陳鵬，張冬龍，劉宇，林慶賓，劉俊寧，洪振強(qiáng)*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；2.中醫(yī)骨傷及運(yùn)動康復(fù)教育部重點(diǎn)實驗室，福建 福州 350122；3.廈門市集美街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，福建 廈門 361021）

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是由間質(zhì)細(xì)胞異?；罨錾鷮?dǎo)致的一種惡性骨腫瘤，近年來呈現(xiàn)出快速增長的趨勢，其轉(zhuǎn)移甚至致死率也大幅增加［1］。臨床上用于骨肉瘤的化療藥物很多，如甲氨喋呤、阿霉素、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺等［2］，其中大劑量甲氨蝶呤配合甲酰四氫葉酸（HD-MTX—CFR）解救是化療的重要方案之一［3］。該方案中，為了能達(dá)到較好的化療效果，甲氨蝶呤的用量較常規(guī)用量大十?dāng)?shù)倍甚至幾百倍，其不良反應(yīng)明顯，嚴(yán)重者導(dǎo)致患者死亡［4］。骨肉瘤的防治已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)亟待解決的問題之一，因此尋找安全有效的藥物對于該病的臨床治療具有積極意義。

近年來，運(yùn)用中藥復(fù)方治療骨肉瘤的報道十分常見，主要是因為這些復(fù)方在很大程度上可抑制化療藥物的毒副作用，同時對癌細(xì)胞本身具有良好的抑制作用［5］。八寶丹作為祖國醫(yī)學(xué)經(jīng)典名方，以其清熱解毒、活血止痛之功，在治療病毒性肝炎、前列腺炎、膽囊炎等方面發(fā)揮顯著療效［6-8］。在擴(kuò)大其臨床應(yīng)用的同時，八寶丹治療中、晚期癌癥也展現(xiàn)出良好的藥效價值［9］。大量研究表明，除八寶丹本身具有抑制癌細(xì)胞增殖的作用外，其作為癌癥治療的輔助用藥還具有增效減毒之功，在很大程度上提高患者的生存期［10-11］。然而，目前八寶丹治療骨肉瘤的作用機(jī)制仍不清楚，值得進(jìn)一步探討。

前期課題組已經(jīng)證實，U2OS細(xì)胞中ERK1/2的表達(dá)顯著上調(diào)［12］。而ERK1/2信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，尤其是在骨肉瘤中能夠作為細(xì)胞轉(zhuǎn)移的加速劑，推動骨肉瘤的惡化發(fā)展［13-14］。目前，多種針對該信號通路的激酶抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床研究［15］。ERK1/2信號通路的大致模式為：多種生長因子→Ras→Raf→MEK1/2→ERK1/2→細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂、分化［16-17］。骨肉瘤發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，并且針對八寶丹抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制研究報道較少，故本實驗以U2OS骨肉瘤細(xì)胞作為研究對象，通過觀察八寶丹抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡的具體作用機(jī)制與ERK1/2信號通路的關(guān)系，明確八寶丹抗骨肉瘤作用的部分作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 實驗細(xì)胞與藥物 U2OS細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。在完全培養(yǎng)液中（89% RPMI-1640培養(yǎng)基＋10%胎牛血清＋1%雙抗）進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并置于37 ℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，2～3 d換液傳代。八寶丹購自廈門中藥廠有限公司（批號：180901）。

1.2 實驗試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：11875119、10099141c；消化胰酶、青霉素/鏈霉素雙抗液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：c0202、030311b）；PBS緩沖液（美國Hyclone公司，批號：sh30256.01）；CCK8試劑盒（亞科因公司，批號：kta1020）；Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測試劑盒（艾博抗公司，批號：KTA0004）；CyclinD1（福州精銳生物公司，批號：ma139546）；MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2、GAPDH抗體（美國Abcam公司，批號：ab131517、ab17942、ab16573、ab97627）；二抗（美國Cell Signaling 公司，批號：7076）。

1.3 實驗儀器 恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱和酶標(biāo)檢測儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；電子顯微鏡（德國Leica公司）；ABI 7500 PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；化學(xué)發(fā)光成像儀（美國Bio-Rad Laboratories公司）。

2 實驗方法

2.1 八寶丹藥液配制 八寶丹充分溶解于PBS溶液，配制成20 mg/mL的藥液，使用超聲儀器助溶2 h，高壓滅菌待藥液徹底混勻后，將藥液分裝置于-20 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將U2OS細(xì)胞在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中使用完全培養(yǎng)液（89% RPMI-1640培養(yǎng)基＋10%胎牛血清＋1%雙抗）培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%以上即傳代接種，以0.2×105/mL的密度接種于96孔板。

2.3 分組干預(yù) 實驗分為對照組和八寶丹不同濃度組（BBD-0.5 mg/mL組、BBD-1.0 mg/mL組、BBD-1.5 mg/mL組），每組細(xì)胞均設(shè)置5個復(fù)孔，分別于0、24、48 h進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)分析。

2.4 CCK8法檢測八寶丹對U2OS細(xì)胞增殖的影響 八寶丹不同濃度組細(xì)胞分別于0、24、48 h加入CCK8溶液10 μL/孔，并繼續(xù)培養(yǎng)4 h后于450 nm波長的酶標(biāo)儀中檢測細(xì)胞OD值。以只加完全培養(yǎng)基的孔OD值作為空白對照，以0 h測定的細(xì)胞OD值作為對照組。

細(xì)胞增殖率＝（加藥組OD值－空白對照組OD值）/（對照組OD值－空白對照組OD值）×100%

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測八寶丹對U2OS細(xì)胞凋亡的影響 U2OS細(xì)胞以1×106/mL的密度接種于6孔板，待細(xì)胞已完全融合后，PBS清洗，每孔加入不含EDTA的胰酶消化，DMEM中和，離心，收集細(xì)胞沉淀。100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞后，加入5 μL Annexin V-AbFlourTM647和2 μL PI，室溫避光孵育后加入400 μL 1×Binding Buffer混勻，樣本保持放在冰上，30 min內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.6 qPCR法檢測八寶丹對U2OS細(xì)胞中Ras、Raf mRNA表達(dá)的影響 U2OS細(xì)胞以密度為0.8×105個/mL接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞，用Trizol法從細(xì)胞中提取總RNA。利用PrimeScript RT試劑盒從500 ng的RNA中生成cDNA。取2 μL的cDNA用ABI 7500 Fast Real-Time PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。qPCR的條件為：預(yù)變性（95 ℃ 10 min）、變性（95 ℃ 15 s）、退火和延伸（60 ℃60 s），共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)部對照。mRNA水平表示為：2-ΔΔCt（以Ct為周期閾值），其中ΔCt＝［Ct（Target gene）－Ct（GAPDH）］。引物序列Ras-F：AGTACGTGAGATTCGGCAGC；Ras-R：CACACACT TGCAGCTCATGCC。Raf-F：CCGTCCCGCTGAATACTA CC；Raf-R：ACTGACTGAATCGTGCCGTT。GAPDHF：ACAACTTTGGTATGGGAAGG；GAPDH-R：GCCA TCACGCCACAGTTTC。

2.7 Western blot法檢測八寶丹對U2OS細(xì)胞中ERK通路相關(guān)蛋白CyclinD、MEK1/2、p-ERK1/2、ERK1/2表達(dá)蛋白量的影響 將U2OS細(xì)胞以密度為0.8×105個/mL接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA定量法測定各組蛋白濃度，同時使用5×SDS蛋白變性后用于后續(xù)操作。使用SDS-PAGE電泳法進(jìn)行凝膠電泳，以蛋白量50 μg定量測定各組上樣體積，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，經(jīng)完全封閉液封閉1 h后加入一抗CyclinD1（1∶1 000）、MEK1/2（1∶500）、ERK/2（1∶1 000）、p-ERK/2（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）置于4 ℃冷凍室中孵育。隔夜后吸出一抗并洗凈條帶，采用相對應(yīng)的兔二抗（1∶10 000）繼續(xù)孵育2 h后，洗凈二抗后進(jìn)行顯影，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料服從正態(tài)分布以（）表示，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 八寶丹對U2OS細(xì)胞增殖的影響 使用0.5、1.0、1.5 mg/mL的八寶丹分別干預(yù)U2OS細(xì)胞。在干預(yù)24 h（A）和48 h（B）時，與對照組比較，不同濃度的八寶丹對U2OS細(xì)胞的增殖均有不同程度的抑制作用，且呈劑量依賴（P＜0.05）；其中干預(yù)48 h對細(xì)胞增殖的抑制作用更明顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 八寶丹對U2OS細(xì)胞增殖的影響

3.2 八寶丹對U2OS細(xì)胞凋亡的影響 與對照組比較，0.5、1.0、1.5 mg/mL的八寶丹干預(yù)均能顯著抑制U2OS細(xì)胞的凋亡（P＜0.05），見圖2。

圖2 BBD對U2OS細(xì)胞凋亡的影響

3.3 八寶丹對U2OS細(xì)胞中Ras、Raf mRNA表達(dá)水平的影響 與對照組比較，0.5、1.0、1.5 mg/mL劑量組的八寶丹均能顯著下調(diào)U2OS細(xì)胞中的Ras和Raf mRNA表達(dá)水平（P＜0.05），見圖3。

圖3 BBD對U2OS細(xì)胞中Ras、Raf mRNA表達(dá)水平的影響

3.4 八寶丹對U2OS細(xì)胞中ERK1/2通路上相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響 0.5、1.0、1.5 mg/mL的八寶丹均能下調(diào)CyclinD1、MEK1/2的蛋白表達(dá)量，同時降低p-ERK1/2與ERK1/2蛋白的比率（P＜0.05），見圖4。

圖4 BBD對ERK1/2通路上相關(guān)蛋白表達(dá)比較

4 討 論

骨肉瘤是嚴(yán)重影響青壯年身體健康的惡性腫瘤，在原發(fā)性骨惡性腫瘤中發(fā)病率最高，約占所有癌癥的0.3%，該病病情進(jìn)展迅速，惡性程度高［1］。目前臨床上主要以輔助化療和外科根治性手術(shù)為主要治療方法，使患者5年生存率有所提高［18］。然而，由于本病早期肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高，臨床上對于其轉(zhuǎn)移癌的療效則欠佳［19］。目前所采取的治療措施可以延長患者的生命，但骨肉瘤快速的增長率仍是導(dǎo)致患者生存率較低的主要原因之一，成為該疾病臨床亟須解決的一個棘手問題［20］。

八寶丹是中藥二級保護(hù)品種，不僅可以提高患者的免疫力，還對一些腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移能力有一定的影響［21］。然而，八寶丹對骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用和相關(guān)機(jī)制的報道較少。因此，本課題旨在從細(xì)胞層面觀察八寶丹抑制骨肉瘤的增殖、促進(jìn)其凋亡的作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。在觀察八寶丹抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的作用方面，選取了U2OS細(xì)胞株采用不同濃度的八寶丹對其進(jìn)行干預(yù)處理。研究發(fā)現(xiàn)八寶丹在低劑量0.5 mg/mL時即可對細(xì)胞產(chǎn)生生長抑制作用，這與之前報道的文獻(xiàn)結(jié)果相一致［21］。中、高劑量組的八寶丹在48 h抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖效果更為明顯。課題組進(jìn)一步探討了八寶丹對U2OS細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示八寶丹在抑制骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用方面效果顯著，且呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。由此可見，八寶丹可能是通過抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，同時促進(jìn)細(xì)胞凋亡的雙重作用，從而達(dá)到延緩骨肉瘤生長的目的。

課題組對八寶丹抗骨肉瘤細(xì)胞生長的機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的探討。ERK1/2信號通路是MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路家族的一條主要通路，在近年來的研究中，多種ERK1/2通路上的蛋白被發(fā)現(xiàn)［22］，這些蛋白的異?；罨虮磉_(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切關(guān)系。一方面ERK1/2通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分裂、增殖，而導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞的惡性增殖特質(zhì)，另一方面也可通過直接或間接的方式抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡［23］。目前，多種針對該信號通路的激酶抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段［24］，提示抑制ERK1/2信號通路對抑制腫瘤的生長極具意義?；罨腅RK1/2激酶移位到細(xì)胞核，其可激活或滅活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵效應(yīng)因子以及重要的轉(zhuǎn)錄因子，并能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)因子和凋亡因子的表達(dá)［25］。因此，本研究對ERK1/2信號通路關(guān)鍵的Ras和Raf基因進(jìn)行驗證。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/mL的八寶丹即可拮抗Ras和Raf基因的表達(dá)，1、1.5 mg/mL八寶丹的作用更加明顯，提示八寶丹在ERK1/2通路上游即具有一定的抑制效應(yīng)。Western blot結(jié)果進(jìn)一步表明八寶丹可以抑制ERK1/2通路上CyclinD1和MEK1/2蛋白的表達(dá)水平，并且降低ERK1/2與p-ERK1/2蛋白比率，提示八寶丹在抑制骨肉瘤生長時對ERK1/2信號通路具有顯著的抑制作用。

綜上，八寶丹抗骨肉瘤細(xì)胞生長的作用是通過抑制ERK1/2信號通路實現(xiàn)的，為后續(xù)八寶丹應(yīng)用于骨肉瘤治療的相關(guān)臨床研究提供實驗依據(jù)。