張 明 趙賢媚 易 榮 趙冰晶 張育勤 吳雪釵 劉林森 于波濤

中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科，四川成都 610083

扶正生血膠囊為中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院的臨床經(jīng)驗方，具有滋陰培陽、益腎健脾、扶正固本、補血益氣的功效。主要用于腫瘤放化療后的支持治療、白細胞減少、血小板減少、再生障礙性貧血、失血性貧血及其他不明原因引起的全血細胞減少癥，療效確切[1]?；⒄溶铡邹继J醇為本方的重要組分，在處方中發(fā)揮重要的藥理特性。本研究以虎杖苷、白藜蘆醇為制劑定量指標，并對其性狀、含量、水分等穩(wěn)定性因素進行探討，確保制劑工藝可靠、質(zhì)量穩(wěn)定、質(zhì)量檢測方法簡便可重復。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器

安捷倫高效液相儀（1200 series，安捷倫科技中國有限公司）；METTLER 十萬分之一電子分析天平（AB135-S，METTLER TOLEDO）；智能雙功效超聲波提取器（廣東固特超聲股份有限公司，功率210 W，頻率60 KHz）；恒溫水浴鍋（HH-824S 型，上海君竺儀器制造公司）；熱風干燥箱（201-2A 型，上海實驗儀器廠）；紫外分析儀（ZF-20D 型，上海翼輝科學分析儀器有限公司）；崩解時限檢查儀（ZB-1D 型，天津天光光學儀器廠）。

1.2 藥物及試劑

扶正生血膠囊由中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科制劑中心提供（批號：190729、190730、190731）；虎杖苷對照品（批號：111575-201603，20 mg/支，含量以87.3%計）、白藜蘆醇對照品（批號：111535-201703，20 mg/支，含量以99.4%計）購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 虎杖苷及白藜蘆醇含量測定

2.1 標準品溶液的制備

分別精密稱定虎杖苷4.22 mg、白藜蘆醇1.13 mg，加50%稀乙醇超聲定容于25 ml 棕色容量瓶中，得濃度為168.81 μg/ml 虎杖苷、45.23 μg/ml 白藜蘆醇的標準品溶液。

2.2 供試樣品溶液的制備

取扶正生血膠囊內(nèi)容物約1.0 g，精密稱取，加50%稀乙醇25 ml 于具塞瓶中，精密稱重，于超聲儀超聲33 min，至冷卻稱量，加50%稀乙醇添補失重，搖晃均勻，用注射器吸取適量上清液，微孔濾膜濾后取濾液作供試樣品溶液。

2.3 陰性樣品溶液的制備

按該處方稱取除虎杖外的剩余藥材，經(jīng)水煮、濃縮、混合、烘干、整粒等標準工藝制備并用“2.2”項下方法制作不含虎杖的陰性樣品溶液。

2.4 高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent YMC-Triart C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈∶水（25∶75）等度洗脫，洗脫時間為15 min；波長為312 nm，流速為1.1 ml/min，柱溫為27℃，進樣量為10 μl。理論塔板≥3 500，分離度≥2.0。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.5 標準曲線的制備

精密移取168.81、45.23 μg/ml 的虎杖苷、白藜蘆醇混合對照品溶液1、2、3、4、5、10 ml 于10 ml 容量瓶中，加入流動相定容，進注高效液相儀分析，峰面積為Y 軸，進樣量為X 軸，進行回歸分析?；貧w方程為虎杖苷：Y=115.20X+101.91（r=0.999 9）；白藜蘆醇：Y=2.75X+28.59（r=0.999 9）。提示虎杖苷、白藜蘆醇分別在16.81～168.81 μg/ml、4.52～45.23 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

2.6 精密度實驗

取已知濃度虎杖苷、白藜蘆醇對照品溶液10 μl，重復進注6 次，測得峰面積[2]，峰面積的RSD 值分別為0.37%、0.41%。

2.7 重復性實驗

按照“2.2”項下樣品溶液方法，平行制備6 份樣品（批號：190731）溶液，按“2.4”項下條件檢測峰面積并計算虎杖苷與白藜蘆醇的含量[3]?；⒄溶?、白藜蘆醇的RSD值分別為1.73%、2.16%。

2.8 穩(wěn)定性實驗

取“2.2”項下同一批次樣品（批號：190731）溶液8 ml，依次于0、2、4、8、12、24 h 取樣進注色譜儀，記錄峰面積[4]，虎杖苷、白藜蘆醇的峰面積RSD 值分別為0.69%、1.24%。

2.9 加樣回收率

取已知含量樣品（含虎杖苷、白藜蘆醇分別為0.556、0.136 mg/ml，批號：190729）適量，各9 份，每份約1.0 g，分別加入一定量虎杖苷、白藜蘆醇對照品溶液，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下條件檢測峰面積并計算虎杖苷與白藜蘆醇的含量，通過測得量與已知樣品含量、加入量進行數(shù)據(jù)分析，計算回收率[5]，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 加樣回收率實驗結果

2.10 樣品含量測定

取3 批次供試品，按照“2.2”項下方法制備，按“2.4”項下色譜條件測定，結果見表2。

表2 扶正生血膠囊中虎杖苷與白藜蘆醇的含量（n=3）

3 初步穩(wěn)定性考察

3.1 樣品的測試條件及封裝

取樣品（批號：190729）以上市標準鋁箔膜封裝，室溫保存并連續(xù)測試，測試時間24 個月。

3.2 方法

參照《中華人民共和國藥典》2020 版[6]膠囊劑穩(wěn)定性重點項目，重點考察其性狀、虎杖苷與白藜蘆醇含量、水分、崩解時限、裝量。

3.3 高溫、高濕、強光、加速、長期試驗

3.3.1 高溫穩(wěn)定性實驗 稱取樣品（批號：190729）約1.25 g，去包裝，放置容器中，溫度60℃，放置10 d，每間隔5 d，分取少許檢測，按“3.2”項下重點項目考察。結果見表3。

表3 高溫、高濕、光照穩(wěn)定性實驗結果

3.3.2 高濕穩(wěn)定性實驗 稱取樣品（批號：190729）約1.25 g，置恒濕容器中，溫度25℃，相對濕度（90±5）%，存放10 d，每間隔5 d，分取少許檢測，按“3.2”項下重點項目考察。結果見表3。

3.3.3 強光照穩(wěn)定性實驗 稱取樣品（批號：190729）約1.25 g，開口曝光，設置光照度為（4500±500）lX，存放10 d，在第0、5、10 天時分別取少量檢測，按“3.2”項下重點項目檢測。結果見表3。

3.4 加速穩(wěn)定性實驗

稱取樣品（批號：190729）約1.25 g，按成品封裝，溫度（40±2）℃、相對濕度（75±5）%，保存6 個月，第0、1、2、3、6 個月末取少許樣品測量，按“3.2”項下重點項目考察。結果見表4。

表4 扶正生血膠囊加速穩(wěn)定性實驗結果

3.5 長期穩(wěn)定性實驗

稱取樣品（批號：190729）約1.25 g，按成品包裝，溫度（25±2）℃、相對濕度（60±5）%，保存24 個月，第0、3、6、9、12、18、24 個月末取少許樣品測量，按“3.2”項下重點項目考察。結果見表5。

表5 扶正生血膠囊長期穩(wěn)定性實驗結果

3.6 結果

扶正生血膠囊24 個月考察結果表明，該品種在2 年內(nèi)考察指標穩(wěn)定，故其有效期暫定為2 年。

4 討論

扶正生血膠囊由補骨脂、陳皮、虎杖、甘草等中藥制成，在臨床應用多年，療效確切，該制劑中虎杖苷具有止咳、平喘、抗休克及抑制血小板聚集等作用[7-18]。白藜蘆醇具有抗氧化、抗自由基及抗癌等作用[19-25]。本研究以虎杖苷、白藜蘆醇為定量考察指標，并對藥品進行為期2 年的穩(wěn)定性考察。結果表示，方法精密度、重復性、穩(wěn)定性、回收率均符合要求，可用于扶正生血膠囊的質(zhì)量控制。同一產(chǎn)區(qū)虎杖受氣候、土壤等外界環(huán)境因素的影響較小，而在不同地區(qū)因水土、溫度、濕度等環(huán)境因素差異，虎杖中各有效成分含量占比有較大不同，筆者單位位于西南地區(qū)，參照張明等[26]考察西南5 個產(chǎn)區(qū)虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇含量，選用四川樂山產(chǎn)虎杖作為原料藥，以乙腈∶水（25∶75）洗脫分析該制劑，結果表明該洗脫劑簡單、穩(wěn)定、可重復。

扶正生血膠囊含有多種藥材，在樣品定量提取中，分別考慮了微波提取法、加熱回流提取法及超聲提取法等，各方法實驗結果表明，超聲提取法簡單、有效、提取效率高，故本制劑含量測定采用超聲提取法。對等分別考察后，根據(jù)測定成分的峰面積確定了提取溶劑的種類、用量和提取時間最優(yōu)提取條件，即用50%乙醇25 ml，超聲提取33 min。含量測定考察過程中發(fā)現(xiàn)，高效液相色譜圖中基線不平，懷疑色譜柱柱溫在30℃時有漂移不穩(wěn)定現(xiàn)象，逐步將柱溫降至27℃，基本消除基線漂移不穩(wěn)定等情況，故將柱溫設定為27℃。穩(wěn)定性考察過程中，由于考察項目多，用時長，故本研究從3 個批次中選擇了1 個批次進行研究，但本研究存在項目不全，未全批次檢查的情況，后續(xù)研究中能夠更加全面、深入、細致地研究該膠囊穩(wěn)定性。