梁文濤,劉 暢,萬修華,司宇光

1.北京中醫(yī)醫(yī)院懷柔醫(yī)院眼科,北京 101400;2.北京同仁醫(yī)院眼科,北京 100005

2型糖尿病(T2DM)是一種常見的內(nèi)分泌代謝疾病,由胰島素的絕對(duì)或相對(duì)不足引起[1-2]。T2DM并發(fā)糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是由T2DM所致的微血管并發(fā)癥,其病理改變主要為微血管擴(kuò)張、新生血管形成及視網(wǎng)膜出血[3-4],但其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。目前,臨床上通過眼底鏡檢查或眼底彩色照相檢查可以對(duì)DR進(jìn)行確診[5],但對(duì)于病情的評(píng)估主要依據(jù)眼底改變,這種評(píng)估方式一方面受醫(yī)師主觀經(jīng)驗(yàn)的影響較大,另一方面部分患者眼底照片不清楚給臨床評(píng)估帶來困難,不具備預(yù)測價(jià)值。皮質(zhì)醇也被稱為應(yīng)激激素,是機(jī)體的一種重要的胰島素調(diào)節(jié)激素,通過影響機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性參與胰島素抵抗,與T2DM的發(fā)病有密切關(guān)系[6]。肌生成抑制素(Mstn)也稱為生長分化因子8,是轉(zhuǎn)化生長因子β家族中的一員,存在于骨骼肌、心肌及脂肪、心臟、腦等多種組織器官中,能負(fù)向調(diào)控肌肉生長,通過參與糖代謝影響胰島素抵抗,與糖尿病等多種疾病的發(fā)生相關(guān)[7]。已有研究表明,在DR的發(fā)生、發(fā)展過程中血小板的活化狀態(tài)持續(xù)存在并逐漸增加,血小板的活化可能促進(jìn)了DR的發(fā)生與發(fā)展[8]。信號(hào)肽-補(bǔ)體蛋白C1r/C1s、Uegf和Bmp1-表皮生長因子結(jié)構(gòu)域包含蛋白1(SCUBE-1)是一種新型血小板活化蛋白的蛋白,其水平可反映血小板的活化狀態(tài)[9]。皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1均與T2DM密切相關(guān),但關(guān)于皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1是否與DR有關(guān),目前臨床上尚缺乏充分的證據(jù)。本研究探討DR患者血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1的水平及臨床意義,以期為DR的臨床治療方案制訂提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2021年12月于北京中醫(yī)醫(yī)院懷柔醫(yī)院治療的T2DM并發(fā)DR患者365例,根據(jù)有無新生血管分為增生型DR組(62例)和非增生型DR組(303例)。增生型DR組中,男34例,女28例;年齡26～83歲,平均(56.95±13.17)歲。非增生型DR組中,男162例,女141例;年齡25～82歲,平均(55.62±11.01)歲。選取同期北京中醫(yī)醫(yī)院懷柔醫(yī)院收治的單純T2DM患者51例作為T2DM組,其中男27例,女24例;年齡20～79歲,平均(53.75±10.53)歲。經(jīng)眼底檢查明確是否為增生型DR:(1)以視網(wǎng)膜、視乳頭或視網(wǎng)膜其他區(qū)域出現(xiàn)新生血管為特點(diǎn)的增生早期,(2)以纖維增生膜為特點(diǎn)的增生高危期,(3)以發(fā)生視網(wǎng)膜脫離為特點(diǎn)伴或不伴玻璃體積血的增生晚期。非增生型DR眼底特點(diǎn)為點(diǎn)狀出血或血管瘤樣膨出、斑狀出血、棉絨斑、視網(wǎng)膜微血管異常。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)T2DM患者符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)2017年發(fā)布的T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn),典型癥狀+隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L,或加上空腹血糖(FSG)≥7.0 mmol/L,或加上口服糖耐量試驗(yàn)2 h血糖≥11.1 mmol/L[10];(2)DR患者符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科學(xué)會(huì)眼底病學(xué)組發(fā)布的DR診斷標(biāo)準(zhǔn)[11];(3)均為首次發(fā)現(xiàn)T2DM伴或不伴有DR,基線資料完整;(4)未使用過細(xì)胞毒制劑或免疫抑制劑。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)其他類型糖尿病患者;(2)合并急性感染、心腦血管疾病、惡性腫瘤及免疫系統(tǒng)疾病者;(3)合并其他眼部疾病者;(4)其他原因無法配合者。另外,選取同期于北京中醫(yī)醫(yī)院懷柔醫(yī)院體檢健康者51例作為健康對(duì)照組,男28例,女23例;年齡20～79歲,平均(54.18±9.39)歲。4組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有對(duì)象均簽署知情同意書,研究經(jīng)北京中醫(yī)醫(yī)院懷柔醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2方法

1.2.1血標(biāo)本采集與處理 所有對(duì)象均禁食8～12 h,采用不含抗凝劑的真空采血管采集清晨空腹肘靜脈血5 mL,靜置1 h后以3 000 r/min離心10 min,分離血清,分成3份存入EP管,將帶有患者信息及采樣時(shí)間的耐低溫編碼標(biāo)簽貼于管壁,保存于-80 ℃冰箱待測,采用Excel軟件對(duì)樣本信息進(jìn)行存儲(chǔ)及管理,包括流水號(hào)編碼、原裝號(hào)、分裝號(hào)、樣本量、日期及對(duì)應(yīng)的患者信息。

1.2.2血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測納入研究者血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1水平。人皮質(zhì)醇ELISA試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司(檢測范圍117.19～15 000.00 pg/mL,批內(nèi)和批間變異系數(shù)均<10%);人Mstn ELISA試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰?檢測范圍0.25～8.00 ng/mL,批內(nèi)和批間變異系數(shù)均<10%),人SCUBE-1 ELISA試劑盒購自上?；钌锟萍加邢薰?檢測范圍156.25～5 000.00 pg/mL,批內(nèi)變異系數(shù)<8%,批間變異系數(shù)<10%),操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。所有試劑盒均購自同一批次,每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)取均值,根據(jù)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度R<0.980則視為檢測無效。

1.2.3臨床資料及臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測結(jié)果的收集 收集納入研究者的性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、糖尿病病程等一般資料。采用高效液相色譜法測定空腹糖化血紅蛋白(HbA1c),采用葡萄糖氧化酶法測定FSG。采用電化學(xué)發(fā)光法測定空腹胰島素(FINS),計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR),HOMA-IR=FSG×FINS÷22.5[12],HOMA-IR>2.69表示存在胰島素抵抗。采用雅培i2000全自動(dòng)免疫分析儀檢測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。采用日立7600全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑檢測血尿素(Urea)和血肌酐(Cr)水平,方法分別為酶偶聯(lián)速率法和酶法。收集患者24 h尿液,準(zhǔn)確記錄尿量,應(yīng)用日立7180全自動(dòng)生化分析儀采用免疫比濁法測定尿液中微量清蛋白水平,并計(jì)算尿清蛋白排泄率(UAER)。所有臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測均由北京中醫(yī)醫(yī)院懷柔醫(yī)院檢驗(yàn)科完成,嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)范及試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.2.4試驗(yàn)質(zhì)量控制 包括臨床數(shù)據(jù)采集質(zhì)量控制及實(shí)驗(yàn)室分析質(zhì)量控制兩部分內(nèi)容。臨床數(shù)據(jù)采集質(zhì)量控制有專人負(fù)責(zé),本科室主任為負(fù)責(zé)人,參與人除本文作者外,還增加護(hù)士2人,住院醫(yī)師1人,均實(shí)時(shí)紀(jì)錄,1人采集1人核對(duì)。實(shí)驗(yàn)室分析質(zhì)量控制主要包括空白對(duì)照測試、儀器設(shè)備的標(biāo)定、平行樣分析及使用質(zhì)量控制圖等,北京中醫(yī)醫(yī)院懷柔醫(yī)院檢驗(yàn)科的標(biāo)準(zhǔn)為控制樣本誤差(標(biāo)準(zhǔn)偏差)不大于樣本平均水平的5%。平行樣分析結(jié)果均進(jìn)行離群檢驗(yàn),離群結(jié)果經(jīng)測試人員2人以上復(fù)核并報(bào)備。

2 結(jié) 果

2.1各組血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1水平比較 血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1水平的組間比較,增生型DR組、非增生型DR組、T2DM組均高于健康對(duì)照組(P<0.05),增生型DR組、非增生型組均高于T2DM組(P<0.05),增生型DR組高于非增生型組(P<0.05)。見表1。

表1 4組血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1水平比較

2.2增生型DR組與非增生型DR組基線資料比較 兩組年齡、性別、TC、HDL-C、LDL-C比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);增生型DR組糖尿病病程長于非增生型DR組(P<0.05);增生型DR組BMI、HbA1c、FSG、FINS、HOMA-IR、TG、Urea、Cr、UAER水平高于非增生型DR組(P<0.05)。見表2。

表2 各組基線資料比較或n/n)

2.3相關(guān)性分析 T2DM并發(fā)DR患者血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1水平與年齡、TC、HDL-C、LDL-C水平無明顯的相關(guān)性(P>0.05),與BMI、糖尿病病程、HbA1c、FSG、FINS、HOMA-IR、TG、Urea、Cr、UAER均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1與各指標(biāo)的相關(guān)性(n=365)

2.4血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1對(duì)增生型DR的診斷價(jià)值 以增生型DR組(62例)為陽性樣本,非增生型DR組(303例)為陰性樣本,建立ROC曲線診斷評(píng)估模型。分析結(jié)果顯示,血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1、兩兩聯(lián)合(皮質(zhì)醇+Mstn、皮質(zhì)醇+SCUBE-1、Mstn+SCUBE-1)及3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測診斷增生型DR的曲線下面積(AUC)分別為0.695、0.747、0.742、0.768、0.758、0.771、0.838,3項(xiàng)聯(lián)合應(yīng)用的診斷效能較高。見表4和圖1。

圖1 血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1單獨(dú)及聯(lián)合檢測診斷增生型DR的ROC曲線

表4 血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1單獨(dú)及聯(lián)合檢測對(duì)增生型DR的診斷效能

3 討 論

T2DM是臨床常見病,本研究前瞻性選擇符合《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者,與2020年最新版診斷指南推薦的輔助HbA1c≥6.5%的診斷標(biāo)準(zhǔn)并無沖突。DR是糖尿病進(jìn)行性微血管并發(fā)癥,位居工作年齡人群不可逆致盲性疾病的首位[13],嚴(yán)重危害了人們的健康及生活質(zhì)量。在DR的臨床治療中,準(zhǔn)確評(píng)估DR病情是采取有效治療措施的關(guān)鍵,對(duì)改善預(yù)后有重要意義。目前,臨床上對(duì)DR病情評(píng)估通常是通過眼底彩色照相觀察患者眼底改變進(jìn)行評(píng)估,這樣的評(píng)估方式不利于早期發(fā)現(xiàn)病變,且部分患者眼底照片不清晰,增加了評(píng)估的難度及漏診的風(fēng)險(xiǎn)。血清學(xué)指標(biāo)在疾病診斷、病情評(píng)估等方面具有方便、快捷的優(yōu)勢,但目前臨床上尚無關(guān)于評(píng)估DR病情嚴(yán)重程度的敏感指標(biāo),因此尋找能夠有效評(píng)估DR病情進(jìn)展情況的敏感指標(biāo)具有重要意義。

皮質(zhì)醇是下丘腦-垂體-腎上腺軸中的一種重要激素,可通過促進(jìn)糖原分解、刺激糖異生等影響機(jī)體血糖水平,還能夠作用于胰島素β細(xì)胞控制胰島素分泌,影響機(jī)體胰島素水平[14-15]。本研究中,增生型DR組血清皮質(zhì)醇水平高于非增生型DR組,提示增生型DR患者血清皮質(zhì)醇水平升高,其原因可能是增生型DR患者慢性應(yīng)激反應(yīng)更激烈,慢性應(yīng)激反應(yīng)損傷了海馬區(qū)結(jié)構(gòu)與功能,導(dǎo)致海馬對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺軸的抑制作用減弱或功能紊亂,使血清皮質(zhì)醇水平升高[16-17]。健康對(duì)照組、T2DM組、非增生型DR組、增生型DR組的皮質(zhì)醇水平依次升高,表明皮質(zhì)醇參與了T2DM及DR的發(fā)病過程。關(guān)于血清皮質(zhì)醇參與增生型DR發(fā)病過程的具體機(jī)制目前尚不明確,本研究的相關(guān)性分析顯示,血清皮質(zhì)醇水平與BMI、糖尿病病程、HbA1c、FSG、FINS、HOMA-IR、TG、Urea、Cr、UAER具有相關(guān)性。病程越長,機(jī)體慢性應(yīng)激反應(yīng)可能就越嚴(yán)重,導(dǎo)致海馬對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺軸的抑制作用越弱,導(dǎo)致皮質(zhì)醇分泌過于旺盛,血清皮質(zhì)醇水平增加[18-19];FSG和FINS水平升高導(dǎo)致HOMA-IR值增大,當(dāng)HOMA-IR值過大時(shí)提示機(jī)體存在胰島素抵抗[20-21]?；诖?筆者推測增生型DR患者血清皮質(zhì)醇水平升高可能與患者糖脂代謝異常和胰島素抵抗程度有關(guān),增生型DR患者由于存在糖脂代謝異常和胰島素抵抗使血糖水平進(jìn)一步升高,進(jìn)而使蛋白激酶C被激活,從而使氧化應(yīng)激因子、生長激素、炎癥因子釋放增加,促進(jìn)皮質(zhì)醇的分泌[17]。

Mstn被認(rèn)為是肌肉生長的負(fù)向調(diào)節(jié)因子,成年人個(gè)體所有骨骼肌中都能檢測到Mstn[22-23]。有研究顯示Mstn與糖代謝受損之間存在明顯的關(guān)系[24]。本研究顯示增生型DR組血清Mstn水平高于非增生型DR,提示血清Mstn同樣參與了T2DM及DR的發(fā)病過程,其可能的機(jī)制如下。(1)骨骼肌作為人體最大的糖原儲(chǔ)備庫和胰島素敏感組織[25],增生型DR患者骨骼肌對(duì)葡萄糖的清除能力更弱,導(dǎo)致胰島素抵抗更加激烈;(2)Mstn水平升高可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)因子增多[26],炎癥因子可破壞胰島素β細(xì)胞直接誘發(fā)糖尿病,同時(shí)促進(jìn)脂肪分解使游離脂肪酸水平升高,誘發(fā)胰島素抵抗。關(guān)于Mstn與增生型DR發(fā)病的具體機(jī)制目前尚不十分清楚,本研究結(jié)果顯示,血清Mstn與BMI、糖尿病病程、HbA1c、FSG、FINS、HOMA-IR、TG、Urea、Cr、UAER具有相關(guān)性,推測Mstn通過影響帶脂代謝及炎癥反應(yīng)參與增生型DR的進(jìn)展過程。氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及內(nèi)皮功能障礙是增生型DR發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[27],增生型DR患者的高血糖和炎癥反應(yīng)激活了維A酸相關(guān)的孤兒受體γT(ROR-γT),啟動(dòng)核移位,與炎癥因子結(jié)合,引發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)結(jié)細(xì)胞功能障礙。

血小板的活化可能促進(jìn)了DR的發(fā)生與發(fā)展,活化的血小板可引起血小板黏附、聚集和增強(qiáng)其釋放功能,可導(dǎo)致血管內(nèi)凝血及微血栓形成,而微血栓又能進(jìn)一步促進(jìn)血小板活化[8]。SCUBE-1是一種新型的血小板活化蛋白,表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和血小板中,主要儲(chǔ)存在未活化的血小板ɑ顆粒中,隨著血小板活化而轉(zhuǎn)移至血小板表面,已有研究證實(shí)SCUBE-1參與了血栓形成[28-29]。然而,SCUBE-1在糖尿病或DR中的表達(dá)情況尚不清楚。本研究顯示,從健康對(duì)照組、T2DM組、非增生型DR組到增生型DR組,血清SCUBE-1水平和皮質(zhì)醇、Mstn相似,也依次增加,表明SCUBE-1同樣參與了T2DM及DR的病情進(jìn)展過程。增生型DR組血清SCUBE-1水平高于非增生型DR組,其可能原因如下。首先,增生型DR患者微血管功能障礙更為嚴(yán)重,其所引起的黃斑灌注缺陷、血管內(nèi)皮功能紊亂也更嚴(yán)重[30],過度激發(fā)了血小板活化,促進(jìn)SCUBE-1的釋放。其次,增生型DR患者機(jī)體的炎癥反應(yīng)更激烈,進(jìn)一步促進(jìn)了血小板活化狀態(tài),血小板ɑ顆粒持續(xù)釋放使血清SCUBE-1水平增加。

以上結(jié)果表明DR患者血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1水平異常升高,與病情嚴(yán)重程度有關(guān)。這可能與三者均參與了T2DM患者糖代謝紊亂的發(fā)生有關(guān),而且SCUBE-1與DR形成過程中的視網(wǎng)膜微血栓形成有關(guān),共同導(dǎo)致病情加重,但尚無確切證據(jù)證明三者之間的具體聯(lián)系。本研究選用功能獨(dú)立且對(duì)T2DM糖代謝過程或微血管病變有重要影響的3個(gè)因子進(jìn)行檢測,探討這3個(gè)因子單獨(dú)和聯(lián)合檢測對(duì)于增生型DR的診斷價(jià)值,旨在為臨床提供診斷效能更高的血清標(biāo)志物。ROC曲線分析顯示,血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1、兩兩聯(lián)合(皮質(zhì)醇+Mstn、皮質(zhì)醇+SCUBE-1、Mstn+SCUBE-1)及3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測診斷增生型DR的AUC分別為0.695、0.747、0.742、0.768、0.758、0.771、0.838,表明血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1對(duì)增生型DR具有一定的診斷價(jià)值,而3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測可提高診斷效能。

綜上所述,T2DM型DR患者血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1水平升高,與DR病情密切相關(guān),也是增生型DR的影響因素,三者聯(lián)合檢測對(duì)增生型DR的診斷效能良好,為臨床中DR的診斷提供了新的方法。然而,目前臨床上血清皮質(zhì)醇、Mstn、SCUBE-1與DR具有相關(guān)性的證據(jù)還相對(duì)較少,還需大量研究予以進(jìn)一步證實(shí),三者之間的內(nèi)在聯(lián)系也需要深入探究。