徐 建,趙 樂,黃瑞賢,張晶晶,陳 浩,陳學琴,丁元林,孔丹莉

廣東醫(yī)科大學流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學教研室,廣東東莞 523808

2型糖尿病(T2D)是一種以機體糖耐量異常和胰島素抵抗為主要特征的慢性高血糖癥,其診斷和防治效果還尚未達到較為理想的狀態(tài)[1]。WHO指出,2021年全球已超過4.2億糖尿病患者,預計到2030年將增至5.78億,并且約有一半患有T2D的成年人未被診斷[2]。T2D也是我國主要的糖尿病類型(占糖尿病的90%以上),其未診斷人數(shù)比例也較高,并且肥胖和超重人群糖尿病患病率顯著增加,以及糖尿病控制不佳會增加發(fā)生嚴重并發(fā)癥的風險[3]。研究發(fā)現(xiàn),磷酸二酯酶6(PDE6)在視桿細胞和視錐細胞的光傳導中起著至關重要的作用,其基因突變會導致各種各樣的視網膜退行性疾病[4],并且糖尿病是糖尿病視網膜病變(DR)的主要危險因素[5],以及血中PDE6的亞基PDE6C的mRNA表達水平在DR患者中顯著下調[6],這提示PDE6可能與T2D的發(fā)生發(fā)展有關,但目前PDE6與T2D之間的相關研究還尚未充分報道。因此,本研究旨在探討外周血單個核細胞(PBMC)中PDE6相關基因表達水平與T2D及其血糖血脂之間的關系,為今后完善T2D防治措施和深入開展相關研究提供科學的理論依據。

1 資料與方法

1.1T2D芯片表達數(shù)據的獲取 通過GEO數(shù)據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)獲取同時含有T2D患者和健康對照人群PBMC的mRNA芯片表達數(shù)據,并排除2組中研究對象均小于5例或T2D患者合并其他嚴重疾病的芯片數(shù)據,如視網膜退行性疾病、糖尿病酮癥酸中毒、嚴重感染、嚴重心腦血管疾病、嚴重肝腎功能障礙或惡性腫瘤等。

1.2芯片數(shù)據的預處理和PDE6相關基因表達數(shù)據的提取 首先,對每個納入的芯片數(shù)據進行標準化和數(shù)據轉化(如log2對數(shù)轉化),并根據各芯片數(shù)據GPL號中注釋信息將基因探針轉換成基因名,然后通過Gene數(shù)據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) 檢索PDE6相關基因并進行文獻回顧,最終確定和提取PDE6A、PDE6B、PDE6C、PDE6D、PDE6G和PDE6H[7-8]的基因表達數(shù)據納入本研究。

1.3納入研究基因的meta分析和T2D潛在關鍵基因的篩選 采用R語言進行meta分析、森林圖繪制、Egger檢驗和敏感性分析。其中,采用標準化均數(shù)差(SMD)作為合并效應量。通過I2統(tǒng)計量評價研究間的異質性,若I2<50%,則選用固定效應模型(FEM)進行效應量的合并,反之則選用隨機效應模型(REM)[9]。采用Egger檢驗和漏斗圖判斷是否存在發(fā)表偏移。敏感性分析則采用逐一剔除納入芯片研究的方法(即逐一剔除法)進行效應量合并,并比較FEM和REM的合并效應量,若合并效應量方向發(fā)生改變,則提示結果不穩(wěn)健[9]。最后,將在meta分析或敏感性分析中差異有統(tǒng)計學意義的基因篩選為T2D潛在關鍵基因。

1.4T2D潛在關鍵基因與血糖血脂指標的相關分析以及其在其他PBMC芯片數(shù)據中的差異分析 通過提取芯片數(shù)據中的血糖血脂指標數(shù)據,包括空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC),然后分別與T2D潛在關鍵基因進行兩變量間的相關分析。眾多研究已指出,肥胖、胰島素抵抗(IR)和空腹血糖異常(IGF)影響著T2D的發(fā)生發(fā)展[10-12]。為進一步了解PDE6C在肥胖、胰島素抵抗和空腹血糖異常中的表達情況,4個芯片數(shù)據(GSE87005、GSE19790、GSE21321和GSE32575)中的PDE6C mRNA表達數(shù)據被納入研究,并采用上述同樣的方法對納入研究的芯片數(shù)據進行數(shù)據預處理和T2D潛在關鍵基因數(shù)據的提取,然后進行相應的差異分析。

2 結 果

2.1本研究納入芯片數(shù)據的基本情況 本研究共納入8個PBMC芯片數(shù)據,包括健康人群、IS、IR、肥胖、空腹血糖異常(IFG)和T2D人群,共計155個研究對象,見表1。

表1 本研究納入PBMC的mRNAs芯片數(shù)據的基本情況

2.2T2D組和健康對照組PDE6相關基因的meta分析 本次meta分析納入了5個芯片數(shù)據(GSE163980、GSE156993、GSE193626、GSE23561和GSE21321)的67例研究對象(T2D組33例,健康對照組34例)。分析結果顯示,與健康對照組相比,僅PDE6C的下調表達差異有統(tǒng)計學意義[SMD和95%CI為-0.72(-1.24,-0.19),P<0.05],見表2、圖1。通過Egger法檢驗發(fā)現(xiàn),僅PDE6H存在發(fā)表偏倚(P<0.05),見表2,其中PDE6C的漏斗圖見圖2。另外,敏感性分析發(fā)現(xiàn),經逐一剔除GSE156993和GSE21321后,PDE6C的合并效應不再穩(wěn)健,見圖3;其他結果均穩(wěn)健。上述結果提示PDE6C可能是T2D潛在關鍵基因。

圖1 T2D組和健康對照組PDE6C的森林圖結果

圖2 PDE6C的漏斗圖結果

圖3 T2D組和健康對照組PDE6C的敏感性分析結果

表2 T2D組和健康對照組PBMC中PDE6相關基因表達的meta分析結果

2.3臨床資料的統(tǒng)計描述和差異分析以及與PDE6C之間的相關分析 在本研究中,GSE156993提供了臨床資料的相關數(shù)據,經差異分析和相關分析發(fā)現(xiàn),T2D組中的FPG、HbA1c、TC和TG水平均高于健康對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);并且FPG、HbA1c、TC和TG均與PDE6C呈負相關關系(Pearson相關系數(shù)依次為-0.835、-0.817、-0.759和-0.755,P<0.05),見表3。上述結果表明T2D中血糖血脂水平升高可能與PBMC中PDE6C低表達水平相關。

表3 GSE156993芯片提取臨床數(shù)據的差異分析和與PDE6C相關分析的結果

2.4肥胖、胰島素抵抗和空腹血糖異常人群PBMC中PDE6C的表達情況 4個芯片數(shù)據(GSE87005、GSE19790、GSE21321和GSE32575)中的PDE6C mRNA表達數(shù)據被納入該部分研究,通過一系列差異分析發(fā)現(xiàn),無論機體是否存在IR,與非肥胖者相比,肥胖者PDE6C表達僅呈上調趨勢(P>0.05),見圖4A、B和C;而肥胖個體在減肥手術(BS)治療后PDE6C的表達顯著下調(P<0.05),見圖4D,但BS并不顯著下調肥胖T2D個體中PDE6C的表達(P=0.081),見圖4E。此外,PDE6C在健康對照組、空腹血糖異常(IFG)和T2D組中呈不斷下調趨勢,但在3組間的兩兩比較中,PDE6C僅在健康對照組與T2D組之間的差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011),見圖4F。因此,上述結果提示機體在從正常狀態(tài)到T2D狀態(tài)的過程中,PBMC中PDE6C表達可能不斷下調,并且減肥手術會使PBMC中PDE6C的表達下調,但T2D中的PDE6C可能已處于一種較穩(wěn)定的低表達狀態(tài)。

注:A、D數(shù)據來源為GSE32575;B、C數(shù)據來源為GSE87005;F數(shù)據來源為GSE21321。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn),PDE6在視桿細胞和視錐細胞的異常水平會導致視網膜病變[4],并且糖尿病會增加發(fā)生視網膜病變的風險[5],但是目前PDE6與T2D和(或)DR之間的關系還尚未完全清楚,以及PDE6在PBMC中的表達水平的相關研究還未見充分報道。因此,本研究通過T2D、肥胖、IR和IFG等多個GEO芯片數(shù)據綜合探討了PDE6與T2D之間的關系。

首先,通過meta分析發(fā)現(xiàn),與健康對照組相比,PDE6A、PDE6B、PDE6D、PDE6G和PDE6H在T2D患者PBMC中的mRNA表達水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),僅PDE6C可能在T2D患者中顯著下調表達。此外,BUTT等[6]在研究中指出,血中PDE6C的mRNA水平在DR患者中顯著下調。雖然PDE6C主要在視錐細胞中表達并參與PDE6的合成和光傳導作用[7],但已有研究指出視網膜特異性標志物表達情況可能與外周血中的表達情況一致,如視紫紅質[13]和RPE65[14]。因此,這些結果暗示血中PDE6C表達下調可能反映了視錐細胞的減少或功能異常,并且可能與DR有關。

其次,目前已有研究指出視網膜病變嚴重程度與糖尿病病程、隨機血糖和HbA1c呈正相關關系,并且肥胖、胰島素抵抗、空腹血糖異常和減肥手術等均會影響T2D的發(fā)生發(fā)展[11-12,15-16]。因此,本研究初步探討了PBMC中PDE6C在T2D發(fā)生發(fā)展過程中的大致變化情況。研究發(fā)現(xiàn),FPG、HbA1c、TC和TG均與PBMC中PDE6C表達水平呈負相關關系,并且機體在從健康、IFG到T2D狀態(tài)的過程中,PBMC中PDE6C的mRNA表達水平可能逐漸下調,并在T2D階段出現(xiàn)顯著下調表達。

另外,研究已表明,減肥手術治療能改善T2D狀態(tài)[15-16]。在本研究中指出,相比于非肥胖者,無論機體是否存在IR,肥胖者PDE6C表達水平變化差異均無統(tǒng)計學意義;但BS治療后會下調PBMC中PDE6C的mRNA表達,這提示BS后可能只會引起短暫的PDE6C表達下調;相反,BS治療卻對肥胖T2D患者PDE6C的表達影響較小,這也可能提示PDE6C在T2D患者PBMC中已處于一種較穩(wěn)定的低表達狀態(tài)。

最后,根據上述結果可表明,PBMC中長期出現(xiàn)PDE6C表達下調可能提示機體存在較大的T2D發(fā)生風險。然而,由于本研究尚不能獲得較為完整的數(shù)據,并且分析結果來源于多個芯片數(shù)據,目前暫無法充分評估不同芯片研究的異質性。

綜上所述,PBMC中下調表達的PDE6C可能與T2D及血糖血脂水平異常有關,PDE6C可能是一種與T2D有關的生物標志物。但本研究仍存在不足之處,在今后還需相應的體內外實驗和多中心臨床研究來證實本研究結論的可靠性。