文 禮,李春姍,李 嬌,趙寧生,姚 菲

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,廣西南寧 530022;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院仙葫院區(qū)腫瘤二區(qū),廣西南寧 530022

肺癌具有高發(fā)病率和病死率,非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌常見(jiàn)的亞型,約占肺癌病例的85%,肺腺癌是NSCLC的主要組織學(xué)類(lèi)型[1]。EGFR突變是肺腺癌中最常見(jiàn)的分子突變類(lèi)型,隨著表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)分子靶向藥物的發(fā)展,患者的臨床治療和預(yù)后得到了極大的改善。但是大多數(shù)患者在治療12～24個(gè)月后對(duì)EGFR-TKI產(chǎn)生一定的耐藥性,因此肺腺癌患者的預(yù)后仍然較差[2]。同時(shí)其高病死率的主要原因是該疾病的高轉(zhuǎn)移能力[3]。因此,研究促進(jìn)肺腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白質(zhì)和信號(hào)通路有助于開(kāi)發(fā)抗腫瘤活性的新療法。神經(jīng)纖毛及唾樣蛋白2(NETO2)基因位于16號(hào)染色體上,編碼單通道跨膜蛋白,主要分布于大腦,其在神經(jīng)特異性過(guò)程中發(fā)揮重要生物學(xué)功能[4]。越來(lái)越多的研究顯示NETO2在惡性腫瘤中發(fā)揮促癌作用,食管癌中NETO2高表達(dá),并通過(guò)上調(diào)ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)食管癌的惡性進(jìn)展[5]。在胰腺癌中NETO2通過(guò)激活STAT3信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[6],以及在鼻咽癌和結(jié)直腸癌中NETO2均發(fā)揮促癌作用,可作為抗腫瘤治療的潛在分子靶點(diǎn)[7-8]。ZHANG等[9]研究報(bào)道在肺腺癌組織中,SNHG17通過(guò)靶向miR-193a-5p/NETO2軸來(lái)發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用,但是NETO2在肺腺癌中的表達(dá)及發(fā)揮的具體作用未知,因此本文對(duì)此進(jìn)行了研究,以期獲得NETO2作為抗肺腺癌治療的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1試劑 甲醛、無(wú)水酒精及二甲苯購(gòu)自山東華昱化工科技有限公司;肺腺癌組織芯片購(gòu)自西安泰博斯生物科技有限公司;免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自丹麥DAKO公司;枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液和PARP蛋白裂解試劑購(gòu)自北京索萊寶試劑公司;DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素/鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)Gibco試劑公司;肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù);NETO2 siRNA購(gòu)自上海瑞博試劑有限公司;Lip2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;BCA蛋白水平檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;PVDF膜購(gòu)自美國(guó)millipore試劑公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博公司;MTS試劑購(gòu)自美國(guó)sigma公司;Transwell小室購(gòu)自美國(guó)coring公司;NETO2、JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3和GAPDH一抗抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2研究對(duì)象 組織芯片包括肺腺癌組織和其配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本(距離腫瘤3 cm內(nèi)的非腫瘤)135例,每例組織最大徑1.5 mm,每張組織均經(jīng)病理證實(shí)診斷為肺腺癌,并由公司提供完整的病理資料,包括年齡、性別、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期,以及術(shù)后5年的隨訪資料。

1.3方法

1.3.1免疫組化實(shí)驗(yàn) 組織芯片于30 min內(nèi)放入4%甲醛中充分固定6 h,通過(guò)乙醇脫水、石蠟浸沒(méi),包埋成組織蠟塊。并切成4 μm的石蠟切片,放入烤箱1 h熔蠟后,將切片放入二甲苯中30 min進(jìn)行脫蠟,并依次放入無(wú)水乙醇、90%乙醇、80%、75%和70%的乙醇中各5 min,以及雙蒸水中30 min進(jìn)行水化,隨后放置枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液中高溫煮沸30 min。將切片與過(guò)氧化氫孵育30 min以封閉非特異性抗原后,將切片與NETO2一抗稀釋液(稀釋比例1∶200)孵育,并4 ℃孵育過(guò)夜。二抗稀釋液(稀釋比例1∶8 000)孵育37 ℃ 30 min,采用試劑盒進(jìn)行組織染色、蘇木素復(fù)染,封片并晾干后在顯微鏡下觀察染色強(qiáng)度及面積進(jìn)行相應(yīng)的評(píng)分。由兩名獨(dú)立的病理學(xué)家進(jìn)行,染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):無(wú)著色為0分,淡黃色著色為1分,黃色著色為2分和深黃色著色為3分。染色面積:<5%為0分,5%～25%為1分,>25%～50%為2分,>50%～75%為3分和>75%為4分。染色強(qiáng)度得分乘以染色百分比評(píng)分計(jì)算最終得分,高表達(dá)或者陽(yáng)性表達(dá)(得分>2分)和低表達(dá)或者陰性表達(dá)(得分≤2分)。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549后,采用含有10% 胎牛血清及100 U/mL青霉素、鏈霉素的雙抗生素的DMEM-F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng),并放置在含有5% CO2的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度為95%時(shí),采用胰酶消化細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞傳代,繼續(xù)培養(yǎng),用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.3NETO2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞 肺腺癌細(xì)胞A549處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)胞狀態(tài)較好時(shí),采用胰酶消化并計(jì)數(shù),并以2.0×105個(gè)細(xì)胞鋪至6孔板中,放置在含有5%CO2的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8 h,細(xì)胞貼壁后更換無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基,并隨機(jī)分為si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組,依據(jù)Lip2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行NETO2 siRNA的轉(zhuǎn)染。si-NC組細(xì)胞轉(zhuǎn)染5 μg NC siRNA和2 μL Lip2000,si-NETO2-1組細(xì)胞轉(zhuǎn)染NETO2 siRNA-1和2 μL Lip2000,si-NETO2-2組細(xì)胞轉(zhuǎn)染5 μg NETO2 siRNA-2和2 μL Lip2000。各組細(xì)胞放置在含有5% CO2的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),12 h后更換含有10% 胎牛血清的DMEM-F12完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá) 胰酶消化收集si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組A549細(xì)胞,PBS重懸洗滌細(xì)胞2次,獲得細(xì)胞斑塊。加入適量的PARP蛋白裂解液裂解細(xì)胞,于4℃離心機(jī)中高速離心30 min,獲得蛋白質(zhì)上清液。采用BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒測(cè)得蛋白水平。通過(guò)10%SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì),并將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將膜與5%的牛血清清蛋白常溫孵育1 h,然后在4 ℃下與一抗稀釋液(NETO2、JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3稀釋比例均為1∶500)孵育過(guò)夜,TBST洗3次后,與HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(稀釋1∶5 000)或山羊抗兔IgG(稀釋1∶5 000)室溫孵育1 h。TBST洗3次后,采用ECL試劑盒曝光蛋白條帶。

1.3.5MTS實(shí)驗(yàn) 胰酶消化收集si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組A549細(xì)胞,并計(jì)數(shù)后鋪至96孔板中,每組6個(gè)重復(fù)孔,每孔2 000個(gè)細(xì)胞、150 μL DMEM-F12完全培養(yǎng)基,放置在含有5%CO2的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在接種后的第1、2、3、4和5天時(shí),每孔更換100 μL新鮮培養(yǎng)基,并加入10 μL MTS試劑,放置在含有5% CO2的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。采用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔細(xì)胞490 nm處的吸光度值(A值)。取每組的6個(gè)重復(fù)孔的A值的平均值,誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.6克隆形成實(shí)驗(yàn) 胰酶消化收集si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組A549細(xì)胞,并計(jì)數(shù)后鋪至6孔板中,每組3個(gè)重復(fù)孔,每孔500個(gè)細(xì)胞、2mL DMEM-F12完全培養(yǎng)基,放置在含有5% CO2的37℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔一天更換一次新鮮培養(yǎng)基。待形成細(xì)胞克隆團(tuán),并且肉眼可以觀察到時(shí)棄掉培養(yǎng)基。將細(xì)胞用PBS洗滌兩次,無(wú)水乙醇室溫固定30 min,0.5%結(jié)晶紫室溫染色10 min。計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆團(tuán)數(shù)目,取每組細(xì)胞的3個(gè)重復(fù)孔的平均值,誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.7Transwell實(shí)驗(yàn) 胰酶消化收集si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組A549細(xì)胞,DMEM-F12無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次后,鋪至Transwell小室的上室膜中,每組3個(gè)重復(fù)孔,每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞、100 μL DMEM-F12無(wú)血清培養(yǎng)基,500 μL DMEM-F12完全培養(yǎng)基加入Transwell小室的下室中,放置在含有5% CO2的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后,棉簽擦掉Transwell上室膜上面殘留的細(xì)胞,膜的下室面穿過(guò)的細(xì)胞采用PBS洗3次后,無(wú)水乙醇室溫固定30 min,0.5%結(jié)晶紫室溫染色10 min。PBS洗3次后,取下膜后顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)目,取每組的3個(gè)重復(fù)孔的平均值,誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié) 果

2.1NETO2在肺腺癌組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示NETO2在肺腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為45.93%(62/135),在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為33.33%(45/135),NETO2在肺腺癌組織中的表達(dá)高于在癌旁組織中的表達(dá)(χ2=4.474,P=0.034),圖1為NETO2在肺腺癌組織中陽(yáng)性和陰性表達(dá)的代表性圖片。

注:A為NETO2在肺腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá);B為NETO2在癌旁組織中的陰性表達(dá)(×200)。

2.2NETO2表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系χ2檢驗(yàn)分析顯示NETO2在不同年齡和性別患者中的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),NETO2在腫瘤T分期較高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期較高的肺腺癌患者腫瘤組織中的表達(dá)分別高于在腫瘤T分期較低、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期較低腫瘤組織中的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 NETO2在肺腺癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系[n(%)]

2.3NETO2表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 Log-rank檢驗(yàn)分析顯示與低表達(dá)NETO2的肺腺癌患者相比,高表達(dá)NETO2的肺腺癌患者預(yù)后較差(χ2=4.507,P=0.034),見(jiàn)圖2。

圖2 Log-rank檢驗(yàn)分析NETO2表達(dá)對(duì)肺腺癌患者預(yù)后的影響

2.4NETO2 siRNA對(duì)肺腺癌細(xì)胞中NETO2表達(dá)的影響 NETO2 siRNA轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549,Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示NETO2在si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組細(xì)胞中的表達(dá)分別為1.02±0.06和0.14±0.02、0.17±0.03。與si-NC組相比,si-NETO2-1、si-NETO2-2組細(xì)胞中NETO2蛋白的表達(dá)顯著降低(F=449.30,P<0.001),見(jiàn)圖3。

注:*P<0.05。

2.5NETO2 siRNA對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖活性的影響 MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示與si-NC組相比,si-NETO2-1、si-NETO2-2組細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖4、表2。

表2 si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組肺腺癌細(xì)胞A490值

注:與si-NC組比較,*P<0.05。

2.6NETO2 siRNA對(duì)肺腺癌細(xì)胞克隆形成能力的影響 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組細(xì)胞的克隆形成數(shù)目分別為(125.33±9.54)個(gè)和(56.33±3.61)個(gè)、(69.67±3.51)個(gè)。與si-NC組相比,si-NETO2-1、si-NETO2-2組細(xì)胞克隆形成能力顯著降低(F=103.30,P<0.001),見(jiàn)圖5。

注:與si-NC組比較,*P<0.05。

2.7NETO2 siRNA對(duì)肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組細(xì)胞穿膜數(shù)目分別為(76.33±3.61)個(gè)和(26.33±2.07)個(gè)、(27.67±3.79)個(gè)。與si-NC組相比,si-NETO2-1、si-NETO2-2組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力顯著降低(F=231.60,P<0.001),見(jiàn)圖6。

注:與si-NC組比較,*P<0.05。

2.8NETO2對(duì)肺腺癌細(xì)胞中JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示與si-NC組相比,si-NETO2-1、si-NETO2-2組細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白pJAK2和pSTAT3表達(dá)降低(P<0.05),JAK2和STAT3蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05),見(jiàn)圖7。

注:*P<0.05。

3 討 論

2020年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的最常見(jiàn)原因,嚴(yán)重威脅患者生命健康[1]。目前肺腺癌的治療包括手術(shù)、放療、化療和分子靶向治療,隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,尤其是分子靶向藥物的應(yīng)用,肺腺癌患者的預(yù)后有所改善,但是患者生存率仍然不理想[2]。因此,需要發(fā)現(xiàn)并探索肺腺癌發(fā)生發(fā)展的特定分子機(jī)制,以發(fā)現(xiàn)新型的生物標(biāo)志物,并可用于干預(yù)、預(yù)防和治療至關(guān)重要的新分子靶標(biāo)。NETO2是幼體結(jié)構(gòu)域和含LDLA蛋白的亞家族的成員,被鑒定為神經(jīng)元海藻受體(KARS)的輔助蛋白,并在調(diào)節(jié)KARS功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用,及NETO2與K+-Cl-共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(KCC2)以低聚形式結(jié)合,以增強(qiáng)其在海馬神經(jīng)元中的回收利用[10]。近年來(lái)研究顯示NETO2不僅在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮功能,其在多種腫瘤組織中表達(dá)異常,并參與腫瘤的惡性進(jìn)展,可作為抗腫瘤活性的藥物分子靶點(diǎn)[5-9]。

NETO2在食管癌、胰腺癌和腎透明細(xì)胞癌等腫瘤中報(bào)道為促癌基因,促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[5-6,11],但是FEDOROVA等[12]報(bào)道NETO2在乳腺癌和前列腺癌中表達(dá)下降,并下調(diào)Wnt、TGF-β、JAK/STAT、MAPK和PI3K/AKT等一些細(xì)胞信號(hào)途徑。提示NETO2具有促癌和抑癌雙重作用,在不同的腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用。在肺腺癌中NETO2作為miR-193a-5p的靶基因,參與SNHG17促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和EMT過(guò)程[9]。那么NETO2在肺腺癌中是否具有重要的生物功能,并發(fā)揮關(guān)鍵作用。在本研究首先采用免疫組化檢測(cè),發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比,肺腺癌組織中NETO2的蛋白表達(dá)水平上調(diào),并且統(tǒng)計(jì)分析顯示NETO2與肺腺癌患者T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期均相關(guān)。且高表達(dá)NETO2的肺腺癌患者預(yù)后較差,表明 NETO2促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展,是肺腺癌患者預(yù)后不良的分子標(biāo)志物。與NETO2在食管癌[5]中表達(dá)升高,并與患者臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)及在胰腺癌[6]中NETO2表達(dá)增加,并與患者腫瘤分期、預(yù)后較差的臨床意義一致。惡性增殖和轉(zhuǎn)移是腫瘤進(jìn)展的重要表型,且在ZHANG等[9]的研究中提示NETO2 與肺腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān),本研究干擾NETO2的表達(dá)后功能實(shí)驗(yàn)顯示肺腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力降低。表明NETO2在肺腺癌中高表達(dá),并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移惡性生物學(xué)行為。

NETO2促進(jìn)肺腺癌惡性進(jìn)展的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。研究顯示NETO2通過(guò)調(diào)控腫瘤相關(guān)信號(hào)途徑在各個(gè)腫瘤中發(fā)揮作用,在食管癌中NETO2通過(guò)上調(diào)PI3K/AKT和 ERK信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力[5]。NETO2通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT/NF-κB/Snail信號(hào)通路促進(jìn)胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力[13]。但是研究報(bào)道NETO2在乳腺癌和前列腺癌中可以下調(diào)PI3K/ AKT信號(hào)通路,這表明在不同的腫瘤中NETO2發(fā)揮的作用機(jī)制可以完全相反[10]。JAK2/STAT3信號(hào)通路是調(diào)控腫瘤惡性生物學(xué)行為的重要途徑之一,在肺腺癌中處于激活狀態(tài),促進(jìn)肺腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移能力,并抑制細(xì)胞凋亡,抑制其活性,可以抑制腫瘤的惡性進(jìn)展[14]。JAK2/STAT3信號(hào)通路激活的關(guān)鍵是JAK2及STAT3蛋白的磷酸化水平增加,并促進(jìn)下游靶蛋白的激活,發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[15]。本文發(fā)現(xiàn)干擾NETO2的表達(dá)后,肺腺癌細(xì)胞中pJAK2和pSTAT3蛋白的表達(dá)降低,表明NETO2通過(guò)上調(diào)JAK2/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)肺腺癌增殖和轉(zhuǎn)移能力。與NETO2在胰腺癌中增加pSTAT3蛋白的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的研究具有一致性。但是本文的局限在于未對(duì)NETO2直接作用的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究,在后續(xù)的研究中后續(xù)仍需進(jìn)一步探索。

綜上所述,NETO2在肺腺癌組織中高表達(dá),與肺腺癌患者不良病理參數(shù)和預(yù)后相關(guān)。并且NETO2 促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力,其作用機(jī)制可能是通過(guò)激活JAK2/STAT3信號(hào)通路。NETO2是抗肺腺癌治療的潛在分子靶點(diǎn)。