞相關(guān)基因的表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾后渦蟲干細胞相關(guān)基因的表達量極顯著降低。上述研究表明，Djhsp60屬于渦蟲干細胞相關(guān)基因，在渦蟲再生和組織穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用。

本文報道了日本三角渦蟲HSP60 的核苷酸序列和氨基酸序列，初步研究了其表達譜和干擾其表達對渦蟲再生的影響，為進一步深入研究其在渦蟲再生和環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)中的作用奠定了良好基礎(chǔ)。