李 昕,馬紅霞,史艷馨

(烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830000)

早發(fā)性卵巢功能不全為臨床中常見的婦科疾病,以繼發(fā)性不孕、閉經(jīng)為主要臨床特征,嚴重影響患者的生活質量［1］。該病發(fā)病機制尚不明確,臨床治療手段有限。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶-1(PI3K/Akt/Nrf2/HO-1)通路是近年來發(fā)現(xiàn)的與早發(fā)性卵巢功能不全相關的重要信號通路,Chen等［2］研究表明調節(jié)Nrf2/HO-1通路能夠促進小鼠卵巢功能損傷恢復,Dou等［3］研究表明調節(jié)PI3K/Akt通路能夠促進大鼠卵巢組織損傷恢復,由此可見調節(jié)PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路可能是治療早發(fā)性卵巢功能不全的關鍵途徑。護巢飲是基于中醫(yī)學理論基礎組成的中藥制劑,前期研究表明護巢飲能夠顯著調節(jié)早發(fā)性卵巢功能不全患者激素水平,改善患者倦怠乏力、腰膝酸軟等癥狀［4］,但其作用機制尚不清楚。本實驗基于PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路,探討了護巢飲對于早發(fā)性卵巢功能不全大鼠的干預作用及機制,為該方藥的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SD雌性大鼠72只,6～8周齡,體重200～220 g,購于新疆醫(yī)科大學實驗動物中心,實驗動物許可證號:SCXK(新)2018-0002。動物房溫度20～25 ℃,自由飲食水,自然光照,12 h/12 h晝夜交替,相對濕度40%～70%。

1.2設備及儀器 3-18KS離心機(德國Sigma公司);E-Gel Imager凝膠成像儀(賽默飛世爾科技有限公司);DM IRB熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司);DYY-16D電泳儀(北京六一生物科技有限公司);S700石蠟切片機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);MY-10組織勻漿器(上海研卉生物科技有限公司);T100梯度PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3藥品與試劑 護巢飲由黃芪(批號:191011)30 g、鹿角(批號:190806)12 g、當歸(批號:190929)10 g、炒白術(批號:191023)10 g、龜板(批號:191014)12 g、制遠志(批號:190815)10 g、山藥(批號:190527)15 g、熟地黃(批號:191014)15 g組成,中藥飲片購自北京同仁堂有限責任公司,將中藥飲片置于1 500 mL蒸餾水中浸泡4 h,沸水煎煮1 h,過濾,留取濾液,將藥材殘渣置于1 000 mL蒸餾水再次煎煮40 min,過濾,合并2次濾液,蒸發(fā)濃縮,制成生藥含量為20 g/kg的護巢飲;雷公藤多苷(貨號:JKBw1779,純度>98%)購自上海經(jīng)科化學科技有限公司;戊酸雌二醇(批號:364164)購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司;促卵泡激素(FSH,貨號:EK-R37070)、促黃體生成素(LH,貨號:EK-R37064)、雌二醇(E2,貨號:CSB-E12755r-1)購自上海恒斐生物科技有限公司;抗繆勒管激素(AMH,貨號:CSB-E11162r)購自武漢華美生物工程有限公司;抑制素B(INH-B,貨號:FY-A014510)購自上海富雨生物科技有限公司;過氧化氫酶(CAT,貨號:EK-R37399)購自上海酶研生物科技有限公司;活性氧(ROS,貨號:KMERa011724)購自溫州科淼生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(SOD,貨號:BC0170)、丙二醛(MDA,貨號:BC0020)、RNA提取試劑盒(貨號R1200)、反轉錄試劑盒(貨號:RP1100)、PCR試劑盒(貨號:SR1110)購自北京索萊寶科技有限公司;Nrf2兔多克隆抗體(貨號:ab92946)、HO-1(貨號:ab189491)、GAPDH(貨號:ab181602)兔單克隆抗體購自艾博抗貿易有限公司;p-PI3K(貨號:AF5905)、PI3K(貨號:AF7742)、p-Akt(貨號:AF1546)、Akt(貨號:AF1789) 兔單克隆抗體和辣根過氧化酶標記山羊抗兔二抗(貨號:A0208)購自碧云天生物科技有限公司。

1.4實驗方法 從72只大鼠中隨機取12只作為正常組,其余大鼠參照文獻［5］,給予雷公藤多苷40 mg/kg灌胃,1次/d,連續(xù)10周,同時每日對大鼠進行陰道涂片,記錄大鼠動情周期,所有大鼠動情周期破壞則視為卵巢功能不全造模成功。將造模成功大鼠隨機分為模型組、護巢飲低劑量組、護巢飲中劑量組、護巢飲高劑量組及戊酸雌二醇組,每組12只。護巢飲低、中、高劑量組大鼠分別給予5 g/kg、10 g/kg、20g/kg的護巢飲灌胃,戊酸雌二醇組大鼠給予0.1 mg/kg的戊酸雌二醇灌胃,均1次/d,連續(xù)15 d。

1.5檢測指標及方法

1.5.1血清FSH、E2、AMH、INH-B、LH水平 大鼠眼眶靜脈叢取血,在4 ℃條件下靜置1 h,4 ℃下6 000 r/min離心10 min,取上清液,使用ELISA試劑盒測定FSH、E2、AMH、INH-B、LH水平。

1.5.2卵巢濕重、卵巢指數(shù)、子宮濕重及子宮指數(shù)大鼠稱重后,頸椎脫臼處死,分離卵巢及子宮,稱重,計算卵巢指數(shù)及子宮指數(shù)。卵巢指數(shù)=卵巢重量/體重,子宮指數(shù)=子宮重量/體重。

1.5.3卵巢組織中ROS、CAT、SOD、MDA含量 將卵巢組織置于組織勻漿器,加入4 ℃預冷的蒸餾水,在冰盒上研磨勻漿,4 ℃條件下,3 500 r/min離心15 min,取上清液,使用ELISA試劑盒測定ROS、CAT、SOD、MDA含量。

1.5.4卵巢組織病理學形態(tài) 取大鼠卵巢組織,4%甲醛中固定24 h,石蠟包埋后使用石蠟切片機制成5 μm切片,常規(guī)HE染色,在顯微鏡下觀察。

1.5.5卵巢組織中Nrf2、HO-1 mRNA表達情況取卵巢組織,使用試劑盒提取卵巢組織總RNA,反轉錄為cDNA,使用相應試劑盒進行檢測。引物序列:Nrf2正向引物為5’-AATGTGTCCTTCCCA-3’,反向引物為 5’-GAGGCAGCAAGAGAGAT-3’;HO-1正向引物為5’-ACGCAGGCAAGCAAGACTACA-3’,反向引物為 5’-CATTCTCAAGATGGCAGATC-3’;GAPDH正向引物為5’-ATGTATCCGTTGTGGATCTGAC-3’,反向引物為5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’。采用20 μL反應體系:DNA模板2 μL,正反向引物各1 μL,PCR Master Mix 10 μL,使用蒸餾水補充至20 μL,反應程序為 95 ℃預變性3 min,95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共計30個循環(huán),72 ℃最終延伸10 min。結果以GAPDH為內參,采用2-△△ct法計算相對表達量。

1.5.6卵巢組織中p-PI3K、p-Akt、Nrf2及HO-1蛋白表達情況 取卵巢組織,使用組織蛋白液裂解并研磨勻漿后4 ℃靜置2 h,置于離心機,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清液,進行凝膠電泳分離,使用牛血清白蛋白室溫封閉1 h,4 ℃條件下分別使用p-PI3K、p-Akt、PI3K、Akt、Nrf2、HO-1、GAPDH兔抗體(1∶500),4 ℃孵育過夜,TBST溶液清洗3次,5 min/次,辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h,TBST溶液再次清洗3次,滴加ECL顯影液,用凝膠成像儀成像拍照,使用Image J 12.0,以GAPDH為內參,計算p-PI3K/PI3K、p-Akt/ Akt、Nrf2及HO-1相對表達量。

1.6統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進行處理,所有計量資料數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,以均數(shù)±標準差的形式表示,多組比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1各組大鼠血清FSH、E2、AMH、INH-B、LH水平比較 與正常組比較,模型組大鼠血清FSH、LH水平均明顯升高(P均<0.05),血清E2、AMH、INH-B水平均明顯降低(P均<0.05);與模型組比較,護巢飲各組及戊酸雌二醇組大鼠血清FSH、LH水平均明顯降低(P均<0.05),血清E2、AMH、INH-B水平均明顯升高(P均<0.05);且隨著護巢飲劑量的增加,大鼠血清FSH、LH水平逐漸降低,血清E2、AMH、INH-B水平逐漸升高,各劑量組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 正常組和卵巢功能不全各組大鼠血清FSH、E2、AMH、INH-B、LH水平比較

2.2各組大鼠卵巢濕重、卵巢指數(shù)、子宮濕重及子宮指數(shù)比較 模型組大鼠卵巢濕重、卵巢指數(shù)、子宮濕重及子宮指數(shù)均明顯低于正常組(P均<0.05);護巢飲各組及戊酸雌二醇組大鼠卵巢濕重、卵巢指數(shù)、子宮濕重及子宮指數(shù)均明顯高于模型組(P均<0.05);且隨著護巢飲劑量的增加,大鼠卵巢濕重、卵巢指數(shù)、子宮濕重及子宮指數(shù)逐漸升高,各劑量組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 正常組和卵巢功能不全各組大鼠卵巢濕重、卵巢指數(shù)、子宮濕重及子宮指數(shù)比較

2.3各組大鼠卵巢組織中ROS、CAT、SOD及MDA含量比較 與正常組比較,模型組大鼠卵巢組織中ROS、MDA含量均明顯升高(P均<0.05),CAT、SOD含量均明顯降低(P均<0.05);與模型組比較,護巢飲各組及戊酸雌二醇組大鼠卵巢組織中ROS、MDA含量均明顯降低(P均<0.05),CAT、SOD含量均明顯升高(P均<0.05);且隨著護巢飲劑量的增加,大鼠卵巢組織中ROS、MDA含量逐漸降低,CAT、SOD含量逐漸升高,各劑量組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表3。

表3 正常組和卵巢功能不全各組大鼠卵巢組織中ROS、CAT、SOD及MDA含量比較

2.4各組大鼠卵巢組織病理形態(tài) 正常組大鼠卵巢組織未見異常,模型組卵泡顆粒細胞排列雜亂、不整齊,護巢飲各組及戊酸雌二醇組卵巢顆粒細胞排列較整齊,見圖1。與正常組比較,模型組大鼠初級卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡數(shù)量均明顯減少(P均<0.05),閉鎖卵泡數(shù)量明顯增多(P<0.05);與模型組比較,護巢飲各組及戊酸雌二醇組大鼠初級卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡數(shù)量均明顯增多(P均<0.05),閉鎖卵泡數(shù)量均明顯減少(P均<0.05);且隨著護巢飲劑量的增加,大鼠初級卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡數(shù)量均逐漸增多,閉鎖卵泡數(shù)量逐漸減少,各劑量組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表4。

圖1 正常組和卵巢功能不全各組大鼠卵巢組織病理學形態(tài)(HE染色,×100)

表4 正常組和卵巢功能不全各組大鼠初級卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡及閉鎖卵泡數(shù)量比較個)

2.5各組大鼠卵巢組織中Nrf2、HO-1 mRNA表達量比較 模型組大鼠卵巢組織中Nrf2、HO-1 mRNA表達量均明顯低于正常組(P均<0.05);護巢飲各組及戊酸雌二醇組大鼠卵巢組織中Nrf2、HO-1 mRNA表達量均明顯高于模型組(P均<0.05);且隨著護巢飲劑量的增加,大鼠卵巢組織中Nrf2、HO-1 mRNA表達量均逐漸升高,各劑量組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表5。

表5 正常組和卵巢功能不全各組大鼠卵巢組織中Nrf2、HO-1 mRNA相對表達量比較

2.6各組大鼠卵巢組織中p-PI3K、p-Akt、Nrf2及HO-1蛋白表達情況比較 模型組大鼠卵巢組織中p-PI3K、p-Akt、Nrf2及HO-1蛋白表達量均明顯低于正常組(P均<0.05);護巢飲各組及戊酸雌二醇組大鼠卵巢組織中p-PI3K、p-Akt、Nrf2及HO-1蛋白表達量均明顯高于模型組(P均<0.05);且隨著護巢飲劑量的增加,大鼠卵巢組織中p-PI3K、p-Akt、Nrf2及HO-1蛋白表達量均逐漸升高,各劑量組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖2。

圖2 正常組和卵巢功能不全各組大鼠卵巢組織中p-PI3K、p-Akt、Nrf2及HO-1蛋白表達情況

3 討 論

早發(fā)性卵巢功能不全目前以補充雌激素,預防雌激素降低的并發(fā)癥治療為主［6］。戊酸雌二醇是一種長效的雌激素制劑,是早發(fā)性卵巢功能不全治療中的常用藥物,故本實驗用其作為陽性對照藥物。

中醫(yī)學認為,早發(fā)性卵巢功能不全是以腎氣不足,腎水虧虛,沖任血虛而致心血無源,加之脾胃失調,腎精難充,致使經(jīng)水早斷,卵巢早衰。同時,由于女子平素多憂思郁結,而致肝郁血瘀,血行不暢,氣血虛弱,致使臟器失于溫養(yǎng),卵巢功能衰退。護巢飲具有溫中補脾、行血補氣之功效,方中熟地黃補血滋陰;炒白術健脾益氣、燥濕利水;龜板滋陰潛陽、補腎調經(jīng);山藥固腎健脾、補精益氣;黃芪益衛(wèi)固表、健脾補腎;鹿角溫陽補腎、行血消腫;當歸活血化瘀、調經(jīng)止痛;遠志交通心腎;諸藥共用,起補脾益腎、溫中補氣、活血化瘀、行血止痛之功效。

血清FSH、E2、LH水平是反映體內激素水平的常用指標,早發(fā)性卵巢功能不全患者表現(xiàn)為血清FSH及LH水平顯著升高,而E2水平顯著降低［7］,激素分泌異常影響卵巢分泌功能及生殖功能［8］。AMH是反映卵巢功能的重要指標,血清AMH水平降低則提示卵巢功能減退,卵子儲備減少［9］。INH-B是由竇狀卵泡細胞的顆粒細胞合成的參與卵泡發(fā)育等生殖功能的重要物質。逯芳芳等［10］研究發(fā)現(xiàn),早發(fā)性卵巢功能不全患者AMH、INH-B、E2水平降低,上調AMH、INH-B、E2水平可顯著改善早發(fā)性卵巢功能不全患者卵巢儲備功能,提高妊娠率;顧燕頻等［11］研究證實,升高大鼠AMH、INH-B、E2水平可促進早發(fā)性卵巢功能不全大鼠卵巢功能恢復。本實驗結果表明,早發(fā)性卵巢功能不全大鼠血清FSH、LH水平明顯升高,E2、AMH、INH-B水平明顯降低;不同劑量的護巢飲干預后,大鼠血清FSH、LH水平明顯降低,E2、AMH、INH-B水平明顯升高。提示護巢飲能夠調節(jié)早發(fā)性卵巢功能不全大鼠激素水平,促進卵巢功能的恢復。

ROS、CAT、SOD、MDA水平可反映機體氧化應激狀態(tài),ROS、MDA水平升高及CAT、SOD水平降低提示組織氧化損傷,與卵巢損傷密切相關,上調CAT、SOD水平及下調ROS水平能夠減輕卵巢氧化應激損傷,促進卵巢功能的恢復［12-13］。本實驗結果表明,護巢飲各組大鼠卵巢組織中ROS、MDA含量明顯降低,CAT、SOD含量及卵巢濕重、卵巢指數(shù)、子宮濕重及子宮指數(shù)明顯升高,卵巢組織病理改變減輕。提示護巢飲能夠顯著抑制早發(fā)性卵巢功能不全大鼠卵巢組織氧化損傷,修復卵巢組織病理改變,促進卵巢及子宮組織功能的恢復。

PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路是與早發(fā)性卵巢功能不全發(fā)生及進展密切相關的重要信號通路。王文靜等［14］研究證實,早發(fā)性卵巢功能不全大鼠卵巢組織中PI3K及Akt蛋白磷酸化水平顯著降低,而提高卵巢組織p-PI3K及p-Akt水平能夠顯著調節(jié)大鼠動情周期,抑制顆粒細胞凋亡。張慧等［15］研究發(fā)現(xiàn),早發(fā)性卵巢功能不全患者FSH、LH及凋亡相關蛋白水平異常與p-PI3K、p-Akt水平降低有關,上調p-PI3K及p-Akt水平能夠顯著改善患者臨床癥狀,減少顆粒細胞凋亡。馬蔚蓉等［16］研究表明,早發(fā)性卵巢功能不全小鼠卵巢顆粒細胞中HO-1、p-PI3K及p-Akt表達水平明顯降低,而上調HO-1、p-PI3K及p-Akt表達水平能夠顯著抑制卵巢組織氧化損傷,抑制顆粒細胞凋亡,恢復卵巢功能。本實驗結果表明,卵巢功能不全大鼠卵巢組織中Nrf2及HO-1、p-PI3K、p-Akt表達量顯著降低,護巢飲干預可顯著上調大鼠卵巢組織中Nrf2及HO-1、p-PI3K、p-Akt表達量,提示護巢飲能夠顯著調節(jié)早發(fā)性卵巢功能不全大鼠PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路。

綜上所述,護巢飲能夠調節(jié)早發(fā)性卵巢功能不全大鼠激素水平,抑制卵巢組織氧化損傷及病理改變,促進卵巢功能的恢復,其機制可能與調節(jié)PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路有關。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。