李飛飛，王韻，顧冀海,2，張玉明,2，柳峰松,2，倪志華,2

研究報(bào)告

E2F家族轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤發(fā)生中的作用

李飛飛1，王韻1，顧冀海1,2，張玉明1,2，柳峰松1,2，倪志華1,2

1. 河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定 071002 2. 河北省動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保定 071002

腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康，轉(zhuǎn)錄因子是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。作為重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，E2F在細(xì)胞增殖與調(diào)控進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。然而，E2F家族轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤發(fā)生進(jìn)程中的表達(dá)規(guī)律、基因功能和分子互作等關(guān)鍵信息尚不清晰。基于此，本研究對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中我國(guó)10種高發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)、突變數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，探究E2F家族轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)、結(jié)構(gòu)、功能、突變和系統(tǒng)發(fā)生特征。結(jié)果顯示，E2F家族轉(zhuǎn)錄因子中的和基因在多種腫瘤樣本中規(guī)律性上調(diào)表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老等信號(hào)通路；其中，E2F1作為重要的調(diào)控因子與其他蛋白的相互作用最多。值得指出的是，E2F家族轉(zhuǎn)錄因子的基因突變類型在腫瘤類型和患者性別中均存在差異，基因擴(kuò)增占比最大。系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，E2F家族轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)在包括果蠅、線蟲(chóng)和人類在內(nèi)41個(gè)物種中保守，并且它們?cè)谖锓N演化過(guò)程中表現(xiàn)出基因擴(kuò)張傾向。綜上所述，本研究闡明了E2F家族轉(zhuǎn)錄因子在我國(guó)高發(fā)腫瘤中的表達(dá)規(guī)律、突變特征和演化規(guī)律，提示E2F家族轉(zhuǎn)錄因子是相關(guān)腫瘤疾病的新型分子診斷標(biāo)志物，為抗腫瘤靶向藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。

E2F1；E2F7；基因家族；結(jié)構(gòu)

全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，世界范圍內(nèi)每年新增癌癥病例1930萬(wàn)以上，占全球人口總數(shù)的2.5%[1,2]。在中國(guó)新發(fā)癌癥病例中，發(fā)病人數(shù)位居前10的腫瘤類型是肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)、肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)、乳腺癌(breast invasive carcinoma，BRCA)、結(jié)腸腺癌(colon adenocarcinoma，COAD)、肝細(xì)胞癌(liver hepatoce-llular carcinoma，LIHC)、胃腺癌(stomach adenocar-cinoma, STAD)、膽管癌(cholangiocarcinoma，CHOL)、食管癌(esophageal carcinoma, ESCA)、直腸腺癌(rectum adenocarcinoma, READ)和甲狀腺癌(thy-roid carcinoma, THCA)[1]?，F(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)了一批與癌癥發(fā)病相關(guān)的重要基因[3～9]，如[3,4]、[5,10]、[6]等。由于腫瘤的種類多、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，疾病相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制一直是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[10～16]。關(guān)注癌癥的相關(guān)基因和代謝通路，有助于發(fā)現(xiàn)更多分子診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡和遷移等多項(xiàng)重要的生物學(xué)過(guò)程，是公認(rèn)的癌癥發(fā)生參與者[17,18]。作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)受到廣泛關(guān)注[19～25]。例如，與乳腺癌、肺癌等相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子SOX2和KRAS已經(jīng)引起學(xué)者重視[26～30]。作為人類基因組中65個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族[29]之一，E2F家族轉(zhuǎn)錄因子(E2F family transcription factors，E2Fs)共有11個(gè)成員，被命名為E2F1～E2F8和TFDP1～TFDP3，在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[31～33]。不同E2Fs在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用不同：E2F1和E2F2常作為轉(zhuǎn)錄激活劑(transcription activators)，E2F4和E2F5作為轉(zhuǎn)錄阻遏物(transcriptionrepressors)，E2F6～ E2F8則是作為轉(zhuǎn)錄抑制劑(transcriptional inhibi-tors)[34]。E2F1在肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[35]。Wang等[36]報(bào)道E2F1通過(guò)激活基因的轉(zhuǎn)錄，可增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞遷移、生存能力和侵襲能力，并影響非小細(xì)胞肺癌的腫瘤進(jìn)程和轉(zhuǎn)移。在黑色素瘤中，過(guò)表達(dá)的E2F1可誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Mcl-1的降解和ASK1/JNK和p38通路的激活，進(jìn)而觸發(fā)凋亡[37]。E2F7不僅作為轉(zhuǎn)錄抑制因子參與細(xì)胞周期調(diào)控[38]，還參與了腫瘤的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，沉默基因的表達(dá)會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡[39]。Toolabi等[40]發(fā)現(xiàn)E2F1和E2F7在結(jié)腸癌中作為最重要的轉(zhuǎn)錄因子，與大量蛋白發(fā)生相互作用。此外，E2F7還可能參與介導(dǎo)了免疫細(xì)胞浸潤(rùn)[34,41]。雖有文獻(xiàn)報(bào)道E2F1和E2F7在肺癌[34,42]、結(jié)直腸癌[43]和胃癌[44]等個(gè)別腫瘤中出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，但均是基于單一腫瘤類型的研究結(jié)論，未有系統(tǒng)的橫向比較、分析和歸納。在我國(guó)，肺腺癌等高發(fā)腫瘤患者人數(shù)占我國(guó)癌癥患者總數(shù)的60.5%以上[1]。E2Fs在高發(fā)癌癥發(fā)生中的表達(dá)模式還有待探討，相關(guān)研究亟待開(kāi)展。

目前，E2Fs相關(guān)信息可在數(shù)據(jù)庫(kù)AnimalTFDB[45]中開(kāi)放獲取。大規(guī)模測(cè)序已經(jīng)為癌癥發(fā)病相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子篩選和分析提供了可能。本研究通過(guò)分析E2Fs在我國(guó)10種高發(fā)腫瘤中的表達(dá)、突變情況，闡述該家族的基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和基因的擴(kuò)增趨勢(shì)，旨在揭示E2Fs在癌癥發(fā)生進(jìn)程中的功能，為腫瘤的分子診斷提供數(shù)據(jù)參考，也為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新的潛在藥物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

選取我國(guó)高發(fā)的10種腫瘤類型，使用TCGAbiolinks (version 2.25.3)下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov/)包括乳腺癌(BRCA)、結(jié)腸腺癌(COAD)、肝細(xì)胞癌(LIHC)、胃腺癌(STAD)、肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)、膽管癌(CHOL)、食管癌(ESCA)、直腸腺癌(READ)和甲狀腺癌(THCA)腫瘤樣本及其對(duì)照樣本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)(表1)。E2Fs信息來(lái)自AnimalTFDB 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)[34](http:// bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/#!/)。根據(jù)Time-tree (http://timetree.org/)中物種的進(jìn)化規(guī)律，選擇包括線蟲(chóng)()、果蠅()到小鼠()，黑猩猩()和人類()等41個(gè)物種的E2F基因家族(物種和基因信息見(jiàn)附表1)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。

1.2 差異表達(dá)基因分析

使用edgeR軟件[46]對(duì)下載自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理和歸一化，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析腫瘤標(biāo)本和正常組織標(biāo)本之間的差異表達(dá)基因并計(jì)算值和差異倍數(shù)。差異表達(dá)基因的閾值設(shè)定為|log2(fold change)| > 1和0.05。提取E2F1和E2F7的表達(dá)數(shù)據(jù)，使用log2(counts) 繪制基因的表達(dá)情況，并采用test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。檢索UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/index. html) 24種腫瘤(附表2)中E2F1和E2F7基因的表達(dá)情況，與本研究的分析結(jié)果進(jìn)行比較。

表1 癌癥樣本數(shù)據(jù)分組信息

1.3 轉(zhuǎn)錄因子的功能注釋與互作網(wǎng)絡(luò)識(shí)別

使用ClusterProfile軟件[47]進(jìn)行基因GO注釋和KEGG通路富集分析，閾值均設(shè)為0.05。通過(guò)STRING (https://string-db.org/)和GeneMANIA (https:// genemania.org/)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 基因突變分析

使用數(shù)據(jù)庫(kù)cBioPortal for Cancer Genomics (https://www.cbioportal.org/)的在線工具，分析和可視化TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)包含2922個(gè)樣本的E2Fs基因突變情況。

1.5 保守基序的鑒定

使用MEME Version 5.5.0 (https://meme-suite. org/meme/tools/meme)鑒定E2Fs的蛋白質(zhì)保守基序，并使用TBtools軟件進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域、外顯子、內(nèi)含子、基序元件繪圖。

1.6 染色體定位和共線性分析

參照人類基因組注釋文件(GRCh38.p13)使用JCVI(v1.2.7)在全基因組基因水平上進(jìn)行人類E2Fs的共線性分析，并對(duì)人與斑馬魚(yú)()雞()非洲爪蟾()小鼠黑猩猩5個(gè)物種的共線性分析，以識(shí)別基于CDS的共線性基因。

1.7 系統(tǒng)發(fā)生分析

使用CAFE 5[48]進(jìn)行基因擴(kuò)張/收縮分析。Muscle 5.1.linux64軟件進(jìn)行全局多序列比對(duì)，使用Fasttree軟件構(gòu)建基于最大似然法的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展值為1000。使用在線網(wǎng)站Evolview v3 (http://www. evolgenius.info/evolview/#/)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 E2F1和E2F7基因在10種癌癥中規(guī)律性上調(diào)表達(dá)

與正常樣本相比，10種高發(fā)腫瘤樣本中的和基因均上調(diào)表達(dá)(<0.05，圖1A)。其中，肝細(xì)胞癌中基因上調(diào)表達(dá)最多，上調(diào)表達(dá)了3.57倍；肺腺癌中上調(diào)表達(dá)最少，上調(diào)表達(dá)了1.53倍?；虻谋磉_(dá)情況與基因的基本一致：膽管癌上調(diào)表達(dá)最多，上調(diào)表達(dá)了4.52倍；甲狀腺癌上調(diào)表達(dá)水平最低，為1.45倍。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中，包括本研究所選10種高發(fā)腫瘤在內(nèi)的24種癌癥樣本中基因(圖1B)和基因(圖1C)均上調(diào)表達(dá)。結(jié)果證實(shí)，和基因在多數(shù)癌癥中均規(guī)律性上調(diào)表達(dá)。由于E2F1和E2F7同屬E2F轉(zhuǎn)錄因子家族，有必要深入探討E2Fs的結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)生特點(diǎn)，為癌癥的發(fā)病原因提供分子層面的依據(jù)。

圖1 E2F1和E2F7基因在腫瘤樣本中上調(diào)表達(dá)

A：和基因在10種中國(guó)高發(fā)癌癥中表達(dá)上調(diào)；B：UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中基因的上調(diào)表達(dá)情況；C：UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中基因的表達(dá)情況。*：0.05；**：0.005; ***：0.001。

此外，其他E2Fs雖大部分成員出現(xiàn)表達(dá)量提高，但不同腫瘤樣本中表達(dá)量的改變情況不同。基因在除LICH和THCA的8種高發(fā)腫瘤中表達(dá)上調(diào)(0.05)?；蛟诔鼵OAD、STAD、READ和THCA的6種高發(fā)腫瘤中表達(dá)上調(diào)(0.05)?；蛟贐RCA、COAD、LIHC等6種高發(fā)腫瘤中表達(dá)上調(diào)(0.05)?；蛟贐RCA、LIHC和LUAD等6種腫瘤中表達(dá)上調(diào)(0.05)?；蛟贓SCA和LUSC等2種腫瘤中表達(dá)上調(diào)?；騼H在READ中表達(dá)上調(diào)(0.05)?；騽t僅在LIHC中表達(dá)上調(diào)。和基因則在10種高發(fā)腫瘤中均沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的表達(dá)量的差異。

2.2 E2Fs通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用參與細(xì)胞周期調(diào)控

作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子，E2Fs與DNA的轉(zhuǎn)錄激活與抑制、啟動(dòng)子結(jié)合等功能相關(guān)。本研究中，GO富集分析結(jié)果顯示，E2Fs基因所涉及的生物學(xué)過(guò)程主要是有絲分裂的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，特別是有絲分裂過(guò)程中細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換和調(diào)控等(圖2A)。KEGG通路分析顯示，E2Fs主要參與細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老等信號(hào)通路以及由細(xì)胞周期紊亂所導(dǎo)致的膀胱癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等多種癌癥(圖2B)。

圖2 E2Fs的功能和蛋白質(zhì)相互作用分析

A：E2Fs基因的GO富集；B：E2Fs的KEGG通路分析結(jié)果；C：應(yīng)用GeneMANIA構(gòu)建的E2Fs與其他蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)；D：應(yīng)用String構(gòu)建的E2Fs之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

GO富集和KEGG通路分析的結(jié)果得到了相互證實(shí)，但不同E2Fs成員在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用不同。在KEGG富集結(jié)果中，E2F6、E2F7、E2F8和TFDP3沒(méi)有富集到特定的通路上。為確定E2Fs的功能，本研究使用GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析與E2Fs發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示，E2Fs除可相互結(jié)合外，還可以與RB1、RB樣蛋白，RFX家族蛋白，VPS36，HSF家族蛋白等與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的蛋白發(fā)生結(jié)合。E2F2和E2F6蛋白的分子功能僅包括形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，而E2F1、E2F4、E2F7、E2F8和TFDP1～3則在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞有絲分裂G1期向S期的轉(zhuǎn)化過(guò)程中起調(diào)控作用(圖2C)。進(jìn)一步使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)查看E2Fs各成員之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該家族成員之間的相互作用的邊為37，遠(yuǎn)高于預(yù)期值1(10–16)(圖2D)，這進(jìn)一步證明雖然在GO富集和KEGG通路分析中有些E2Fs的功能沒(méi)有得到注釋，但是這些分子或是通過(guò)與家族其他成員結(jié)合發(fā)揮重要作用。此外，E2F1與該家族的其他成員之間的相互作用最多，其次是TFDP1。E2F6～8以及TFDP3均與E2F1發(fā)生相互作用。GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)和STRING數(shù)據(jù)庫(kù)均顯示E2Fs可以和多種蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，這提示可能是在GO和KEGG注釋中，E2Fs特別是E2F7、E2F8和TFDP3的功能被低估。

2.3 不同癌癥中E2Fs的突變類型和突變比例不同

基因突變分析結(jié)果顯示，包括高發(fā)癌癥在內(nèi)的24種癌癥中，E2Fs的基因突變比例不同，突變的類型也不盡相同(圖3A)。在膀胱癌(BLCA)中E2Fs的基因突變率可達(dá)30%以上，而在甲狀腺癌中基因突變率僅有約1%。此外，在大部分腫瘤樣本中，E2Fs的基因突變類型以基因擴(kuò)增、堿基突變和基因缺失為主。而在胸腺癌(thymoma，THYM)樣本中，E2Fs主要發(fā)生的是基因擴(kuò)增與缺失突變。

圖3 癌癥中E2Fs的突變類型和比例

A：24種癌癥中，E2Fs的突變比例和突變類型；B：E2Fs各成員在癌癥樣本中的突變比例和類型。

如圖3B所示，E2Fs各成員在24種癌癥樣本中的突變比例和類型不同。其中，基因突變率最高(13%)，基因次之(9%)，基因的突變率最低(圖3B)。大部分E2Fs的基因突變類型以基因擴(kuò)增為主，還包括少數(shù)的基因缺失和錯(cuò)義突變等；而的突變類型以基因缺失為主，基因擴(kuò)增的比例較少。此外，大部分E2Fs的基因突變類型和比例在不同性別癌癥患者中是一致的(圖3B)。但是，基因在男性患者中發(fā)生缺失的比例更高；而在女性患者中，基因除發(fā)生缺失突變外，還有一定比例的基因擴(kuò)增(圖3B)。

2.4 E2Fs蛋白具有保守的結(jié)構(gòu)域和基序組成

人類E2Fs的蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，11個(gè)E2Fs成員都含有motif 1 (圖4A，表2)。此外，E2F1～E2F5均包含motif 1～motif 3，且有相似的位置與排列。其中，E2F1～E2F3的motif排列與結(jié)構(gòu)更相似，而E2F4和E2F5的基序位置與排列更相似。E2F7和E2F8蛋白只有motif 1和motif 2兩種基序(表2)。TFDP1、TFDP2、TFDP3成員含有motif 1、3、4和5序列(表2)。人類E2Fs共包含4種保守的結(jié)構(gòu)域(圖4B)，其中所有E2Fs均包含名為E2F-TDP的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這也是E2F家族名稱的由來(lái)。E2F1～E2F6還包含了E2F-DP結(jié)構(gòu)域，使E2F以同源二聚體或異源二聚體形式與靶DNA結(jié)合。TFDP1～TFDP3則較其他E2Fs多了一個(gè)DP (dimerization partners)結(jié)構(gòu)域，增加了蛋白形成二聚體的可能性。人類E2Fs各基因的外顯子數(shù)量從1到13不等(圖4C)。其中位于X染色體上的基因長(zhǎng)度是1692 bp，僅包含1個(gè)外顯子；、和基因的外顯子個(gè)數(shù)最多是13個(gè)。從編碼區(qū)的長(zhǎng)度看，基因的編碼區(qū)最長(zhǎng)是2736 bp (圖4C)。

2.5 E2F家族基因隨著物種進(jìn)化而擴(kuò)張

人類的E2Fs定位在11條染色體上，共線性分析顯示，和基因存在部分的復(fù)制情況(圖5A)。片段復(fù)制發(fā)生的位置涉及基因的第2、4個(gè)內(nèi)含子和基因的第6、8個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度分別為306和297個(gè)堿基。

如圖5B所示，5種脊椎動(dòng)物E2Fs共線性分析的結(jié)果表明，人和斑馬魚(yú)、非洲爪蟾、小鼠，雞和黑猩猩之間的預(yù)測(cè)共線對(duì)數(shù)分別為61、177、160、162和39。由此可見(jiàn)，E2Fs在脊椎動(dòng)物中具有較強(qiáng)的同源性，并且基因個(gè)數(shù)有增加的傾向。進(jìn)一步通過(guò)基因擴(kuò)張/收縮分析發(fā)現(xiàn)，從無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物E2Fs的成員隨著物種的進(jìn)化而呈現(xiàn)顯著的基因擴(kuò)張(圖5C)。

圖4 E2Fs的蛋白質(zhì)基序、保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)特征

A：人類E2Fs的基序組成；B：人類E2Fs的保守結(jié)構(gòu)域；C：E2Fs的基因結(jié)構(gòu)特征。

表2 人類E2Fs的保守基序

圖5 E2Fs共線性分析與基因擴(kuò)張

A：E2Fs在人類基因組上的定位和基因復(fù)制情況；B：人()、黑猩猩()、小鼠()、爪蟾()、雞()和斑馬魚(yú)()基因組中的E2Fs的共線性關(guān)系；C：41個(gè)物種中E2Fs的基因擴(kuò)張。

由于蛋白質(zhì)序列相似度高，不同物種來(lái)源的E2Fs按照成員編號(hào)聚在一起(圖6)。之后，E2F1、E2F2和E2F3聚為一枝；E2F7和E2F8聚為一枝后再與E2F6聚在一起；E2F4和E2F5聚為一枝；TFDP1～TFDP3聚為一枝。可見(jiàn)，在脊椎動(dòng)物出現(xiàn)時(shí)，E2Fs已經(jīng)完成了基因的加倍，聚為一枝的E2Fs來(lái)源于相同的基因祖先，之后各直系同源基因隨著物種的演化而發(fā)生變化。此外，不同物種的E2Fs蛋白質(zhì)序列均含有保守的motif 2，進(jìn)一步證明E2Fs的蛋白基序相對(duì)保守。E2F1～E2F8成員均含有motif 2和motif 3，TFDP1～TFDP3成員均含有motif 1、motif 2、motif 4和motif 5。與其他物種不同，motif 5僅在人類的TFDP1～TFDP3出現(xiàn)，而E2F1～E2F8中均不存在該基序。

圖6 E2Fs系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

腫瘤發(fā)生時(shí)最主要的生物學(xué)特征是發(fā)生細(xì)胞周期調(diào)控功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。轉(zhuǎn)錄因子作為特殊的蛋白質(zhì)可以調(diào)控靶蛋白的表達(dá)，因此是一類重要的腫瘤標(biāo)記物[37]。研究顯示，E2Fs在調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄、DNA合成和細(xì)胞周期等方面發(fā)揮重要作用[49]?；诖?，本研究通過(guò)生物信息手段對(duì)E2F家族轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤中的表達(dá)規(guī)律與分子特征進(jìn)行了系統(tǒng)闡述。首先，本研究發(fā)現(xiàn)和基因在我國(guó)10種高發(fā)腫瘤中均有規(guī)律性上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。該表達(dá)特點(diǎn)提示，E2F1和E2F7廣泛參與癌癥發(fā)生過(guò)程中，它們可作為腫瘤通用標(biāo)記物用于臨床腫瘤的篩查[50]。

E2F1作為細(xì)胞G1/S期檢查點(diǎn)的重要調(diào)控因子[51]，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞DNA合成、細(xì)胞增殖等相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活的作用[52]。除可直接激活腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子SOX2等外，E2F1還可增強(qiáng)抗腫瘤藥物咖啡酸苯乙酯(phenethyl caffeate，CAPE)的藥效[37]。可見(jiàn)，基因的高表達(dá)水平與腫瘤的增殖有關(guān)，而基因表達(dá)量降低則會(huì)導(dǎo)致抗腫瘤藥物的效果降低。此外，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析發(fā)現(xiàn)E2F1與家族中其他成員之間的相互作用最多、關(guān)聯(lián)最為密切。因此需要以E2F1為藥物靶標(biāo)研發(fā)藥物以穩(wěn)定其表達(dá)水平。基因被TP53蛋白激活后，進(jìn)一步可調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因[38]。高表達(dá)的基因則會(huì)激活A(yù)KT1-cyclin D1信號(hào)通路及其下游的細(xì)胞周期蛋白，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的增殖[53]。推測(cè)，抑制基因的高表達(dá)，將有助于抑制腫瘤細(xì)胞增殖。此外，與E2Fs發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)在細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用。例如，Rb蛋白可通過(guò)磷酸化/去磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化[54]。VPS36蛋白在胞質(zhì)分裂階段發(fā)揮關(guān)鍵作用[55]。這進(jìn)一步說(shuō)明，E2Fs在細(xì)胞增殖分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可將E2Fs作為藥物靶點(diǎn)，用于調(diào)控細(xì)胞周期。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)、和這3個(gè)基因的功能在GO和KEGG富集中均沒(méi)有結(jié)果，這可能是由于數(shù)據(jù)庫(kù)更新較慢導(dǎo)致相關(guān)的功能沒(méi)有得到很好的注釋。

腫瘤細(xì)胞中存在著大量的基因突變[56]。本研究發(fā)現(xiàn)，除外，E2Fs在24種腫瘤細(xì)胞中的突變類型以擴(kuò)增為主，且無(wú)明顯的性別偏倚?；蛟谀[瘤中的突變率相對(duì)較高，這雖然在Xu等[43]對(duì)結(jié)直腸癌研究結(jié)果中也有所體現(xiàn)，但本研究的分析結(jié)果將這一規(guī)律擴(kuò)展到了包括高發(fā)腫瘤在內(nèi)的24種惡性腫瘤，這無(wú)疑為臨床上基因的突變檢測(cè)提供了理論支持。郭愛(ài)葉等[57]發(fā)現(xiàn)基因的錯(cuò)義突變與結(jié)直腸癌易感性相關(guān)，與之不同，本研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中基因的突變以基因擴(kuò)增為主。其原因是，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋了腫瘤樣本基因突變的全部類型，而郭愛(ài)葉等[57]的研究關(guān)注點(diǎn)僅為錯(cuò)義突變。除發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中基因發(fā)生錯(cuò)義突變的比例較高外，本研究還確定了高發(fā)腫瘤中基因占比最多的突變類型——基因擴(kuò)增。研究角度不同是導(dǎo)致結(jié)果不同的主要原因。此外，位于人類X染色體上的基因，在男性患者中更多的是發(fā)生基因的缺失突變。推測(cè)，這可能與男性僅有1條X染色體，無(wú)法通過(guò)同源重組進(jìn)行基因損傷后修復(fù)有關(guān)。E2Fs家族成員的突變規(guī)律提示在以后的臨床檢測(cè)中可以將E2Fs的突變作為腫瘤判定的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。

人類11個(gè)E2Fs成員均含有motif 1和motif 3，這提示這兩個(gè)motif對(duì)于蛋白的結(jié)構(gòu)十分重要。在腫瘤患者中，檢測(cè)motif 1和motif 3的結(jié)構(gòu)，將有助于監(jiān)控E2Fs的結(jié)構(gòu)和功能。此外，系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果顯示，包括果蠅、線蟲(chóng)和人類在內(nèi)的41個(gè)物種中E2Fs的蛋白質(zhì)序列相對(duì)保守，均包含21個(gè)氨基酸的保守序列(IHLIEKKSKNHIQWIGRGTNS)。該序列是E2F家族DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(E2F/DP family winged-helix DNA-binding domain)的重要組成部分。因DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域決定了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合靶DNA的特異性，可知E2Fs所能結(jié)合的靶序列也相對(duì)保守。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著物種的演化E2Fs家族存在顯著的基因擴(kuò)張趨勢(shì)，這可能與E2Fs在細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中功能的分化有關(guān)。在人類基因組中，和基因在內(nèi)含子區(qū)存在2個(gè)復(fù)制片段，這提示內(nèi)含子的復(fù)制有助于物種演化過(guò)程中應(yīng)對(duì)突變風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)和基因在腫瘤樣本中規(guī)律性上調(diào)表達(dá)，其基因功能主要是調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老等信號(hào)通路，其中E2F1與其他蛋白的相互作用最多。E2Fs的基因突變類型在不同腫瘤類型和患者性別中均存在差異，其中基因擴(kuò)增的比例最大。E2Fs序列在包括果蠅、線蟲(chóng)到人類在內(nèi)41個(gè)物種中保守，并且，E2F家族在物種演化過(guò)程中存在基因擴(kuò)張傾向。作為關(guān)鍵調(diào)控因子，E2F1和E2F7在癌癥發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。本研究的結(jié)果可為腫瘤的基因診斷及抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

感謝河北大學(xué)高性能計(jì)算平臺(tái)對(duì)本研究的大力支持。

附加材料見(jiàn)文章電子版www.chinagene.cn。

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E2F family play important roles in tumorigenesis

Feifei Li1, Yun Wang1, Jihai Gu1,2, Yuming Zhang1,2, Fengsong Liu1,2, Zhihua Ni1,2

Tumors are serious threats to human health. The transcription factors are regarded as the potential targets for tumor treatment. As an important family of transcription factors, E2F family transcription factors (E2Fs) play vital roles in cell proliferation and regulation. However, the expression feature, gene functions, and molecular interactions of E2Fs in tumorigenesis are not clear. In this study, the transcriptome data, mutation data, and protein-protein interaction data of 10 high-incidence tumors in China from the TCGA database were integrated and analyzed to explore the expression, structure, function, mutation, and phylogenetic characteristics of E2Fs. The results showed thatandwere regularly upregulated in the tumor samples. Moreover, E2Fs participated in the regulation of the cell cycle, cell aging, and other signaling pathways. As an important regulator, E2F1 interacted with more proteins than other E2Fs.At the same time, the genetic mutation types of E2Fs varied in tumor type and patient sex, of which gene amplification accounts for the largest proportion. Phylogenetic analysis showed that E2Fs were conserved in 41 species, including fruit flies, nematodes, and humans. Meanwhile, E2Fs had a tendency for gene expansion during evolution. In conclusion, this study clarified the expression pattern, mutation characteristics, and evolutionary trend of E2Fs in high-incidence tumors in China, and suggested that E2F family transcription factors could be novel diagnostic markers for tumor diseases.Furthermore, this work can provide a theoretical basis for the development of anti-tumor-targeted drugs.

E2F1; E2F7; gene family; structure

2023-02-10;

2023-05-01;

2023-05-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：42207336)，河北省自然科學(xué)基金生物農(nóng)業(yè)聯(lián)合基金項(xiàng)目(編號(hào)：C202204227)和河北大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(編號(hào)：HBU2022ss016)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 42207336), Hebei Province Natural Science Foundation Joint Fund for Bioagriculture Project (No. C202204227), and the Post-graduates Innovation Fund Project of Hebei University (No. HBU2022ss016)]

李飛飛，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail: huxiaoerfei@outlook.com

柳峰松，博士，教授，研究方向：分子免疫學(xué)；E-mail: liufengsong@hbu.edu.cn

倪志華，博士，副教授，研究方向：生物信息學(xué)、比較基因組學(xué)；E-mail: nizhihua@hbu.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-029

(責(zé)任編委: 方向東)