魏 堯,解春寶,蔣靈晰,何陽(yáng)軍,石 毅△

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院,人類疾病基因研究四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610072;2.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院,四川 成都 611731;3.西南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系,四川 瀘州 646000)

腫瘤是人類健康的威脅之一,它會(huì)造成正常組織器官結(jié)構(gòu)和功能的破壞,嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡。有研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中存在DIS3基因的異常表達(dá)。DIS3作為核糖核酸酶是外泌體復(fù)合物的催化亞基,包含外溶核(RNB)和內(nèi)溶核(PIN)結(jié)構(gòu)域,可以直接作用于大量不同RNA物種的加工、周轉(zhuǎn)和監(jiān)測(cè)[1],在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用,如在多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)中DIS3是最常見(jiàn)的突變基因之一、白血病的發(fā)生也與DIS3的突變和丟失有關(guān)、DIS3基因可以促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展、DIS3基因在黑色素瘤的發(fā)展中也起著調(diào)控作用等。本文對(duì)DIS3在一些腫瘤的最新研究進(jìn)行闡述,希望為腫瘤的治療提供全新的研究方向與治療靶點(diǎn)。

1 DIS3基因

DIS3基因是1988年發(fā)現(xiàn)于裂殖酵母中。Ohkura等[2]在有絲分裂時(shí)姐妹染色單體分離相關(guān)基因的研究中鑒定出DIS3基因。DIS3基因?qū)儆诖嬖谟趶募?xì)菌到人類的大多數(shù)生物中的RNase II/RNR超家族。該基因位于人類染色體13號(hào)染色體的長(zhǎng)臂2區(qū)1帶(13q2.1),并廣泛表達(dá)于人體各種組織中。

1.1 DIS3的結(jié)構(gòu)域與蛋白結(jié)構(gòu)RNA質(zhì)量控制是保證轉(zhuǎn)錄完整的關(guān)鍵。輔助因子與適配體識(shí)別錯(cuò)誤的RNA底物,并激活核糖核酸酶進(jìn)行降解。真核生物的轉(zhuǎn)錄組主要受到核外泌體的調(diào)控,核外泌體是一種由9個(gè)亞基核心(EXOSC1-9)、分配性核糖核酸酶和DIS3蛋白(又稱為Rrp44)三部分組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu),其中DIS3蛋白是一種高度保守的3’至5’外切核糖核酸酶,是外泌體的核心功能亞基,為外泌體提供催化活性。當(dāng)RNA底物被識(shí)別后,RNA底物通常被引導(dǎo)通過(guò)9亞基外泌體桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的中心區(qū)域,隨后被位于環(huán)基部的DIS3外切酶域降解。另外,一些特殊的RNA底物也能夠被DIS3蛋白直接分解而不用進(jìn)入桶狀中心[3]。

人類基因組編碼DIS3家族主要有三個(gè)成員:DIS3蛋白、DIS3L蛋白和DIS3L2蛋白(見(jiàn)圖1)。DIS3家族蛋白通常含有一個(gè)RNB(RNA-Binding)結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)冷休克結(jié)構(gòu)域(CSD)、一個(gè)S1結(jié)構(gòu)域(能夠非特異性結(jié)合RNA)和一個(gè)PIN結(jié)構(gòu)域。在N端,由三個(gè)半胱氨酸殘基組成的CR3基序具有重要的結(jié)構(gòu)作用(參與DIS3蛋白與外泌體結(jié)合)。CSD和S1結(jié)構(gòu)域都有助于與RNA結(jié)合。PIN結(jié)構(gòu)域和CR3基序相互作用使DIS3錨定于外泌體核心的底部[4]。

圖1 DIS3基因基本結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)蛋白[3]

1.2 DIS3的蛋白功能DIS3蛋白作為可高效加工的水解酶,會(huì)優(yōu)先選擇5′端磷酸化的底物以3′到5′的方向水解單鏈RNA。DIS3蛋白具有兩種不同的催化活性:內(nèi)切酶活性(PIN結(jié)構(gòu)域)和外切酶活性(RNB結(jié)構(gòu)域)。PIN結(jié)構(gòu)域采用RNase H(RNA酶H)的方式折疊,酶活性依賴于四個(gè)保守的酸性氨基酸(天冬氨酸)殘基,它們與催化活性中心的兩個(gè)鎂離子共同發(fā)揮作用。外泌體中心通道的寬度僅夠容納單鏈RNA,因此PIN結(jié)構(gòu)域不能切割雙鏈RNA,但可以切割環(huán)狀RNA和線性單鏈RNA。RNB結(jié)構(gòu)域的外切酶活性位點(diǎn)位于中心通道的底部,只有至少7個(gè)核苷酸的單鏈RNA才能到達(dá)。靶向DIS3蛋白的底物既可以直接進(jìn)入催化區(qū)域,也可以通過(guò)外泌體的中心通道進(jìn)入底部的核糖核酸酶外切酶或內(nèi)切酶位點(diǎn)[5]。只要在RNA的3′端存在至少4～5個(gè)核苷酸的非結(jié)構(gòu)區(qū),DIS3蛋白就可以通過(guò)分子內(nèi)或分子間二級(jí)結(jié)構(gòu)分解底物[6]。

DIS3主要功能是在RNA降解系統(tǒng)負(fù)向調(diào)控錯(cuò)誤折疊蛋白的降解[7],除了RNA降解功能之外,DIS3基因還參與了稷酒裂殖酵母的著絲點(diǎn)組裝,其作用是使中端染色質(zhì)沉默[8]。目前已有的一些實(shí)驗(yàn)表明,抑制DIS3的活性會(huì)阻礙細(xì)胞的增殖和分裂。但存在個(gè)別反常影響,例如功能降低的DIS3蛋白可以促進(jìn)小鼠B細(xì)胞的增殖[9]?？傮w而言,DIS3基因在RNA代謝中具有多種功能,包括mRNA質(zhì)量控制、小RNA處理、染色體分離、細(xì)胞周期進(jìn)展、紡錘體組裝、甚至影響B(tài)細(xì)胞中抗體的多樣性[3]。

研究發(fā)現(xiàn),人類DIS3蛋白存在兩種可變剪接的蛋白質(zhì)編碼異構(gòu)體,體現(xiàn)在編碼PIN結(jié)構(gòu)域的序列不同,П亞型蛋白(ISO2)的PIN結(jié)構(gòu)域比Ⅰ亞型蛋白短30個(gè)氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)MM患者細(xì)胞及MM細(xì)胞株具有更高表達(dá)水平的DIS3亞型1蛋白(ISO1);慢性粒單核細(xì)胞白血病和急性髓系白血病患者樣本以及健康捐贈(zèng)者樣本具有相似水平的ISO1和ISO2。兩種亞型蛋白的異常表達(dá)均可以促進(jìn)血液病癌癥的進(jìn)展[10]。見(jiàn)圖2。

1.3 DIS3家族如上所述,DIS3酶是外泌體必不可少的催化亞基,DIS3家族的DIS3蛋白、DIS3L1蛋白和DIS3L2蛋白已被證實(shí)參與重要的細(xì)胞過(guò)程,例如調(diào)控有絲分裂。DIS3L1也與外泌體相關(guān),定位于細(xì)胞質(zhì)。值得注意的是,DIS3L2可以獨(dú)立于外泌體發(fā)揮作用,并對(duì)尿苷化RNA表現(xiàn)出獨(dú)特的傾向。

DIS3L2基因是稷酒裂殖酵母DIS3基因的一個(gè)同源基因。DIS3L2蛋白定位于細(xì)胞質(zhì),缺乏DIS3和DIS3L1中的PIN結(jié)構(gòu)域和CR3基序,這兩個(gè)都是與外泌體復(fù)合物相互作用所必需的(見(jiàn)圖1)。DIS3L2蛋白是具有高度保守的核酸外切酶,其突變常導(dǎo)致人類過(guò)度生長(zhǎng)、Perlman綜合征和腎母細(xì)胞瘤[11]。生殖系統(tǒng)中的DIS3L2基因突變會(huì)導(dǎo)致Perlman綜合征和腎母細(xì)胞瘤。Perlman綜合征表現(xiàn)為先天性過(guò)度生長(zhǎng),是一種常染色體隱性遺傳疾病,與腎母細(xì)胞瘤易感性有關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)DIS3L2基因的過(guò)表達(dá)抑制了人類癌細(xì)胞株的生長(zhǎng),而下調(diào)DIS3L2基因的表達(dá)則促進(jìn)了這些細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外DIS3L2基因突變還存在于散發(fā)性腎母細(xì)胞瘤中[12]。除了腎母細(xì)胞瘤,DIS3L2基因還能促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展[13]。因此,該基因被認(rèn)為可以作為是腫瘤血清學(xué)檢測(cè)的指標(biāo)之一。

2 DIS3基因與腫瘤

2.1 DIS3基因與MMMM是發(fā)病率僅次于惡性淋巴瘤的常見(jiàn)血液系統(tǒng)惡性疾病,?；疾∮谥欣夏耆巳?且不同地區(qū)和不同人種之間發(fā)病率有很大差異。目前平均每年的確診人數(shù)已超過(guò)14萬(wàn)人。雖然MM患者的5年生存率從1975年的28%提高到2012年的56%,但目前仍然缺乏相關(guān)的特效藥[14],給我國(guó)患者造成了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

MM的臨床表現(xiàn)因人而異,這種差異很大程度上是由獲得性遺傳因素驅(qū)動(dòng),這些遺傳因素使疾病永久存在并在MM發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量無(wú)功能的、完整的免疫球蛋白或不完整的免疫球蛋白,這些免疫球蛋白的積累以及異常單克隆漿細(xì)胞與骨髓微環(huán)境中其他細(xì)胞的相互作用會(huì)導(dǎo)致MM癥狀(CRAB癥狀)。CRAB癥狀包括血鈣增高、腎功能損傷、貧血及骨病。MM最常見(jiàn)的治療相關(guān)癥狀是疲勞、便秘、手足疼痛和刺痛。幾乎所有MM患者都始于意義未明的單克隆丙種球蛋白病(MGUS)。每年MGUS進(jìn)展為活動(dòng)性(癥狀性)MM的風(fēng)險(xiǎn)約1%～2%,20年進(jìn)展為MM的風(fēng)險(xiǎn)約為18%[15]。MM的診斷包括血液檢查、骨髓檢查、影像學(xué)檢查。其中血清蛋白電泳定量M蛋白、免疫固定電泳及骨髓活檢是主要診斷手段,骨髓活檢包括免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、FISH分析,根據(jù)不同檢查結(jié)果可對(duì)MM進(jìn)行分型進(jìn)而實(shí)施個(gè)體化治療[16]。根據(jù)影像學(xué)檢測(cè)結(jié)果,可分為四種類型:彌漫性骨骼受累(骨髓瘤)、彌漫性骨骼骨量減少、孤立性病變(漿細(xì)胞瘤)和硬化性骨髓瘤。根據(jù)電泳結(jié)果中M蛋白類型分為:IgA型、IgG型、IgD型、IgE型、IgM型、不分泌型、輕鏈型以及雙克隆型。還可根據(jù)M蛋白的輕鏈類型分為κ型和λ型。使用FISH探針可檢測(cè)染色體重復(fù)、缺失和重排。根據(jù)FISH檢測(cè)結(jié)果可將患者分為超二倍體亞型和缺失亞型。

MM目前雖無(wú)完全治愈的治療方案,但隨著技術(shù)水平不斷進(jìn)步,針對(duì)的診斷和治療得到了很大的改善。其治療方法包括嵌合抗原受體T淋巴細(xì)胞療法(CAR-T)、自體造血干細(xì)胞移植(ASCT)、誘導(dǎo)治療、MM的支持治療、蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)藥物以及單克隆抗體療法等[17,18]。針對(duì)MM的發(fā)病機(jī)制,較多的觀點(diǎn)是免疫球蛋白重鏈位點(diǎn)的易位和帶有奇數(shù)染色體的三體以及超二倍體突變。MM細(xì)胞其他染色體結(jié)構(gòu)變異也被認(rèn)為是MM發(fā)病的原因,包括缺失、重復(fù)、易位等。最常見(jiàn)的5種易位分別為t(11;14)、t(4;14)、t(14;16)、t(14;20)和t(6;14),分別出現(xiàn)在15%、12%、3%、2%和1%的樣本中。最常見(jiàn)的缺失突變包括del(13q), del(14q), del(6q), del(1p)和del(17p)[19]。除染色體變異外,基因突變與MM發(fā)病率密切相關(guān),經(jīng)常突變的基因包括TP53(36%)、KRAS(22.1%)、NRAS(15.1%)、DIS3(8.1%)和TET2/FGFR3(5.8%),以及以前未在骨髓瘤中報(bào)道的多個(gè)突變[20]。DIS3基因在MM中有較高的突變率,可能在MM的發(fā)病、進(jìn)展和預(yù)后中發(fā)揮重要作用。在國(guó)內(nèi)外研究中,突變基因(如TP53、DIS3、FAM46C、KDM6B和EGR1)的數(shù)量與MM預(yù)后不良有關(guān)[21]。

在DIS3蛋白功能缺陷的B細(xì)胞中,免疫球蛋白重鏈位點(diǎn)完整性受到影響。在NDMM(新診斷MM)中DIS3基因突變的頻率約為10%。DIS3基因突變主要發(fā)生在DIS3蛋白的活性區(qū)域,其中RNB結(jié)構(gòu)域?yàn)橹饕蛔兘Y(jié)構(gòu)域。DIS3基因突變常伴隨13號(hào)染色體長(zhǎng)臂缺失,且在72%的病例中與13號(hào)染色體的缺失相關(guān)。研究表明,DIS3基因突變可以通過(guò)與胞嘧啶核苷脫氨酶的相互作用,間接導(dǎo)致體細(xì)胞染色體定位錯(cuò)誤,從而導(dǎo)致染色體易位[22]。在大多數(shù)個(gè)體中,骨髓瘤細(xì)胞包含一個(gè)DIS3的等位基因,該等位基因存在錯(cuò)義突變,并且DIS3的第二個(gè)等位基因因染色體13q區(qū)缺失而缺失[23]。所有MM特異性DIS3基因突變都是錯(cuò)義突變,這些突變主要集中在RNB域,且存在3個(gè)DIS3基因熱點(diǎn)突變(D488, E665和R780)。國(guó)外研究分析了164例代表性患者純化骨髓漿細(xì)胞的DIS3基因PIN結(jié)構(gòu)域和RNB結(jié)構(gòu)域,DIS3基因在MM中的突變率為18.5%,被鑒定的變異主要是定位于RNB域的錯(cuò)義突變。33例DIS3基因突變患者中有19例(57.6%)攜帶del(13q14),突變率在新診斷的MM患者中為18.5%[24]。

目前DIS3基因突變導(dǎo)致MM的機(jī)理尚未闡明,但國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室就其研究結(jié)果提出了一些假設(shè):①DIS3基因的失活突變可能會(huì)破壞著絲點(diǎn)的形成,通過(guò)對(duì)異染色質(zhì)的影響,導(dǎo)致姐妹染色單體分離缺陷和非整倍體形成;②DIS3基因的失活突變可能與骨髓瘤細(xì)胞中其他基因的突變協(xié)同作用以增強(qiáng)細(xì)胞增殖;③DIS3基因的失活突變可能會(huì)提高骨髓瘤細(xì)胞中非編碼RNA的調(diào)控水平,提高基因組突變頻率[24]。DIS3基因突變降低核糖核酸酶外切酶活性,從而提高了骨髓瘤的增殖能力。此外的其他研究也探討了可能的機(jī)制,DIS3基因過(guò)表達(dá)可顯著降低人骨髓瘤細(xì)胞增殖能力,可能與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)降低密切相關(guān)[25]。DIS3蛋白缺失破壞了外泌體10亞基的正常核定位,使其不能與核質(zhì)底物結(jié)合進(jìn)而導(dǎo)致核內(nèi)RNA堆積。國(guó)外已有的研究發(fā)現(xiàn)RNA外泌體相關(guān)基因RBM7、SKIV2L2和DIS3發(fā)生體細(xì)胞突變,其功能缺失會(huì)上調(diào)成熟端粒酶RNA水平。雖然沒(méi)有攜帶端粒維持基因的體細(xì)胞突變,但29%有生殖系端粒維持缺陷,這也許是遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定的原因[26]。

2.2 DIS3基因與其他血液腫瘤急性髓系白血病是一種異質(zhì)性的血液惡性腫瘤,其病理特征是造血干細(xì)胞分化阻斷和克隆增殖。急性髓細(xì)胞白血病常見(jiàn)基因突變包括剪切子突變、抑癌基因突變、轉(zhuǎn)錄子突變。其中DIS3基因突變占比不大,其中錯(cuò)義突變占所有患者4%,并且突變位點(diǎn)都在RNB結(jié)構(gòu)域[27]。慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)是一種老年血液病,其特征是單克隆異常淋巴細(xì)胞進(jìn)行性堆積。有研究發(fā)現(xiàn),在CLL患者中,DIS3基因座13q22經(jīng)常丟失[28]。

2.3 DIS3基因與結(jié)腸癌結(jié)腸癌是全球常見(jiàn)的消化系統(tǒng)癌癥之一。在美國(guó),結(jié)腸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌、肺癌和前列腺癌,死亡率僅次于肺癌。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)DIS3具備促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展的作用。與腺瘤相比,結(jié)腸癌組織中DIS3基因表達(dá)顯著升高,并通過(guò)DIS3基因的沉默抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖,同時(shí)也可以降低HCT116(結(jié)腸癌細(xì)胞株)的遷移和侵襲能力。這種基因表達(dá)顯著升高可以通過(guò)DIS3基因座13q22的擴(kuò)增來(lái)解釋,該基因座改變?cè)诮Y(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116中經(jīng)常出現(xiàn)[29]。劉偉等[30]發(fā)現(xiàn)通過(guò)下調(diào)DIS3L2表達(dá)可增強(qiáng)結(jié)直腸癌干細(xì)胞的特性。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)DIS3基因在結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移患者的表達(dá)與腺瘤相比高38倍[31]。

2.4 DIS3基因與黑色素瘤黑色素瘤皮膚癌源于皮膚黑色素細(xì)胞,是具備高轉(zhuǎn)移性質(zhì)的腫瘤之一。不同的DIS3基因調(diào)控可能是淺表擴(kuò)張性黑色素瘤(SSM)和結(jié)節(jié)性黑色素瘤(NM)不同臨床表現(xiàn)的一個(gè)原因[32]。在SSM細(xì)胞中,DIS3基因的表達(dá)下調(diào),而在NM細(xì)胞中,DIS3基因表達(dá)上調(diào)(與正常黑素瘤細(xì)胞相比)。由于其與黑色素瘤的關(guān)系尚未明確,DIS3基因并未被鑒定為黑素瘤分子生物標(biāo)志物[33]。

3 總結(jié)與展望

盡管DIS3基因已被發(fā)現(xiàn)與多種類型的癌癥相關(guān),包括結(jié)直腸癌、黑色素瘤和血液腫瘤,但DIS3是抑癌基因還是促癌基因,目前還沒(méi)有共識(shí)。DIS3在不同腫瘤中呈現(xiàn)不同的差異表達(dá),表明DIS3基因的作用可能在不同的組織和致癌環(huán)境中有所不同。相關(guān)腫瘤中,MM是DIS3相關(guān)性最高的腫瘤,多個(gè)位點(diǎn)突變均與MM發(fā)生發(fā)展相關(guān),并在患者的長(zhǎng)期隨訪結(jié)果中也表現(xiàn)出DIS3基因突變與不良結(jié)局的相關(guān)性。介于該基因與多種腫瘤均具備一定程度的相關(guān)性,因此,確定DIS3基因在腫瘤發(fā)生中的作用可能有助于開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)。