張翌，吳志英

綜 述

伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈病的發(fā)病機制及治療研究進展

張翌，吳志英

浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，醫(yī)學遺傳科/罕見病診治中心，杭州 310009

伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈病(cerebral autosomal-dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CADASIL)是成人最常見的遺傳性腦小血管病。自CADASIL的致病基因被鑒定以來，大量CADASIL病例被報道，但迄今仍缺乏有效的治療藥物。本文針對CADASIL的疾病模型和致病機制、對癥藥物治療及潛在治療方案研究進展進行綜述，以期為后續(xù)CADASIL發(fā)病機制和治療研究提供參考。

伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈?。话l(fā)病機制；治療進展

伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈病(cerebral autosomal dominant arterio-pathy with subcortical infarcts and leukoencephalo-pathy，CADASIL)是成人最常見的遺傳性腦小血管病。目前CADASIL流行病學資料仍不完善，既往研究結(jié)果顯示其發(fā)病率至少為2/100,000～ 5/100,000[1]，男女發(fā)病無差異?；颊叨嘣?0～60歲發(fā)病，典型癥狀包括先兆性偏頭痛、短暫性腦缺血或缺血性卒中反復發(fā)作、認知障礙及精神行為異常等[2]。其臨床表型在不同人種中存在異質(zhì)性，中國CADASIL患者通常在40歲后發(fā)病[3]，偏頭痛較為少見，而缺血性卒中發(fā)生率較高[4]。CADASIL患者可見典型的顱內(nèi)慢性小動脈病變，例如彌漫性脫髓鞘和腔隙性梗死；鏡下可見小穿支動脈和軟腦膜動脈病變，表現(xiàn)為動脈壁增厚所致的管腔狹窄和血管平滑肌的形態(tài)學變化等[2]。1993年，CADASIL致病基因被定位于人類19號染色體[5]。1996年，Joutel等[6]確認為CADASIL的致病基因，成為診斷CADASIL的金標準。目前已有超過400種基因突變在不同種族人群中被報道[3,4,7～9]。這些突變導致Notch3蛋白發(fā)生錯誤折疊，使細胞外結(jié)構(gòu)域在腦血管的平滑肌細胞和周細胞(統(tǒng)稱為壁細胞)上發(fā)生聚集，部分Notch3的配體以及細胞外基質(zhì)蛋白也會聚集在這些沉積物中，稱之為嗜鋨顆粒物質(zhì)(granular osmiophilic material，GOM)，這是CADASIL最重要的病理特征[10,11]。但迄今為止，仍未找到針對CADASIL病因或發(fā)病機制進行干預的疾病修飾治療(disease modification therapy，DMT)藥物或方法。近年來，有關(guān)CADASIL的發(fā)病機制和治療研究取得了較大進展。為此，本文針對CADASIL的疾病模型和致病機制、對癥藥物治療及潛在治療方案研究進展進行綜述。

1 CADASIL的發(fā)病機制和疾病模型

1.1 NOTCH3基因結(jié)構(gòu)和生物學功能

基因由33個外顯子組成，編碼一個由2321個氨基酸組成的單次跨膜受體。該受體包含一個胞外結(jié)構(gòu)域、3個Notch/Lin12重復、一個跨膜結(jié)構(gòu)域以及一個胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域由基因的2～24號外顯子編碼，包含34個上皮生長因子樣重復序列(epidermal growth factor-like repeats，EGFR)。每個EGFR含有6個半胱氨酸殘基，形成3對二硫鍵以穩(wěn)定該受體的結(jié)構(gòu)。目前報道的絕大多數(shù)CADASIL患者的致病變異位于34個EGFR序列上，且涉及半胱氨酸個數(shù)的改變，使單個EGFR內(nèi)的半胱氨酸殘基個數(shù)由偶數(shù)變?yōu)槠鏀?shù)，即由正常的6個變?yōu)?個或5個，導致Notch3結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[2]。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含7個錨蛋白重復序列。

Notch3蛋白主要在血管平滑肌細胞和周細胞上表達，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后，轉(zhuǎn)運到高爾基體進行糖基化修飾并進行S1剪切，最終定位于細胞膜表面。與其他NOTCH家族成員類似，Notch3在NOTCH信號通路中發(fā)揮作用。如圖1所示，與配體Jagged或Delta結(jié)合后，Notch3將發(fā)生S2和S3剪切，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域被切割并進入細胞核中，與CSL(core binding factor 1/suppresor of hairless/longevity assurance gene 1)和MAM(mastermind)共同形成轉(zhuǎn)錄激活因子復合物，促進下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，并參與調(diào)控血管平滑肌細胞的成熟和分化[12]。

1.2 發(fā)病機制

目前CADASIL的發(fā)病機制仍未明晰，利用動物模型進行的研究結(jié)果提示，突變導致其編碼蛋白Notch3的異常是CADASIL發(fā)病的主要原因，主要表現(xiàn)為Notch3蛋白的聚集和NOTCH信號通路的異常，并且對血管平滑肌及血管神經(jīng)單元的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了影響。

1.2.1 Notch3蛋白聚集

發(fā)生在Notch3 EGFR區(qū)域內(nèi)半胱氨酸突變可使二硫鍵產(chǎn)生錯配，導致Notch3蛋白發(fā)生錯誤折疊，其胞外結(jié)構(gòu)域在腦血管的平滑肌細胞和周細胞內(nèi)發(fā)生聚集，形成GOM顆粒，可在電鏡下被觀察到。部分細胞外基質(zhì)蛋白與Notch3共同定位于GOM顆粒中，包括組織金屬蛋白酶抑制因子-3(tissue inhibitor of metalloproteinases-3，TIMP-3)、玻連蛋白、內(nèi)皮抑素等[13]。突變的Notch3在細胞中的清除時間延長，這可能與突變導致的血管平滑肌細胞自噬體和溶酶體融合缺陷有關(guān)，Notch3不能被正常清除從而發(fā)生聚集與沉積。隨著病程發(fā)展，這些聚集物的毒性會進一步增強，進一步導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細胞凋亡[14]。

盡管目前已知Notch3突變蛋白聚集物形成GOM顆粒與CADASIL發(fā)病密切相關(guān)，但聚集物中的蛋白是如何相互作用并引起細胞毒性的機制仍不清楚。此外，目前也沒有直接證據(jù)表明GOM顆粒數(shù)量與臨床表型的嚴重程度存在關(guān)聯(lián)，對Notch3突變蛋白聚集物仍需進一步研究。

圖1 Notch3信號通路

經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯得到的Notch3蛋白進入高爾基體，發(fā)生糖基化修飾并被Furin進行S1剪切。成熟的Notch3蛋白接著被轉(zhuǎn)運至細胞膜上，鄰近細胞膜上的配體Delta或Jagged能夠結(jié)合并激活Notch3信號通路。配體與受體的結(jié)合使得Notch3上的S2位點暴露出來，解整合素-金屬蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17)隨之進行S2剪切，產(chǎn)生的片段繼續(xù)被γ-分泌酶進行S3剪切，去除跨膜結(jié)構(gòu)域并釋放胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域被轉(zhuǎn)運至細胞核與CSL和MAM共同形成轉(zhuǎn)錄激活因子復合物，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 NOTCH信號通路異常

利用小鼠模型進行的研究發(fā)現(xiàn)，一般的突變并不會影響Notch3蛋白與配體的結(jié)合以及S2和S3剪切[15]。但位于Notch3配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域上的突變?nèi)鏑428S和C455R則會嚴重影響NOTCH信號通路。例如，在敲除小鼠模型中，表達正常人源Notch3蛋白能夠減少血管壁細胞的損失、挽救小鼠的卒中表型，但表達Notch3 C455R蛋白則無法挽救這些表型[16]。這些結(jié)果說明突變是否會導致Notch3蛋白與配體的結(jié)合出現(xiàn)障礙與突變所在的EGFR區(qū)域有關(guān)。

最近的研究表明，在CADASIL患者來源的原代或誘導多能干細胞(induce pluripotent stem cells，iPSCs)分化得到的血管平滑肌細胞中，NOTCH通路靶基因上調(diào)，提示了NOTCH通路活性的增強[17]。考慮到非配體結(jié)合區(qū)域的突變并不影響下游通路，對于大多數(shù)突變而言，通路活性的上調(diào)可能才是CADASIL的發(fā)病機制之一。

1.2.3 血管平滑肌離子通道異常

研究發(fā)現(xiàn)，TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠腦實質(zhì)小動脈平滑肌細胞膜上的鉀離子電壓門控通道數(shù)量(KV)增加了約60%。因此在40 mmHg生理壓力下，小鼠血管平滑肌細胞的去極化程度減小，收縮能力即肌源性緊張度(myogenic tone)減弱。而在使用了KV1通道抑制劑4-氨基吡啶(4-aminopyridine)或表皮生長因子受體激動劑肝素結(jié)合EGF(heparin binding epidermal growth factor，HB-EGF)后，能夠降低KV電流密度，從而在一定程度上恢復血管平滑肌的肌源性自身調(diào)節(jié)能力(myogenic response)[18]。此外，在TgNotch3R90C和TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠中，電生理結(jié)果顯示梗死灶周圍擴散性去極化頻率增加，擴散性去極化時細胞外鉀離子濃度升高[19]，這提示了細胞外鉀離子穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)異?？赡芘c離子通道也存在一定相關(guān)性。

進一步研究認為，KV數(shù)量的增加與GOM顆粒的形成相關(guān)。由于TIMP3在GOM中的沉積抑制了ADAM17，上調(diào)了電壓門控鉀離子通道的表達量，從而破壞了腦血管反應(yīng)性(cerebrovascular reactivity)和肌源性緊張度。在過表達人源TIMP3的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，也觀察到了類似CADASIL小鼠模型中出現(xiàn)的腦血管流量和肌源性自身調(diào)節(jié)的變化[20]。以上結(jié)果提示在CADASIL中，鉀離子通道的異?？赡苤苯佑绊懷芷交〉氖湛s，從而影響了血管的功能。但目前對于鉀離子通道及其他離子通道的研究尚缺乏，仍需未來進一步探索。

1.2.4 血管平滑肌細胞骨架和增殖能力改變

血管平滑肌的細胞骨架結(jié)構(gòu)能夠協(xié)調(diào)血管的收縮和舒張，異常的細胞骨架可能與CADASIL患者血管反應(yīng)性下降有關(guān)。在患者來源的iPSC分化得到的血管平滑肌細胞中，觀察到了細胞骨架的異常，表現(xiàn)為平行微絲聚集增多、不規(guī)則分布[17,21]。小鼠模型提示NOTCH信號通路的上調(diào)進一步導致RhoA/Rho激酶通路蛋白活性升高，考慮到該蛋白在調(diào)控細胞骨架中發(fā)揮的作用，這可能是CADASIL血管平滑肌細胞細胞骨架異常的原因之一[22]。

目前對于CADASIL患者血管平滑肌的增殖能力改變?nèi)詿o定論。2018年有研究發(fā)現(xiàn)，來自CADASIL患者臍帶、胎盤和大腦血管系統(tǒng)的血管平滑肌細胞增殖率低于對照組，患者細胞中轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)表達的增加與血管平滑肌細胞增殖率的下降有關(guān)，添加TGF-β中和抗體后，血管平滑肌細胞增殖率顯著上升[23]。但后續(xù)研究結(jié)果顯示，患者來源的血管平滑肌細胞和iPSC分化得到的血管平滑肌細胞的細胞增殖能力均增強[17,22]，因此需后續(xù)研究來獲得確切的結(jié)論。

1.2.5 血管神經(jīng)單元結(jié)構(gòu)和功能障礙

基因突變影響了周細胞、血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞等血管神經(jīng)單元(neurovascular unit，NVU)的正常結(jié)構(gòu)和功能。Notch3突變體對周細胞產(chǎn)生的影響與血管平滑肌細胞類似。隨著TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠年齡增長，其周細胞表面逐漸出現(xiàn)Notch3聚集，最終導致周細胞數(shù)量顯著減少，對毛細血管的覆蓋率降低[24]。

在患者來源iPSC分化得到的血管內(nèi)皮細胞中并未觀察到CADASIL疾病相關(guān)表型[17]，但將患者來源的原代血管平滑肌細胞與血管內(nèi)皮細胞系共培養(yǎng)時，內(nèi)皮細胞的增殖能力下降，這可能與TGF-β表達量上升有關(guān)[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞的細胞膜離子通道失活也與CADASIL發(fā)病相關(guān)。毛細血管內(nèi)皮細胞膜上的內(nèi)向整流鉀通道Kir2.1能夠感知神經(jīng)元活動并且傳播電信號，使得上游小動脈擴張并向活躍腦區(qū)供血，稱為功能性充血。而在TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠中，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2)的減少導致Kir2.1通道活性降低，進而使得小鼠腦部功能性充血受阻，而全身注射可溶性PIP2則能夠迅速恢復小鼠的功能性充血[25]。在該小鼠模型中，還觀察到了內(nèi)皮細胞黏連蛋白表達減少、血漿蛋白滲漏等改變[24]。

對CADASIL患者腦組織切片的免疫組化和免疫熒光結(jié)果顯示，正常星形膠質(zhì)細胞數(shù)量減少，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)陽性的星形膠質(zhì)細胞數(shù)量增加，且這些星形膠質(zhì)細胞出現(xiàn)了細胞質(zhì)腫脹和空泡化、遠端突起的解體和近端突起的碎裂等病理特征，一些自噬標記物如微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (microtubule-associated protein1 light chain 3，MAP1LC3)和p62也定位于這些星形膠質(zhì)細胞中，提示其正在經(jīng)歷自噬性死亡過程[26]。在TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，也觀察到了腦微血管星形膠質(zhì)細胞終足覆蓋率降低的現(xiàn)象[24]。

1.3 疾病模型

1.3.1 細胞模型

研究人員最初使用CADASIL患者的原代細胞，例如平滑肌細胞、皮膚成纖維細胞等進行實驗。隨著iPSC技術(shù)的進展，研究人員已成功將CADASIL患者來源的外周血單核細胞或皮膚成纖維細胞誘導形成iPSC，并進一步分化形成血管平滑肌細胞。例如，來源于攜帶R1076C突變患者的皮膚成纖維細胞分化得到的血管平滑肌細胞，產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)和功能異常，包括細胞增殖增加、平行微絲聚集成束。此外，該細胞模型還出現(xiàn)了NOTCH信號通路的上調(diào)和NF-κB信號通路的激活，提示炎癥反應(yīng)在CADASIL發(fā)病中具有一定作用[17]。另一項研究在R153C和C224T突變的iPSC及分化得到的壁細胞中，發(fā)現(xiàn)血小板衍生生長因子受體β (platelet-derived growth factor receptor β，PDGFRβ)表達和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)分泌減少，這可能與毛細血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性受損有關(guān)[27]。此后的研究在攜帶C106R、R141C、R182C突變患者來源的血管平滑肌細胞和周細胞中觀察到了Notch3胞外結(jié)構(gòu)域的聚集和細胞骨架的異常，但周細胞的標志物PDGFRβ的表達水平高于對照組，不同于之前的結(jié)果，這可能與采用不同的細胞分化方案有關(guān)。此外，還觀察到細胞的遷移速度明顯增加，但細胞的增殖率在不同樣本間存在較大差異[21]?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明細胞模型能夠為研究CADASIL的發(fā)病機制提供一些有益的幫助，但由于體外模型的不穩(wěn)定性，仍需要借助體內(nèi)模型來得到最終的結(jié)論。

1.3.2 動物模型

近年來，為了闡明CADASIL致病機制并探討治療方案，研究人員建立了斑馬魚()、小鼠()等動物模型(表1)。攜帶突變的斑馬魚轉(zhuǎn)基因模型出現(xiàn)動脈壁的損傷和Notch3下游基因表達的改變，這對于研究Notch3在血管發(fā)育中的作用有一定價值，但該模型并不能完全模擬CADASIL的表型，因此還需要其他模型的支持[28]。目前應(yīng)用最廣的是TgNotch3R90C和TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠模型，這兩種突變均為CADASIL患者的高頻突變，分別位于基因的3號和4號外顯子上[3]。

TgNotch3R90C轉(zhuǎn)基因小鼠是通過顯微注射線性化的cDNA片段構(gòu)建的，cDNA片段由平滑肌特異性啟動子SM22α和人源R90C cDNA組成，因此可在血管平滑肌細胞中特異性表達突變的Notch3蛋白。該小鼠產(chǎn)生了血管平滑肌的退化，包括細胞骨架的改變、細胞外基質(zhì)錨定異常等表型，且這些變化在胞外結(jié)構(gòu)域沉積形成GOM顆粒之前即已發(fā)生[31]。血管平滑肌細胞的退化導致小鼠出現(xiàn)了腦血管反應(yīng)性損傷、線粒體損傷、自噬減弱等表型[37]。但是Notch3 R90C的蛋白活性沒有明顯變化，突變的受體仍然能夠與配體結(jié)合并啟動下游信號通路[32]。這提示CADASIL的發(fā)病機制可能并不涉及信號通路的破壞，而是與突變蛋白的功能獲得(gain of function)相關(guān)。

表1 CADASIL動物模型

TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠同樣通過顯微注射構(gòu)建，cDNA片段來源于從文庫中篩選得到的包含大鼠基因的克隆，通過PCR引入R169C點突變，再將其酶切為線性化片段，用于顯微注射。與TgNotch3R90C轉(zhuǎn)基因小鼠一樣，在TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠的血管平滑肌細胞中也觀察到了Notch3胞外結(jié)構(gòu)域的聚集體及形成的GOM顆粒，且更早出現(xiàn)。此外，還觀察到小鼠腦部的白質(zhì)損傷，在損傷區(qū)域和非損傷區(qū)域均出現(xiàn)了低灌注現(xiàn)象，這提示低灌注可能參與白質(zhì)損傷的過程[33]。因此，該模型已被廣泛用于研究CADASIL機制和治療。利用該模型，研究者已證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和RhoA/Rho激酶在CADASIL發(fā)病中的重要作用，通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的藥物能夠挽救血管功能障礙[22]。由于該小鼠尚未出現(xiàn)腦梗死等表型，該模型可用來模擬CADASIL患者早期階段的表現(xiàn)。

除了以上兩種常用的小鼠模型，研究者還建立了其他CADASIL小鼠模型。例如，TgNotch3C428S和TgNotch3C455R轉(zhuǎn)基因小鼠所帶的突變位于Notch3的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，直接影響了蛋白正常的信號轉(zhuǎn)導，這兩種小鼠均出現(xiàn)了Notch3胞外結(jié)構(gòu)域的聚集和血管平滑肌的退化[35,36]；TgNotch3R182C和TgNotch3R1031C轉(zhuǎn)基因小鼠亦表現(xiàn)出CADASIL的典型病理特征，包括Notch3胞外結(jié)構(gòu)域的聚集體和GOM顆粒形成，除此之外，在TgNotch3R1031C轉(zhuǎn)基因小鼠中還觀察了到簇集素(clusterin)和內(nèi)皮抑素的聚集[34,36]。敲除小鼠盡管無明顯CADASIL表型，亦未觀察到血管中GOM顆粒的形成，但的敲除會影響血管的分化，包括血管平滑肌細胞的減少、血腦屏障滲漏、腦血管反應(yīng)性和肌源性緊張度的改變等，增加了小鼠發(fā)生缺血性卒中的風險，這也為Notch3在腦血管成熟和穩(wěn)態(tài)中起重要作用提供了實驗依據(jù)[29,30]。

2 CADASIL的藥物治療

目前仍缺乏對CADASIL的特效治療藥物，其治療以對癥治療為主，同時輔以必要的預防措施[38]。

缺血性卒中的治療可依據(jù)常規(guī)的治療方案進行。抗血小板藥物可以用于反復發(fā)生卒中的患者，但當患者腦部已有大量微出血時，應(yīng)慎重選擇抗血小板藥物或抗凝藥物以免加重腦出血現(xiàn)象。鹽酸洛美嗪是治療偏頭痛的藥物，但2020年的一項研究結(jié)果提示該藥還能有效預防繼發(fā)性卒中[39]。除此之外，靜脈注射組織型纖溶酶原激活劑(intravenous tissue plasminogen activator，IV tPA)也被嘗試用于治療CADASIL患者急性卒中發(fā)作，但因有證據(jù)表明該藥增加了CADASIL患者腦出血的風險，其安全性仍存在爭議[40]。

CADASIL患者偏頭痛的治療與一般偏頭痛一致，乙酰唑胺對偏頭痛有一定療效，但應(yīng)盡量避免使用曲普坦類和麥角類血管收縮性藥物。

常規(guī)治療認知損傷的藥物目前也被用于治療CADASIL患者的認知障礙，但研究表明多奈哌齊對CADASIL患者的血管性癡呆量表評分無明顯改善，僅對一些認知執(zhí)行次要指標有一定效果[41]。

大多數(shù)用于非心源性栓塞的預防措施都可以用于CADASIL患者，控制高血壓等腦血管病的危險因素可減緩疾病進展。

3 潛在治療方案研究

3.1 生長因子療法

干細胞因子(stem cell factor，SCF)和粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是血細胞生成、骨髓干細胞存活及動員所必需的造血生長因子。為探究SCF和G-CSF是否對CADASIL小鼠具有神經(jīng)保護和修復作用，研究者對TgNotch3R90C轉(zhuǎn)基因小鼠反復皮下注射SCF和G-CSF，免疫熒光結(jié)果顯示小鼠小動脈血管平滑肌的退化減輕，細胞凋亡減少，內(nèi)皮細胞損失被抑制，腦血管密度增加，水迷宮實驗顯示小鼠認知功能明顯改善。在體外模型中，SCF聯(lián)合G-CSF能夠通過抑制AKT信號通路和Caspase-3活性來減少血管平滑肌細胞凋亡[42]。之后，該研究小組通過骨髓移植示蹤骨髓源性細胞和共聚焦成像的方法，觀察到TgNotch3R90C轉(zhuǎn)基因小鼠的腦小血管和毛細血管中血栓形成，血栓內(nèi)部及周圍可見變性血管內(nèi)皮細胞，在血栓形成區(qū)域及鄰近區(qū)域可見IgG外滲，而SCF聯(lián)合G-CSF干預能夠顯著減少毛細血管血栓形成和IgG外滲。進一步給9月齡和10月齡小鼠皮下注射SCF和G-CSF，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)水平顯著上調(diào)，促進了神經(jīng)元結(jié)構(gòu)再生，腦血管單元得到恢復。而使用VEGF-A的血管生成抑制劑阿瓦斯汀(avastin)預處理小鼠后，則完全阻礙了SCF聯(lián)合G-CSF發(fā)揮作用[43]。該研究圍繞SCF和G-CSF的作用效果和治療機制展開，為CADASIL的生長因子療法提供了新視角(圖2A)。

3.2 免疫療法

2017年，Machuca-Parra等[16]在敲除小鼠中觀察到血管壁細胞的損失。利用Cre-LoxP系統(tǒng)，他們在KO小鼠中實現(xiàn)了條件性表達野生型(wild type，WT)或C455R突變的人源基因，C455R突變位于Notch3配體結(jié)構(gòu)域，嚴重破壞了Notch3信號通路。他們發(fā)現(xiàn)，WT基因能夠減少壁細胞的損失和血管滲漏，但C455R突變的基因不能挽救以上表型，這提示NOTCH3信號通路對于血管壁細胞的覆蓋率起到重要作用。之前的研究表明，Notch3的激動劑A13抗體能夠使Notch3的負調(diào)控區(qū)域(包含Notch/Lin12重復)變得不穩(wěn)定，從而激活Notch3。因此，他們利用TgNotch3C455R小鼠模型進一步研究發(fā)現(xiàn)，使用A13能夠激活Notch3 C455R突變受體并啟動下游信號通路，使得小鼠血管壁細胞損失減少[16]。該研究表明Notch3激動劑抗體A13對攜帶配體結(jié)構(gòu)域突變的CADASIL患者具有潛在的治療作用(圖2B)。

2018年，Ghezali等[44]利用TgNotch3R169C轉(zhuǎn)基因小鼠探索5E1單克隆抗體的治療潛力，他們發(fā)現(xiàn)5E1能夠與該小鼠腦動脈和毛細血管中沉積的Notch3蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合。但長期注射5E1抗體后，Notch3和GOM顆粒并沒有顯著減少，亦未阻止腦白質(zhì)的進一步損害。5E1抗體無法清除GOM沉顆?？赡芘c小鼠小膠質(zhì)細胞功能喪失有關(guān)。盡管如此，此治療方案改善了腦血流對血管擴張劑的反應(yīng)性，并使動脈肌源性緊張度正?；?，從而發(fā)揮保護腦血管的功能(圖2B)。

2022年，Oliveira等[45]對TgN3R182C150轉(zhuǎn)基因小鼠進行了主動免疫治療，自小鼠3月齡起，每2周向小鼠注射WT EGFR1～5和R133C EGFR1～5混合物，至7月齡止。結(jié)果顯示，實驗組小鼠大腦毛細血管的Notch3沉積明顯減少約38%～48%，小膠質(zhì)細胞激活增加，血清中Notch3胞外結(jié)構(gòu)域水平下降。此外，主動免疫療法未影響小鼠體重、行為、血管平滑肌細胞的數(shù)量和完整性、神經(jīng)元存活率。該研究首次在小鼠模型中成功減少了Notch3的聚集，為后續(xù)的臨床應(yīng)用提供了支撐(圖2B)。

近年來，人們利用CADASIL疾病小鼠模型檢驗了多種免疫療法的效果，這些療法旨在清除Notch3蛋白沉積或激活Notch3信號通路，部分減輕了疾病小鼠模型的癥狀，顯示了免疫療法的治療潛力。對于被動療法，研究者未來還需將抗體跨越血腦屏障的能力納入考慮；對于主動療法，應(yīng)繼續(xù)探索其安全性以及在老年小鼠中的長期療效。因此，CADASIL的免疫療法仍有待進一步完善。

3.3 基因療法

由于Notch3毒性聚集體的產(chǎn)生來源于單個EGFR中半胱氨酸數(shù)量的改變，有研究者提出如下假說：去除含有突變的EGFR可以減輕Notch3的聚集。為了驗證這個假說，Rutten等[46]將反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)外顯子跳躍技術(shù)應(yīng)用于CADASIL的治療研究。ASO是一類設(shè)計合成的小RNA或DNA，能夠與特定的mRNA前體配對，以調(diào)控mRNA前體的剪切或翻譯。ASO技術(shù)在多種遺傳病的臨床試驗中都表現(xiàn)出良好的效果，例如杜氏肌營養(yǎng)不良和脊髓性肌萎縮等。在調(diào)控剪切時，ASO與靶向的外顯子特異性結(jié)合，使得該外顯子無法與剪切原件正確結(jié)合，與兩端的內(nèi)含子一起被切除，最終無法進入成熟的mRNA中。

Rutten等[46]的研究基于以下假設(shè)：由于Notch3含有34個EGFR，外顯子跳躍導致1個或2個EGFR的缺失并不影響Notch3細胞外結(jié)構(gòu)域的功能。因此，根據(jù)以下原則以及軟件預測結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)2～24號外顯子中有18個外顯子可以被跳躍：(1)外顯子跳躍后編碼區(qū)不發(fā)生移碼；(2)外顯子跳躍后形成新的EGFR符合保守序列特征(含有6個半胱氨酸殘基且空間位置正確)。研究人員選擇了高加索人群的外顯子(第2～6號外顯子)突變熱點進行實驗，他們首先構(gòu)建了模擬外顯子跳躍的cDNA，通過在HEK293T細胞和患者來源的成纖維細胞中進行了蛋白表達量、細胞定位、配體結(jié)合等功能實驗驗證，確認了經(jīng)外顯子跳躍后的受體能夠正確表達定位并正常發(fā)揮其在Notch3信號通路中的功能。接著，他們在患者來源的成纖維細胞和血管平滑肌細胞中轉(zhuǎn)染了單條或多條ASO，經(jīng)RT-PCR和qPCR驗證，含有突變的外顯子被成功跳躍且沒有影響Notch3下游蛋白的表達。該研究為CADASIL的治療提供了新思路(圖2C)。

圖2 CADASIL潛在治療方案

A：生長因子療法；B：免疫療法；C：基因療法。

2020年，該研究小組又報道了1例自然發(fā)生的9號外顯子跳躍病例[47]。該患者攜帶c.1492G>T (p.Gly498Cys)雜合突變，提取患者成纖維細胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄后進行Sanger測序，發(fā)現(xiàn)含有突變的等位基因的轉(zhuǎn)錄本大多缺失了9號外顯子。該患者臨床癥狀相比于其他CADASIL患者輕，皮膚活檢的電鏡結(jié)果顯示，其血管壁附近的Notch3聚集體也較少。這項研究為CADASIL外顯子跳躍療法的有效性第一次提供了患者體內(nèi)證據(jù)。接著，他們在平滑肌細胞和NIH 3T3細胞系中轉(zhuǎn)染了9號外顯子缺失的cDNA，發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白能夠正確于定位于細胞表面，但由于9號外顯子編碼的部分EGFR 11參與Notch3配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(EGFR 10和11)的組成，9號外顯子缺失的Notch3蛋白信號轉(zhuǎn)導功能減弱。最后，他們在患者來源的血管平滑肌細胞中轉(zhuǎn)染了靶向9號外顯子的ASO，并成功實現(xiàn)了9號外顯子的跳躍。雖然這些工作僅在細胞水平上進行，但仍為CADASIL的基因療法提供了新視角。隨著基因編輯治療的發(fā)展[48]，利用CRISPR-Cas9等基因編輯技術(shù)校正突變來治療CADASIL也是未來的發(fā)展方向之一。

4 結(jié)語與展望

自CADASIL的致病基因被鑒定以來，大量CADASIL病例被報道，對于該疾病的機制研究也不斷深入?，F(xiàn)有機制研究結(jié)果表明，Notch3突變蛋白能夠聚集于血管壁細胞表面，并和細胞外基質(zhì)蛋白形成GOM，通過影響血管平滑肌信號通路、細胞骨架、膜離子通道及其他血管神經(jīng)單元結(jié)構(gòu)，損傷腦小血管的結(jié)構(gòu)和功能。

目前臨床上用于CADASIL患者的藥物均為對癥治療藥物，主要用于緩解偏頭痛、治療腦卒中、減輕認知功能損傷等。此外，通過控制血壓、戒煙等方式可以在一定程度上起到預防作用，但迄今仍缺乏有效治療CADASIL的藥物。

基于CADASIL機制研究的進展，近些年來對于CADASIL的生長因子療法、免疫療法和基因療法的研究逐漸深入。生長因子療法通過聯(lián)合補充SCF和G-CSF，改善了血管平滑肌及其他血管神經(jīng)單元的功能。免疫療法使用靶向Notch3蛋白不同結(jié)構(gòu)域的抗體，介導Notch3突變蛋白的清除或激活NOTCH信號通路，以改善腦血管反應(yīng)性?；虔煼ㄍㄟ^ASO介導外顯子跳躍，以獲得不含突變且能正常發(fā)揮功能的Notch3蛋白。不少研究具有重要的臨床應(yīng)用價值。

未來，仍需繼續(xù)深入研究CADASIL的發(fā)病機制，包括Notch3蛋白沉積的原因、血管平滑肌細胞結(jié)構(gòu)和功能異常的機制等。同時進一步探索CADASIL的治療方案，例如，可探索不同生長因子組合療法以更好地改善血管神經(jīng)單元功能，也可生產(chǎn)靶向Notch3不同結(jié)構(gòu)域的抗體以提高Notch3突變體的清除率。此外，CADASIL作為一種單基因遺傳病，基因治療的研究前景也十分廣闊，例如，可設(shè)計靶向突變mRNA的ASO，誘導此mRNA的降解，減少突變蛋白的生成，也可使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)直接修正致病突變。

總之，應(yīng)繼續(xù)推進CADASIL發(fā)病機制研究，完善目前已有的潛在治療方案，促進CADASIL特異性治療方案的研發(fā)，為患者提供更多有效的治療選擇。

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Pathogenesis and therapeutic advances of cerebral autosomal- dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy

Yi Zhang, Zhi-Ying Wu

Cerebral autosomal-dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy (CADASIL) is the most common hereditary cerebral small vessel disease in adults. Many CADASIL cases were reported afterwas identified as the causative gene of CADASIL. However, there is still no specific and effective therapies for CADASIL. In this review, we summarize recent research progress on disease models, symptomatic treatments and potential therapies for CADASIL, thereby providing a reference for follow-up CADASIL treatment research.

CADASIL; pathogenesis; therapeutic advances

2023-02-01;

2023-04-27;

2023-05-09

張翌，在讀博士研究生，專業(yè)方向：神經(jīng)遺傳病。E-mail: zhangyi_@zju.edu.cn

吳志英，博士，主任醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)遺傳病和變性病。E-mail: zhiyingwu@zju.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-023

(責任編委: 夏昆)