胡江博 任正鵬， 丁翔， 王朝全 馮陽， 王笑見 張翔 胥南飛，*

（1 四川天豫興禾生物科技有限公司，成都610031；2 合肥豐樂種業(yè)股份有限公司，合肥231283；第一作者：jbhu@gevoto；*通訊作者:nfxu@gevoto.com）

水稻是我國三大主糧之一，年平均種植面積約3 000 萬hm2，總產(chǎn)量約21 000 萬t，水稻穩(wěn)產(chǎn)對我國糧食供應(yīng)和社會穩(wěn)定發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。由于雜草與水稻共生時間長，嚴(yán)重影響水稻生長，我國每年因雜草危害直接導(dǎo)致的稻谷損失約占15%～20%，雜草防控已成為水稻種植中的主要勞作之一。近年來，隨著輕簡化栽培技術(shù)快速發(fā)展，迫切需要更加有效的雜草防控措施[2]。除草劑是目前最有效、最經(jīng)濟(jì)的除草手段，能有效防控雜草和提高水稻產(chǎn)量。在我國水稻生產(chǎn)中，需在多個時期噴施除草劑，共需10 余種除草劑疊加使用，藥劑種類多、除草成本高，且不同除草劑對施用條件都有嚴(yán)格限制，已無法滿足水稻輕簡高效綠色種植的需求。

現(xiàn)階段，能有效解決稻田雜草的辦法主要有2 種：持續(xù)開發(fā)具有新作用機(jī)制的除草劑輪換使用和創(chuàng)制抗除草劑水稻新品種。但隨著開發(fā)新型除草劑越來越困難，培育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗除草劑水稻新種質(zhì)，從而擴(kuò)大其配套除草劑的應(yīng)用范圍就顯得尤為重要。隨著我國水稻耕作方式的改變，迫切需要深入挖掘水稻自身除草劑抗性新基因、探尋除草劑生物育種新途徑、培育抗除草劑水稻新種質(zhì)[3]。

1 稻田常見雜草及其發(fā)生規(guī)律

據(jù)統(tǒng)計，我國稻田雜草有200 多種，比較常見、危害較重的約40 種。我國水稻種植過程中，除草劑開支的80%以上用于防除稗草和千金子[4]。其中，稗草是水稻田排名第一的惡性雜草，危害面積約占播種面積的40%。另外，雜草稻是直播稻田除稗草、千金子外第三大抗性雜草，具有生長速度快、繁殖能力強、常規(guī)除草技術(shù)難以防除等特點，導(dǎo)致其快速泛濫[5]。近年來，雜草問題已成為抑制水稻正常生長、影響農(nóng)戶種植積極性的重要因素[6]。

稻田雜草的萌發(fā)高峰期大致分為3 個階段，播種或移栽后7～10 d 出現(xiàn)第1 個出草高峰，約占雜草發(fā)生總量的45%～70%[7]；播種或移栽后20 d 為第2 次萌發(fā)高峰，以莎草科和闊葉雜草為主；第3 次出草峰值出現(xiàn)在播種或移栽后20～30 d，一般以闊葉雜草為主。

2 不同水稻種植模式雜草控制措施

隨著農(nóng)村勞動力年齡結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，現(xiàn)在種田的多為中老年人，已難以承受育秧、移栽等繁重的田間勞作；同時，隨著人力成本不斷上升，迫使種植戶越來越多選擇直播稻等輕簡化種植模式。但雜草問題極大限制了直播技術(shù)的大規(guī)模推廣和應(yīng)用，迫切需要更有效的雜草防控措施。不同水稻種植模式下的雜草發(fā)生規(guī)律和相應(yīng)除草策略不同[8]。

2.1 直播稻田雜草控制措施

直播是水稻生產(chǎn)實現(xiàn)規(guī)?；C(jī)械化、集約化的重要技術(shù)。但直播田雜草先于水稻萌發(fā)，二者共生時間長，除草難度大，極大限制了直播稻發(fā)展[9]。直播田一般使用“一封、二殺、三補”的雜草防控策略，“一封”是在播后、苗前選用2～3 種除草譜廣的除草劑進(jìn)行土壤封閉殺草；“二殺”是在水稻3 葉期，選用多種苗后選擇性除草劑進(jìn)行除草；“三補”是在播后30 d 對抗性雜草進(jìn)行針對性補防[10]。

2.2 移栽田雜草控制措施

移栽田秧苗較大，稻根入土較深，抗藥性較強；同時，氣溫適宜、雜草發(fā)生種類多。移栽田多采用“狠抓前期，挑治中、后期”的除草策略，移栽前先用2～3 種除草劑進(jìn)行封閉，施藥后2～5 d 插秧；移栽后5～10 d，用多種除草劑對大部分雜草進(jìn)行防除，用藥后需保水1 周；在分蘗期按實際情況用選擇性除草劑補防1～2 次[11]。

3 稻田常用除草劑及應(yīng)用現(xiàn)狀

3.1 選擇性除草劑應(yīng)用現(xiàn)狀及待解決問題

本節(jié)選擇了在水稻種植中使用量大且除草效果較好的幾種選擇性除草劑[12]和常用的滅生性除草劑，分析、比較了不同除草劑在水稻田中的除草優(yōu)勢和不足（表1）。

表1 水稻田常用除草劑優(yōu)缺點分析

由于除草劑長期不合理使用，近年來雜草群落演替加快、抗性雜草蔓延迅速、雜草數(shù)量呈直線上升趨勢。2021年全國農(nóng)業(yè)有害生物抗藥性監(jiān)測報告顯示，稗草和千金子對氰氟草酯的抗性頻率分別超過65.4%和78.3%；稗草對五氟磺草胺抗性頻率已超過76.8%，且五氟磺草胺對千金子無效[13]；在我國某些地區(qū)稗草對丁草胺的抗性已超過70.0%[14]；稗草對二氯喹啉酸抗性頻率已超過91.5%[15]。

截止2019年，全球已有255 種雜草的496 個雜草生物型對除草劑產(chǎn)生抗性，其中對ALS 抑制劑產(chǎn)生抗性的達(dá)到160 個雜草生物型，約占總數(shù)的1/3[16]，詳細(xì)數(shù)據(jù)可參考圖1[17]。另外，光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑和ACCase 類抑制劑由于抗性位點單一，抗性雜草的發(fā)展速度非常迅猛（C2、C2、C5 和A 組）。草甘膦抗性雜草近幾年在全球發(fā)展較快（G 組），但由于過去20 多年草甘膦在轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物上使用量巨大，同時考慮到抗性衰減及可能存在的抗性漂移等因素，整體而言其抗性雜草發(fā)展相對較慢，抗性發(fā)展趨勢處于穩(wěn)定范圍。草銨膦和三酮類除草劑（F2 組）抗性雜草的發(fā)展速度相對緩慢，抗性風(fēng)險較低[17]。

圖1 不同作用機(jī)理除草劑抗性雜草的發(fā)展趨勢圖[17]

另外，除草劑的殘留問題一直未得到人們足夠的重視，除草劑使用不當(dāng)容易在土壤和水體中殘留，不僅影響當(dāng)季作物，還會嚴(yán)重影響后茬作物。馮莉等[18]研究了5 種稻田常用除草劑對后茬馬鈴薯的影響，發(fā)現(xiàn)噁唑酰草胺、雙草醚、五氟磺草胺、芐嘧磺隆、二氯喹啉酸對馬鈴薯的抑制程度依次由低到高，雙草醚在推薦劑量可對馬鈴薯產(chǎn)生藥害，二氯喹啉酸在推薦劑量的1/15～1/20 即對馬鈴薯地上生長抑制率達(dá)50%。王子臣[19]等試驗了3 種稻田常用除草劑在水體殘留對大藻生長的影響，其中芐嘧磺隆可導(dǎo)致大藻大量死亡，2 甲4 氯鈉和丁草胺亦均會對大藻生長產(chǎn)生一定抑制作用。王新等[20]研究了咪唑啉酮類除草劑殘留對后茬作物影響，發(fā)現(xiàn)咪唑乙煙酸雖然使用當(dāng)年可降解96%，但剩余部分會在土壤中長期殘留，對后茬作物造成藥害，其低劑量即可抑制后茬油菜株高，較高劑量殘留會導(dǎo)致油菜全部死亡。

其次，在環(huán)境中殘留期長的除草劑對動物、生活用水等有多大影響？雖然目前很少有這方面的研究報道，但這是我們不應(yīng)該忽視的問題。

3.2 廣譜型除草劑應(yīng)用范圍及除草優(yōu)勢

草銨膦和草甘膦屬于廣譜型除草劑，與咪唑啉酮類除草劑相比，具有殘留期短、不易產(chǎn)生抗藥性、對環(huán)境友好、價格低廉等優(yōu)點。有數(shù)據(jù)顯示，草甘膦、草銨膦和硝磺草酮在全球除草劑銷量排行榜位居前三[21]。由此可見，除草劑正朝著高效、低毒、無殘留、殺草譜廣和環(huán)境友好型的方向發(fā)展。

3.2.1 草甘膦

內(nèi)吸型滅生性除草劑，通過抑制植物體烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶EPSPS，影響莽草酸向芳香族氨基酸的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致其蛋白質(zhì)合成受阻。草甘膦可防除40 余科、130 多種植物，在植物體內(nèi)和分蘗間皆可傳導(dǎo)，并由地上組織傳導(dǎo)至根部。草甘膦使用后7 d 見效，無殘留，不影響后茬作物和土壤結(jié)構(gòu)，對地下水無污染，對環(huán)境友好，用藥后7～10 d 即可播種、移栽[22]。獨特的除草機(jī)制、優(yōu)異的除草效果、安全性高及能在轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物上使用，促使其成為全球用量最大的除草劑[23]。

3.2.2 草銨膦

觸殺型滅生性除草劑，通過抑制植物氮代謝途徑中谷氨酰胺合成酶GS，干擾植物正常代謝致死。草銨膦能快速殺死絕大多數(shù)雜草。草銨膦噴施后3 d 即可殺死雜草，使用4 d 后即可播種移栽，對土壤、作物根系和后茬無影響，持效期較長，在土壤中易降解，對作物安全，不易飄移。生產(chǎn)中應(yīng)用草銨膦具有除草活性高、廣譜、低毒、對環(huán)境友好等優(yōu)點。

3.2.3 三酮類除草劑

通過抑制對羥基苯丙酮酸雙加氧酶HPPD，影響類胡蘿卜素合成，促使雜草的分生組織和新生器官出現(xiàn)白化癥狀而死；能高效防除闊葉雜草及部分禾本科雜草，具有良好的觸殺和內(nèi)吸作用。三酮類除草劑藥后3～7 d 見效，持效期較長，但不會影響后茬作物，藥后3 h 遇雨藥效不受影響。該類除草劑目前僅有4 例抗性雜草報道，非常適合抗性雜草的綜合治理[24]。

草甘膦和草銨膦不僅能防除絕大多數(shù)雜草，還能殺死與水稻親緣關(guān)系相近的雜草稻。三酮類除草劑能很好地彌補草甘膦、草銨膦的局限和不足，形成完善的雜草防控體系。但由于常規(guī)水稻均不含這三類除草劑的抗性基因，直接施用會對水稻產(chǎn)生同樣的毒害作用，該類除草劑目前還不能直接在水稻田大規(guī)模使用。因此，急需研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦、草銨膦和三酮類除草劑的水稻新種質(zhì)。

4 抗除草劑水稻育種研究進(jìn)展

近年來，不少研究團(tuán)隊利用自然變異、化學(xué)誘變、轉(zhuǎn)基因、基因編輯和自優(yōu)育種等技術(shù)，針對不同類型除草劑標(biāo)靶基因進(jìn)行深入研究，創(chuàng)制了一系列抗除草劑水稻新種質(zhì)。

4.1 內(nèi)源基因改良抗除草劑水稻

4.1.1 通過大規(guī)模水稻品種篩選發(fā)掘自然變異抗性材料

2018年，王芳權(quán)等[25]通過大規(guī)模咪唑乙煙酸抗性篩選，從7 000 多份水稻材料中篩選出1 個抗該除草劑的水稻材料Jinjing818。2020年，畢俊國等[26]通過除草劑抗性篩選，從30 570 份水稻資源中挖掘出1 份抗咪唑啉酮類除草劑的水稻新種質(zhì)。

4.1.2 通過化學(xué)誘變創(chuàng)制具有不同除草劑抗性的水稻突變體

2012年，陳竹鋒等[27]利用EMS 誘變秈稻品種黃華占，篩選獲得一批抗咪唑啉酮類突變體。2018年，張保龍團(tuán)隊[28]利用EMS 誘變粳稻品種Zhennuo19，獲得1 個抗ACCase 類除草劑的突變體材料。該團(tuán)隊還利用EMS 誘變Zhendao18 等粳稻品種，篩選出多個抗咪唑啉酮的水稻新種質(zhì)[29]。

4.1.3 通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對水稻內(nèi)源基因進(jìn)行定點編輯

2016年，LI 等[30]利用基因編輯技術(shù)對水稻內(nèi)源基因OsEPSPS 的TIPS 位點進(jìn)行定點替換，獲得了抗草甘膦的水稻新種質(zhì)。2015年，SUN 等[31]利用該技術(shù)在粳稻品種日本晴中定點突變OsALS 基因，獲得的株系對雙草醚具有良好抗性。2020年，WANG 等[32]同樣利用該技術(shù)在南粳9108 中定點突變OsALS 基因，獲得抗咪唑啉酮類除草劑的水稻新種質(zhì)。

4.1.4 通過自身基因優(yōu)化育種培育抗除草劑水稻

2016年，為解決抗除草劑“基因挖掘難”和“突變不定向”等技術(shù)難題，四川天豫興禾生物科技有限公司從作物基因組中尋找除草劑靶標(biāo)基因進(jìn)行深入研究，獨創(chuàng)多個抗除草劑基因定向進(jìn)化方法[33-34]，利用該技術(shù)對靶標(biāo)基因具有突變速度快、精準(zhǔn)度好、篩選效率高的特點，成功創(chuàng)制出一批抗草甘膦和抗草銨膦的植物內(nèi)源突變基因[35-38]，形象稱之為“基因超進(jìn)化”系統(tǒng)。

同時，為了不引入外源基因及轉(zhuǎn)基因成分，根據(jù)上述突變基因的專利信息，利用PCR 技術(shù)重新對水稻OsEPSPS 野生型基因進(jìn)行精準(zhǔn)突變，突變后的OsEPSPS 基因片段，不含任何非必要突變和外源序列，未進(jìn)行基因重組。將突變后的OsEPSPS 基因片段通過基因槍精準(zhǔn)雜交到水稻品種中，獲得無載體系統(tǒng)不含外源基因片段的抗草甘膦水稻新種質(zhì)，該試驗過程稱為“自身基因優(yōu)化育種”（簡稱自優(yōu)育種）。由“基因超進(jìn)化”創(chuàng)制的突變基因?qū)Σ莞熟⒌哪褪苄猿^田間推薦劑量20 倍，同時對其他農(nóng)藝性狀無不良影響，具有很大的商業(yè)化推廣價值[39]。

4.2 導(dǎo)入外源基因獲得抗除草劑水稻新品種

2014年，王云鵬等[40]通過其建立的草甘膦污染土壤宏基因組文庫克隆出1 個高抗草甘膦的soil EPSPS基因，將該基因轉(zhuǎn)入粳稻品種Jinongda878，獲得轉(zhuǎn)基因抗草甘膦的水稻新種質(zhì)。2015年，梅鋒[41]將抗蟲基因HJC-1 和抗草甘膦基因G6-EPSPS 同時導(dǎo)入秀水110，獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲耐草甘膦水稻新種質(zhì)G6H1。2017年，DONG 等[42]將來自熒光假單胞菌的G2-EPSPS 轉(zhuǎn)入中花11，獲得轉(zhuǎn)基因的抗除草劑水稻新種質(zhì)。

2013年，翁綠水等[43]將抗蟲基因Cry2Aa# 和抗草銨膦基因Bar 同時轉(zhuǎn)入水稻恢復(fù)系D68，培育出抗蟲、耐草銨膦轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系B2A68。2016年，徐海英等[44-45]將來自不同細(xì)菌的基因Pa-HPPD、Pp-HPPD 和Ct2-HPPD 同時導(dǎo)入水稻材料，獲得多個抗異噁唑草酮水稻新種質(zhì)。2005年，KAWAHIGASHI 等[46]將3 個細(xì)胞色素P450 家族基因CYP1A1、CYP2B6 和CYP2C19 分別導(dǎo)入日本晴，獲得抗不同類型除草劑的轉(zhuǎn)基因株系。2012年，沈志成團(tuán)隊[47]從狗牙根中克隆了1 個細(xì)胞色素P450 基因N-Z1，并將其導(dǎo)入秀水134，獲得分別抗煙嘧磺隆和硝磺草酮的轉(zhuǎn)基因植株。

4.3 內(nèi)源基因改良抗除草劑水稻應(yīng)用潛力

草甘膦作為全球應(yīng)用最廣泛的除草劑，其巨大的市場價值使得抗草甘膦基因挖掘成為各國農(nóng)業(yè)生物技術(shù)公司競爭和布局的焦點。岳榮生等[48]披露了全球抗草甘膦基因?qū)＠纳暾埱闆r。截至2020年10 月，我國抗草甘膦基因?qū)＠偭颗琶虻诙?，其中中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、四川天豫興禾生物科技有限公司和先正達(dá)集團(tuán)分列全球第七、八、十位，具體專利數(shù)據(jù)詳見表2。目前，國內(nèi)外其他申請人在抗草甘膦基因核心專利中披露的基因均來自微生物，而四川天豫興禾生物科技有限公司通過專利技術(shù)，獲得了一大批具有自主知識產(chǎn)權(quán)的植物內(nèi)源抗草甘膦突變基因，未來具有較大的發(fā)展?jié)摿褪袌龈偁巸?yōu)勢。

表2 抗草甘膦基因?qū)＠攸c申請機(jī)構(gòu)情況[49]

四川天豫興禾生物科技有限公司研發(fā)的“基因超進(jìn)化”系統(tǒng)，能快速創(chuàng)制植物內(nèi)源抗除草劑基因，解決了滅生性除草劑作物內(nèi)源抗性基因缺失的難題[49]。該作物內(nèi)源突變基因通過自優(yōu)育種技術(shù)培育出多個抗草甘膦水稻新種質(zhì)。同時，還能利用基因編輯系統(tǒng)對這些植物內(nèi)源突變基因進(jìn)行定點編輯，創(chuàng)制基因編輯抗除草劑作物，或利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)開發(fā)相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。自優(yōu)育種抗草甘膦水稻的成功創(chuàng)制，能顯著拓寬滅生性除草劑在稻田中的使用范圍，不僅能降低水稻除草成本，還可顯著降低除草劑用量。經(jīng)測算，每667 m2田至少能節(jié)本增收100～200 元（減少除草成本、人工成本、田間管理成本，以及提高品質(zhì)增效等）。

5 討論與展望

農(nóng)田雜草嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量，間接影響稻米品質(zhì)，增加農(nóng)民生產(chǎn)成本投入，影響水稻生產(chǎn)安全。

目前，水稻田常用除草方案均需多次施用不同類型的選擇性除草劑，雖然緩解了部分雜草的危害，但對抗性雜草的防效越來越差。種植戶為保證除草效果，經(jīng)常加大用藥劑量或重復(fù)噴藥，這樣不僅容易對水稻和后茬作物造成藥害，雜草的抗性也呈現(xiàn)普遍性發(fā)生和區(qū)域性暴發(fā)；同時，除草劑濫用也導(dǎo)致其殘留增加，引發(fā)農(nóng)產(chǎn)品的食品安全和生態(tài)環(huán)境污染問題。

由于傳統(tǒng)育種手段選育周期長、工作量大等問題，難以滿足日益豐富的育種目標(biāo)[50]。特別是水稻中對除草劑抗性基因的自然選擇難度較大，鮮有通過自然選擇獲得高抗除草劑水稻新品種的報道。

在抗除草劑水稻創(chuàng)制中，研究人員主要針對廣譜型除草劑的標(biāo)靶基因進(jìn)行研究。目前，應(yīng)用比較成功的主要包括抗草甘膦、草銨膦和咪唑啉酮類除草劑水稻。巴斯夫公司、深圳潔田模式生物科技有限公司和江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分別通過EMS 誘變，獲得了抗咪唑啉酮類除草劑水稻Clearfield、jietian1hao 和金粳818 等。金粳系列抗咪唑煙酸水稻在江蘇推廣面積已達(dá)到6.7 萬hm2以上，潔田系列水稻在安徽、江蘇、廣東都有小規(guī)模示范種植。由此可見，我國對于抗除草劑水稻的市場需求非常大。

抗咪唑啉酮類水稻無法規(guī)和政策限制，更易被大眾接受。但該類除草劑殘留期長，會對后茬敏感作物造成藥害。同時，隨著咪唑啉酮類除草劑大量使用，近年來抗性雜草數(shù)量激增，影響了咪唑啉酮類除草劑進(jìn)一步推廣[51]。抗草甘膦水稻和抗草銨膦水稻使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的抗性基因?qū)胨局?，抗草甘膦水稻雖獲得了安全證書，但由于其“轉(zhuǎn)基因身份”并未實際推廣。

CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)因操作方便、高效、高特異性和低成本等優(yōu)點，目前已成功創(chuàng)制多個抗除草劑水稻新種質(zhì)[52]。但要更好利用該編輯系統(tǒng)，還需要通過各種技術(shù)手段，挖掘更多優(yōu)良的植物內(nèi)源基因供該系統(tǒng)進(jìn)行編輯。

抗除草劑水稻中HPPD 抑制劑類抗性基因研究還比較少。因此，需要加強抗三酮類除草劑水稻的種質(zhì)創(chuàng)新。該類除草劑還未在我國水稻田大規(guī)模使用，與其他類型除草劑無復(fù)合抗性，三酮類除草劑與草甘膦、草銨膦配合使用，能安全、環(huán)保、完善解決抗性雜草問題。將這3 類除草劑與其對應(yīng)的3 種抗性水稻配套使用，可為稻田雜草防控提供完善的解決方案，每季種植不同類型的除草劑抗性水稻并搭配對應(yīng)的除草劑，在防控稻田雜草和抗性雜草的同時，完善解決農(nóng)藥殘留、食品安全和生態(tài)環(huán)境等諸多問題，有效促進(jìn)水稻直播技術(shù)的快速發(fā)展，在提高水稻生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)、社會、生態(tài)效益方面具有重要意義。