趙應(yīng)濤,侯能易,余 松,劉裔莎,熊海波,王 越,曹欽興,謝 偉,旦真甲,龐明輝,

( 1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科,四川 瀘州 646000; 2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a.老年綜合外科 b.病理科,四川 成都 610072;3.成都大學(xué)附屬醫(yī)院普外科,四川 成都 610081;4.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院,四川 成都 611731)

胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumors,GIST)是一種性質(zhì)較復(fù)雜且具有惡性潛能罕見的腫瘤,源于消化道間葉組織,可以發(fā)生在消化道的任何部位,約占胃腸道腫瘤發(fā)病率的2%左右[1],GIST的發(fā)病率為1～2/10萬。約15%～50%的GIST患者會發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]。目前研究表明腫瘤中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的高表達(dá)是疾病進(jìn)展的預(yù)后標(biāo)志[3,4],CD133可通過促進(jìn)腫瘤代謝、增殖、遷移、神經(jīng)分化,以及抑制細(xì)胞凋亡,從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[5～7]。CD133陽性細(xì)胞在腦癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、肝細(xì)胞癌和卵巢癌中均檢測出高表達(dá)[8,9]。近年研究發(fā)現(xiàn)CD133同樣在胃腸道間質(zhì)瘤中也有較高的陽性表達(dá)[10,11],這或可成為評估胃腸道間質(zhì)瘤生物學(xué)行為的重要指標(biāo)。本研究采用免疫組化的方法檢測CD133在GST組織中的表達(dá)情況,并分析其與臨床病理特征的關(guān)系,探討CD133在胃腸道間質(zhì)瘤診治中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018年1月至2021年12月經(jīng)四川省人民醫(yī)院診治的346例GIST患者的臨床病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn):所有患者行根治手術(shù),術(shù)后病理診斷為胃腸道間質(zhì)瘤;未行新輔助治療等;病理組織為我院病理科石蠟切片。排除標(biāo)準(zhǔn):病理信息缺失者。根據(jù)病理的大小、位置及核分裂象,分為極低危76例、低危109例、中危68例、高危93例。分級標(biāo)準(zhǔn)參照原發(fā)胃腸間質(zhì)瘤危險度分級(中國共識2017修改版)[12]。

1.2 方法石蠟包埋組織連續(xù)切片(厚5 μm);二甲苯及梯度酒精中脫蠟至水;檸檬酸鹽緩沖液(0．01 MpH6.0)對抗原進(jìn)行修復(fù)處理;放入3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;PBS清洗后加入山羊血清封閉;一抗孵育(CD133多克隆抗體,1∶100(濃度),18470-1-AP);4 ℃過夜。PBS清洗后加入二抗(山羊抗兔工作液1∶100(濃)GB23303),37℃ 30min;PBS清洗后加入DAB顯色試劑顯色;蘇木素復(fù)染細(xì)胞核;脫水處理,中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果判讀對免疫組化處理好切片進(jìn)行圖像采集,每張切片先于顯微攝像系統(tǒng)100倍下觀察全部組織,再分別采集3張不同區(qū)域400倍下顯微圖像。使用Halo數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)計算每張圖像陽性面積占比(%DAB positive tissue)。再計算出3個視野下圖像的陽性面積占比的平均值,由此得出每例樣本中CD133的平均表達(dá)量。

1.4 隨訪通過電話、郵件、門診以及患者微信群等方式進(jìn)行隨訪,隨訪時間截至2022年12月。從疾病首次確診時間至當(dāng)前隨訪、腫瘤復(fù)發(fā)或死亡的時間定義為無病生存時間(DFS)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不符合正態(tài)分布的計量資料以四分位數(shù)表示,采用非參數(shù)Mann-whitneyU檢驗,多樣本采用Kruskal-WallisH檢驗,組間比較采用Bonf-feroni檢驗。Kaplan-Meier生存曲線、Cox回歸進(jìn)行生存分析;組間生存分析采用Log-rank檢驗或Breslow檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GIST切片中CD133的表達(dá)情況CD133主要在細(xì)胞膜表達(dá),可少量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),染色呈現(xiàn)黃色或棕黃色,細(xì)胞核為藍(lán)色。見圖1。

圖1 CD133在胃腸道間質(zhì)瘤中的表達(dá)情況(免疫組化染色,×400) a:胃;b:小腸;c:結(jié)腸;d:直腸;e:腹腔

2.2 CD133在GIST不同臨床病理特征下的表達(dá)比較不同腫瘤直徑、危險分度、腫瘤部位的患者CD133表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05);年齡、性別、核分裂象、是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及Ki-67與CD133的表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征GIST患者CD133的表達(dá)比較

2.3 CD133表達(dá)情況與胃腸道間質(zhì)瘤患者生存的關(guān)系本研究隨訪時間為9～59個月,中位隨訪時間38個月。利用X-tile軟件計算出CD133表達(dá)量最佳截取值,以CD133平均陽性占比面積為7.45為界,≤7.45為低表達(dá),>7.45為高表達(dá)。Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)GIST腫瘤位置、腫瘤直徑、核分裂象、危險分度、腫瘤是否轉(zhuǎn)移、KI-67的表達(dá)與生存預(yù)后之間存在相關(guān)性(P<0.05),而CD133表達(dá)量的高低與GIST患者預(yù)后無關(guān)(P=0.717)。見圖2。進(jìn)一步性Cox多因素回歸分析,提示GIST腫瘤位置、Ki-67>5%以及CD133表達(dá)量是影響患者預(yù)后的獨立危險因素。見表2。

表2 GIST患者總生存率的COX多因素分析

圖2 GIST患者生存分析 a:腫瘤位置;b:腫瘤直徑;c:核分裂象;d:危險分度;e:腫瘤轉(zhuǎn)移;f:Ki-67 g:CD133

3 討論

雖然靶向藥物徹底改變了GIST的治療,但由于GIST的性質(zhì)較復(fù)雜且具有惡性潛能,隨著時間的推移,大多數(shù)患者在靶向治療期間經(jīng)歷疾病進(jìn)展或獲得性耐藥性[9]。目前對于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及耐藥患者的治療不容樂觀,當(dāng)前用于評價GIST復(fù)發(fā)風(fēng)險的各項指標(biāo)也在3年后失去評價意義[10],同時對于GIST的轉(zhuǎn)移原因研究較少,對于GIST腫瘤干細(xì)胞及其生物標(biāo)志物研究有限。因此更深入研究腫瘤干細(xì)胞及干細(xì)胞標(biāo)記物,可能對于治療耐藥、腫瘤轉(zhuǎn)移、臨床治療及患者的預(yù)后判斷有著重要意義。

CD133是一種跨膜糖蛋白,大量研究表明,CD133陽性細(xì)胞在腦癌、前列腺癌等多種癌中均有高表達(dá)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)不同危險分度GIST中CD133表達(dá)具有顯著差異,危險度越高其表達(dá)也高。當(dāng)前研究表明腫瘤中CD133的高表達(dá)是疾病進(jìn)展的預(yù)后標(biāo)志。CD133激活PI3K-Akt通路,促進(jìn)腫瘤代謝、增殖;上調(diào)CD133陽性細(xì)胞中FLIP的表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡;CD133陽性細(xì)胞具有強有力的移植、增殖、遷移和神經(jīng)分化;CD133可通過激活Wnt信號通路,增加VEGF-A和IL-8的表達(dá),促進(jìn)血管生成[11]。腫瘤微環(huán)境、p53、表觀遺傳因子等多種因子參與CD133的表達(dá)[13～15],通過上述方式,CD133在卵巢癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌等腫瘤的分化、進(jìn)展以及耐藥方面具有促進(jìn)作用[16～21]。本研究發(fā)現(xiàn)GIST腫瘤直徑越大、核分裂象越高,CD133表達(dá)量越高,這提示CD133或許在GIST的生長及分裂增殖中具有重要作用。Ki-67是一種存在于細(xì)胞核中的蛋白,可作為反應(yīng)腫瘤細(xì)胞增殖程度的指標(biāo),有研究表明Ki-67是GIST預(yù)后不良的因素之一[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD133的表達(dá)與Ki-67的高低無關(guān),但生存分析發(fā)現(xiàn)Ki-67是GIST預(yù)后的獨立危險因素。

GIST患者中c-KIT突變約占80%,PDGFRA突變約占10%,還有10%為野生型GIST。大多數(shù)c-KIT突變發(fā)生在第11外顯子(90%)或第9外顯子(8%);PDGFRA突變最常見于第12、14和18外顯子,第18外顯子中的D842V突變頻率最高(62.6%)[23]。有研究表明CD133甲基化程度與GIST原發(fā)部位及KIT突變相關(guān),KIT突變胃GIST表現(xiàn)為更低的甲基化程度與更高的CD133蛋白表達(dá)富集,且CD133超甲基化多見于PDGFRA突變胃GIST[13]。

綜上,非胃GIST、Ki-67>5%以及CD133高表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨立危險因素,可作為胃腸道間質(zhì)瘤預(yù)后評估指標(biāo);CD133在非胃GIST、腫瘤直徑>5cmGIST、核分裂象>5個/HPF、Ki-67>5%、高?；颊咭约稗D(zhuǎn)移性GIST中高表達(dá);CD133甲基化程度高多見于KIT突變的胃GIST。研究因大部分中高?；颊咝g(shù)后進(jìn)行伊馬替尼輔助治療,導(dǎo)致終點事件發(fā)生較少,同時觀察隨訪事件較短,為了進(jìn)一步了解CD133與胃腸道間質(zhì)瘤之間的關(guān)系,需增加病例數(shù)量以及延長隨訪時間,同時缺乏術(shù)后基因檢測結(jié)果,CD133與GIST突變類型之間的聯(lián)系有待進(jìn)一步研究。