夏君燕,張 英,高永紅

北京航天總醫(yī)院干部醫(yī)療(老年醫(yī)學(xué))科,北京 100076

慢性阻塞性肺疾病(COPD)具有高患病率和死亡率。世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)COPD全球死亡率和殘疾率未來(lái)十年內(nèi)將持續(xù)增加[1]。COPD急性加重主要癥狀為呼吸困難加劇,是導(dǎo)致不良結(jié)果的關(guān)鍵因素[2]。平均而言,一名COPD患者每年發(fā)生1.5次急性加重[3]。COPD的惡化會(huì)降低肺功能和生活質(zhì)量,并伴隨著疾病相關(guān)負(fù)擔(dān)的提高和高住院死亡率[4-5],其在老年人群中更加嚴(yán)重。因此尋找能夠預(yù)測(cè)或評(píng)估老年COPD急性加重期的新型分子標(biāo)志物十分重要。microRNA(miRNA)作為非編碼RNA,具有抑制翻譯或促進(jìn)mRNA降解的功能,是強(qiáng)大的基因調(diào)節(jié)劑[6]。miRNA參與了許多細(xì)胞活動(dòng),在炎癥和感染性疾病等多種疾病中被用作重要的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[7]。YANG等[8]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定miR-448-5p的表達(dá),發(fā)現(xiàn)其在哮喘小鼠肺組織及支氣管上皮細(xì)胞中均明顯降低。Six1屬于同源盒基因家族,在正常成人組織中表達(dá)很低[9],在惡性腫瘤如肺癌[10]、肺部疾病如肺纖維化[11]中均發(fā)揮作用。研究證明Six1在哮喘患兒的支氣管肺泡中表達(dá)顯著增加[12]。以上研究表明Six1在肺部疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定作用,然而關(guān)于其在COPD中的作用目前尚需進(jìn)一步探討。本研究分析了miR-448-5p、Six1在老年COPD急性加重期患者血清中的表達(dá)水平及其與COPD穩(wěn)定期患者及健康對(duì)照者的差異,確定二者的臨床意義,以期為COPD的治療及病情早期發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 2021年3月至2022年3月本院住院部收治的老年COPD急性加重期患者110例為研究對(duì)象(COPD急性加重組)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)結(jié)合胸部CT、X射線、肺功能檢測(cè)及COPD急性加重期[13]和;(2)臨床資料完整;(3)依從性好可以配合治療及研究;(4)患者本人及家屬均知情同意;(5)需機(jī)械通氣>48h。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)惡性腫瘤者;(2)其他如社區(qū)獲得性肺炎、急性呼吸窘迫綜合征等肺部疾病及免疫缺陷者;(3)肝腎功能嚴(yán)重?fù)p傷不全者。另選同期于本院就診的COPD穩(wěn)定期患者60例作為COPD穩(wěn)定組及健康體檢者60例作為對(duì)照組。穩(wěn)定期患者納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)穩(wěn)定期診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]確診為COPD穩(wěn)定期,其余同急性加重患者標(biāo)準(zhǔn);對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):無(wú)COPD等肺功能、呼吸系統(tǒng)疾病,其余同前。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血清中miR-448-5p表達(dá)水平 COPD患者于入院24 h內(nèi)抽取空腹靜脈血5 mL(對(duì)照組體檢當(dāng)日抽取),3 000 r/min置于低速離心機(jī)離心20 min,取上清液,分為兩份,于-80 ℃冰箱保存,待測(cè)。取其中一份依據(jù)Trizol試劑(上海文韌生物科技有限公司)所述操作步驟提取血清總RNA,并測(cè)定總RNA水平及純度,依逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海翌圣生物科技股份有限公司)說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用ABI 7500型qPCR儀(美國(guó)ABI公司)檢測(cè)血清中miR-448-5p和Six1相對(duì)表達(dá)水平,miR-448-5p以U6為內(nèi)參引物經(jīng)設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)后由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件:95 ℃,3 min;95 ℃,30 s;59 ℃,30 s;72 ℃,40 s;38個(gè)循環(huán);72 ℃,5 min,各樣品重復(fù)3次以減小實(shí)驗(yàn)誤差,反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行數(shù)據(jù)收集,并對(duì)Ct值進(jìn)行分析,2-ΔΔCt法(Ct為循環(huán)閾值)計(jì)算目的基因miR-448-5p的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qPCR引物序列

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清Six1表達(dá) 取另一份血清樣本采用ELISA法檢測(cè)血清Six1表達(dá)(嚴(yán)格遵照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行所有操作),試劑盒來(lái)自上海梵態(tài)生物科技有限公司。

1.2.3臨床資料收集 收集受試者性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史、高血壓糖尿病史、睡眠呼吸暫停綜合征等基本資料。各組于入院當(dāng)日檢測(cè)用力肺活量(FVC)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、第1秒用力呼氣容積(FEV1),動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、二氧化碳分壓(PaCO2),計(jì)算第1秒用力呼氣容積與用力肺活量的比值(FEV1/FVC)、第1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1%pred)。所有檢測(cè)均由同一專業(yè)醫(yī)師用同一臺(tái)肺功能儀完成。

1.2.4臨床結(jié)局追蹤 COPD急性加重患者均追蹤臨床結(jié)局,統(tǒng)計(jì)患者發(fā)病后30 d內(nèi)的死亡情況,根據(jù)臨床結(jié)局分為死亡組和存活組。23例死于院內(nèi),12例死于院外,75例存活。

2 結(jié) 果

2.1COPD急性加重組、COPD穩(wěn)定組及對(duì)照組臨床資料、血清miR-448-5p、Six1水平比較 3組性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史、高血壓糖尿病史、睡眠呼吸暫停綜合征等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示3組具有可比性;COPD急性加重組、穩(wěn)定組及對(duì)照組間WBC、PaCO2、Six1依次顯著降低(P<0.05),PaO2、FEV1/FVC、FEV1%pred及miR-448-5p依次顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 各組臨床資料比較或n(%)]

2.2COPD急性加重期患者血清miR-448-5p、Six1水平與臨床指標(biāo)間的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示,COPD急性加重期患者血清miR-448-5p水平與PaO2、FEV1/FVC及FEV1%pred呈顯著正相關(guān)(r=0.373、0.598、0.546),與年齡、PaCO2呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.354、-0.446,P<0.05);血清Six1水平與PaO2、FEV1/FVC及FEV1%pred呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.392、-0.504、-0.371),與年齡、PaCO2呈顯著正相關(guān)(r=0.425、0.463,P<0.05);血清miR-448-5p與Six1之間呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 COPD急性加重期血清miR-448-5p、Six1水平與臨床指標(biāo)間的相關(guān)性

2.3影響COPD患者急性加重的多因素Logistic回歸分析 如表4所示,以COPD患者是否發(fā)生急性加重為因變量,賦值1=是,0=否。再以表2單因素分析結(jié)果中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義及臨床意義的年齡、PaO2、PaCO2、FEV1/FVC、FEV1%pred、miR-448-5p及Six1(納入具體值)為自變量,進(jìn)行多因素logistic回歸分析,變量之間已排除共線性的影響。結(jié)果顯示:miR-448-5p、年齡、Six1是COPD發(fā)生急性加重的影響因素(P<0.05)。

表4 影響COPD患者急性加重的多因素Logistic回歸分析

2.4死亡組和存活組血清miR-448-5p、Six1水平比較 死亡組miR-448-5p水平顯著低于存活組,Six1水平顯著高于存活組(P<0.05),見(jiàn)表5。

表5 死亡組和存活組血清miR-448-5p、Six1水平比較

2.5miR-448-5p、Six1表達(dá)與COPD急性加重患者30 d總生存率的關(guān)系 采用Kaplan-Meier法分析COPD急性加重患者miR-448-5p、Six1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果顯示miR-448-5p高表達(dá)患者30 d生存率80.00%(44/55)高于miR-582-5p低表達(dá)患者56.36%(31/55),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=10.036,P=0.002);COPD急性加重患者Six1高表達(dá)患者30 d生存率(26/55,47.27%)低于Six1低表達(dá)患者(49/55,89.09%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=25.954,P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-448-5p(A)、Six1(B)表達(dá)與COPD急性加重患者30 d總生存率的關(guān)系

2.6影響COPD急性加重患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析 以COPD急性加重患者是否死亡為因變量,賦值1=是,0=否。再以miR-448-5p及Six1(納入具體值)為自變量,進(jìn)行多因素Cox回歸分析,變量之間已排除共線性的影響。結(jié)果顯示:miR-448-5p、Six1是COPD急性加重患者死亡的影響因素(P<0.05),見(jiàn)表6。

表6 影響COPD急性加重患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討 論

COPD是嚴(yán)重危害成年人尤其是老年人身體健康的多種炎癥細(xì)胞介導(dǎo)的慢性氣道炎癥性疾病,多種炎癥細(xì)胞、促炎因子(如白細(xì)胞介素-1、6及腫瘤壞死因子-α等)等構(gòu)建了極其復(fù)雜的炎癥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并參與其發(fā)生發(fā)展過(guò)程。COPD所引發(fā)的慢性炎癥臨床表現(xiàn)有肺通氣不足、肺微血管結(jié)構(gòu)損壞、肺動(dòng)脈高壓等,這些因素可能造成急性加重期患者的肺通氣/血流比失調(diào),使其出現(xiàn)呼吸衰竭[15-16]。病毒和細(xì)菌感染是COPD急性加重期的最重要誘因[17]。臨床上不同分期的COPD患者會(huì)給予不同的治療方案,而目前臨床診斷COPD患者急性加重期主要依據(jù)患者基本癥狀,極易出現(xiàn)誤判而延誤最佳治療時(shí)機(jī)。故而尋找能夠有效評(píng)估COPD患者病情嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物具有重要意義。

近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)與COPD急性加重相關(guān)的miRNA,如王美華等[18]證明血清miR-146a在COPD急性加重期患者中水平升高,且與患者炎癥反應(yīng)程度及肺功能和病情密切相關(guān)。李云霞等[19]通過(guò)肺功能檢測(cè)及血?dú)夥治龅仁侄?確定miR-155在COPD急性加重期患者血清中高表達(dá),證明其可以導(dǎo)致肺損傷,對(duì)COPD產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)尤其是針對(duì)COPD急性加重期患者。miR-448-5p與肺部疾病如哮喘關(guān)系密切,研究證明miR-448-5p/VEGFA軸通過(guò)調(diào)節(jié)FAS/FAS-L信號(hào)通路保護(hù)心肌細(xì)胞免于缺氧[20]。臨床資料比較發(fā)現(xiàn),COPD急性加重組、穩(wěn)定組及對(duì)照組間WBC、PaCO2依次顯著降低,PaO2、FEV1/FVC及FEV1%pred依次顯著升高,此外本研究還發(fā)現(xiàn)COPD急性加重組、COPD穩(wěn)定組、對(duì)照組血清miR-448-5p表達(dá)水平依次升高,與前人研究結(jié)果一致,推測(cè)miR-448-5p可以通過(guò)影響肺功能來(lái)影響COPD患者病情嚴(yán)重程度,為驗(yàn)證推測(cè),進(jìn)行了相關(guān)性分析,結(jié)果顯示,COPD急性加重期患者血清miR-448-5p水平與PaO2、FEV1/FVC及FEV1%pred呈顯著正相關(guān)(r=0.233、0.598、0.546),與年齡、PaCO2呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.354、-0.446);這提示低水平血清miR-448-5p可能與易導(dǎo)致呼吸衰竭的阻塞性氣流受限、全身炎癥反應(yīng)加劇、肺泡血?dú)饨粨Q異常等相關(guān),且年齡越大病情越嚴(yán)重,但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

研究表明Six1水平在哮喘血清樣品中上調(diào),并由人支氣管上皮細(xì)胞中的TGF-β1誘導(dǎo),此外,Six1缺失可能會(huì)改善TGF-β1誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT),這些數(shù)據(jù)表明Six1可能成為哮喘治療的潛在靶點(diǎn)[21]。本研究表明COPD急性加重組、COPD穩(wěn)定組、對(duì)照組血清升Six1表達(dá)水平依次降低,相關(guān)性分析結(jié)果顯示,血清Six1水平與PaO2、FEV1/FVC及FEV1%pred呈負(fù)相關(guān)(r=-0.292、-0.504、-0.371,P<0.05),與年齡、PaCO2呈顯著正相關(guān)(r=0.425、0.463),網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-448-5p與Six1可能存在靶向關(guān)系,且研究表明miR-448-5p通過(guò)靶向Six1在哮喘中抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT和肺纖維化[8],這與本研究中血清miR-448-5p與Six1水平呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果一致,且死亡組miR-448-5p水平低于存活組,Six1水平高于存活組,提示二者可能通過(guò)靶向作用關(guān)系共同參與并調(diào)節(jié)COPD急性加重期患者呼吸及炎癥反應(yīng)和肺功能異常等過(guò)程。且多因素Logistic回歸分析顯示miR-448-5p、Six1是COPD患者發(fā)生急性加重的影響因素,Kaplan-Meier結(jié)果顯示miR-448-5p高表達(dá)患者30 d生存率高于miR-582-5p低表達(dá)患者,Six1高表達(dá)患者30 d生存率低于Six1低表達(dá)患者,miR-448-5p、Six1是COPD急性加重患者死亡的影響因素(P<0.05),佐證了上述觀點(diǎn)。

綜上所述,miR-448-5p水平在老年COPD急性加重期患者血清中顯著下調(diào)、Six1在老年COPD急性加重期患者血清中顯著上調(diào),檢測(cè)血清miR-448-5p、Six1的表達(dá)有利于對(duì)老年COPD患者病情的評(píng)估。但本研究缺乏miR-448-5p、Six1血清水平動(dòng)態(tài)檢測(cè)且樣本量有限,二者參與COPD急性加重的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討,本研究主要觀察老年患者血清miR-448-5p與Six1的差異,關(guān)于非老年的研究后續(xù)將進(jìn)一步跟進(jìn)研究。