司凱元，嚴春榮，黃艷萍，孔德濤，楊晶晶，王羚航，劉祥義，侯 英**

(1.西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224；2.玉溪市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南 玉溪 653100)

天麻(GastrodiaelataBl.)又名赤箭、定風(fēng)草、離合草等，為蘭科天麻屬真菌異養(yǎng)型多年生草本植物，以加工后的干燥塊莖入藥[1]。天麻被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品和滋補食品領(lǐng)域，具有較高的研究價值[2]。天麻中含有多種成分，通常天麻素和對羥基苯甲醇等酚類化合物被認為是天麻的主要成分，在2020年版《中國藥典》(一部)[3]中規(guī)定以天麻素和對羥基苯甲醇含量為指標來評價天麻質(zhì)量。巴利森苷類是由對羥基苯甲醇及其衍生物與檸檬酸聚合而成，其不僅含量高，且衍生產(chǎn)物多樣，并具有改善記憶、抗抑郁等藥理作用，也是天麻中一類重要的化學(xué)成分[4]。目前多采用高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜法等方法來測定天麻中主要成分[5-6]。鑒于中藥材和中藥飲片具有批次規(guī)模較小，質(zhì)量受產(chǎn)地因素影響大，不同批次間主要成分含量差異大等特點，因此開發(fā)可用于現(xiàn)場測定的低成本、簡單、快速的檢測方法，成為提高中藥材、飲片監(jiān)管和檢測效率的關(guān)鍵。

近紅外光譜法是近年來分析化學(xué)領(lǐng)域發(fā)展較為迅速的光譜分析方法，已成熟應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、制藥、食品、石化和煙草等領(lǐng)域[7-8]的產(chǎn)品質(zhì)量控制中。目前，應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)對中藥材和中藥飲片進行定性和定量的研究已有相關(guān)報道。何淑華等[9]對吉林人參進行定性分析；李國輝等[10]對栽培和野生中藥材燈盞花進行鑒別；李勁等[1]應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)對小柴胡顆粒中的黃芩苷含量進行測定；趙艷麗等[12]應(yīng)用近紅外光譜快速鑒別不同產(chǎn)地藥用植物重樓。但近紅外光譜分析技術(shù)用于天麻中同時測定多種成分的報道較少。本研究收集116份不同產(chǎn)地的天麻樣品，采用HPLC和HPLC-MS-MS法分別測定天麻中天麻素和對羥基苯甲醇、巴利森苷和巴利森苷B含量，并結(jié)合樣品的近紅外光譜，采用TQ 8.6分析軟件分別建立天麻中4種成分的定量模型并采用外部驗證對模型進行評價。相較于傳統(tǒng)的高效液相色譜法測定，近紅外光譜法快速測定天麻中4種主要成分的方法具有快速、準確、無損和綠色的優(yōu)勢，具有較好的實用性和推廣應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采集2021—2022年采收的不同產(chǎn)地天麻樣品116份，經(jīng)西南林業(yè)大學(xué)劉祥義教授鑒定為天麻干燥塊莖，樣品來源信息詳見表1。以96個樣品作為校正集，以優(yōu)化和建立天麻中4種成分的定量模型。以20個樣品作為驗證集，以驗證所建立校正模型的預(yù)測能力。

表1 樣品來源信息

1.2 設(shè)備與材料

Antaris Ⅱ 近紅外光譜儀(美國賽默飛世爾科技，漫反射模塊，Result 2.1軟件采集光譜圖、TQ 8.6軟件定量分析)；1290 Infinity高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；SIMCA-P+11.0軟件(瑞典UMETRICS公司)；UltiMate 3000-TSQ FOPTIS高效液相-三重四級桿質(zhì)譜儀(配ESI離子源)(美國Thermo公司)；DFT-100型中藥粉碎機(浙江溫嶺市林大機械有限公司)；0.25 mm 不銹鋼篩子(中西泰安公司)。

天麻素(>98%，批號：P1922434)和對羥基苯甲醇(>98%，批號：P2124258)購自上海泰坦科技股份有限公司；巴利森苷(>98%，批號：7857)購自上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)公司；巴利森苷B(>98%，批號：DST190901-063)購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；乙腈、甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；水為超純水。

1.3 樣品的制備

供試天麻樣品采集后用自來水洗凈，再用蒸餾水沖洗3次，將其切成薄片，隔水蒸制 15 min 后，常溫下陰干，用中藥粉碎機粉碎過 0.25 mm 篩。粉末樣品量不少于 50 g，存放于自封袋中備用。

1.4 天麻4種成分的測定

天麻中天麻素和對羥基苯甲醇的含量測定按照《中華人民共和國藥典》2020年版一部[4]天麻項下的含量測定進行。天麻中巴利森苷和巴利森苷B含量測定參考康傳志[6]等的方法進行。

1.5 近紅外光譜數(shù)據(jù)采集

采集樣品近紅外光譜前，將粉末狀的天麻樣品置于恒溫恒濕箱中平衡 24 h，平衡樣品水分含量在10%～12%之間。在近紅外光譜儀器預(yù)熱 2 h 后，使用Result 2.1軟件漫反射模塊采集天麻樣品的近紅外光譜。

稱取平衡水分后的天麻樣品 20 g，置于近紅外采樣杯中，壓緊。近紅外光譜采集條件為：掃描次數(shù)為64次，分辨率為 4 cm-1，掃描范圍為 10000～4000 cm-1。每個樣品平行測定3次，取平均光譜作為樣品光譜，進行數(shù)據(jù)建模。

天麻樣品的樣品原始近紅外光譜圖見圖1，從圖中可看出，不同樣品的近紅外光譜圖差異較小，僅在部分波段的吸收強度上有微小差異，需經(jīng)一定預(yù)處理過程以提取特征信息。原始光譜經(jīng)處理后的二階導(dǎo)數(shù)光譜圖見圖2所示。

圖1 天麻樣品的NIRS原始光譜

圖2 天麻樣品的NIRS二階導(dǎo)數(shù)光譜

1.6 近紅外光譜數(shù)據(jù)處理

不同化學(xué)成分的近紅外吸收主要與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，其吸收峰所含化學(xué)信息僅與某些特定波段關(guān)系密切。由于全波段光譜中不僅包含待測成分信息，還包含大量冗余信息，因此建模波段的準確選擇對模型的建立十分關(guān)鍵。近紅外光譜分析是從復(fù)雜、重疊、變動的背景中提取信息，在建立近紅外校正模型時，對近紅外光譜進行一系列預(yù)處理來放大信號，濾除噪音等處理，并選擇合適的譜區(qū)及其他合適的參數(shù)。一般消除近紅外光譜的旋轉(zhuǎn)或者漂移造成的影響可以利用導(dǎo)數(shù)給與校正[13 ]。

采用TQ 8.6軟件對采集的天麻樣品光譜進行方差光譜分析，選取光譜方差較大的光譜段(7500～6900 cm-1和6100～4050 cm-1)作為天麻特征信息識別的原始變量，消除光譜的冗余信息，結(jié)果見圖3所示。

圖3 標準偏差選擇特征光譜波段

2 結(jié)果與分析

2.1 校正模型建立

應(yīng)用TQ Analyst 8.6光譜數(shù)據(jù)處理軟件對樣品的近紅外漫反射光譜進行分析處理，將樣品的近紅外光譜分別與樣品中素天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷、巴利森苷B的含量數(shù)據(jù)一一對應(yīng)，采用偏最小二乘法(PLS)建立了測定天麻中4種成分的校正模型。4種成分的校正模型預(yù)測值與對應(yīng)高效液相色譜法測定值之間的相關(guān)圖見圖4所示。

A.天麻素(gastrodin)B.對羥基苯甲醇(4-hydroxybenzyl alcohol)C.巴利森苷(parishin)D.巴利森苷B(parishin B)圖4 NIR校正模型預(yù)測值與真實值之間相關(guān)圖

用校正模型的相關(guān)系數(shù)R2、校正標準誤差(SEC)和均方預(yù)測殘差(SECV)對建模效果進行評價，相關(guān)系數(shù)R2越接近1則校正模型的預(yù)測準確性越高，天麻中4種成分的建模效果及校正模型參數(shù)如表2所示。由表2可知，天麻素、巴利森苷和巴利森苷B的近紅外校正模型相關(guān)系數(shù)大于0.92，而對羥基苯甲醇的為0.8950，說明近紅外光譜法測定具有相對較好的準確性。校正標準誤差(SEC)和均方預(yù)測殘差(SECV)的值越小，說明預(yù)測的誤差越小，且兩者的值越接近則表明模型過擬合的可能性越小。由表2可知，4種成分的近紅外校正模型均不存在過擬合的風(fēng)險，具有較好的穩(wěn)定性。

表2 天麻中4種成分的NIRS校正模型參數(shù)

2.2 校正模型的外部驗證

采用20個驗證集樣品分別對天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷和巴利森苷B的校正模型進行外部驗證，4個成分的20個驗證集樣品的預(yù)測均方根誤差(PMRE)分別為3.52%，5.27%，3.77%和3.81%。將20個驗證集樣品的模型預(yù)測結(jié)果與高效液相色譜法測定結(jié)果進行配對t檢驗(顯著水平α=0.05)，結(jié)果表明兩種測定方法的測定結(jié)果無顯著差異。校正集模型參數(shù)和外部驗證結(jié)果均表明所建立的天麻中天麻素、對羥基苯甲、巴利森苷和巴利森苷B的近紅外模型具有預(yù)測穩(wěn)定性和準確性。

2.3 校正模型的應(yīng)用

用所建立的近紅外預(yù)測模型對不同產(chǎn)地的待測天麻樣品進行測定，結(jié)果見表3，從表中測定結(jié)果可知，中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷和巴利森苷B這4種成分含量存在差異。

表3 不同產(chǎn)地天麻中4種成分的含量 (mg/g)

3 結(jié)論

本文采用近紅外光譜(NIRS)技術(shù)結(jié)合偏最小二乘法(PLS)建立了同時定量測定天麻中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷和巴利森苷B含量的快速檢測方法，所建立的近紅外光譜預(yù)測模型具有相關(guān)較好的預(yù)測穩(wěn)定性和準確性，可用于天麻中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷、巴利森苷B素含量的快速測定。