聶峰杰，甘曉燕，張 麗，鞏 檑，劉 璇，楊文靜，宋玉霞

（1寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，銀川 750002；2寧夏農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750002）

0 引言

沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是豆科冬青屬植物，分布在中國北方荒漠地區(qū)抗寒抗旱能力極強(qiáng)的常綠闊葉灌木[1]。沙冬青天然種群分布區(qū)狹小，自然更新能力弱，天然種群分布范圍呈逐漸萎縮的趨勢[2-4]，已被列入第一批珍稀瀕危保護(hù)植物名錄[5]。沙冬青具有耐干旱、耐鹽堿、耐風(fēng)沙、耐低溫、耐高溫的特性，是優(yōu)良的天然抗逆基因資源庫，已有多個(gè)沙冬青耐逆基因研究取得了較大進(jìn)展，如轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF[6]，與抗逆相關(guān)的AmFAD2-1[7]，參與應(yīng)低溫和干旱脅迫Bet v 1基因等[8]。沙冬青枝葉具有活血、散瘀、止痛、祛風(fēng)濕的功效，對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、凍瘡等疾病治療效果顯著[9]，其豐富的生物堿類、黃酮及異黃酮類、有機(jī)酸等生物活性物質(zhì)，具有抗病毒、殺菌、降糖、抗腫瘤、殺蟲等作用[9-12]。沙冬青同時(shí)具有良好的景觀效應(yīng)，是干旱地區(qū)城市園林綠化首選材料。由于其獨(dú)特的研究應(yīng)用價(jià)值，沙冬青在生物科學(xué)研究、城市景觀設(shè)計(jì)、水土保持和改善環(huán)境等方面開展了大量的研究和應(yīng)用，對中國西部地區(qū)氣候、其他古地中海第三紀(jì)孑遺植物物種遷移以及荒漠區(qū)動(dòng)植物演替進(jìn)程的研究起重要的推動(dòng)作用。

近年來，沙冬青自然種群和天然分布面積受氣候變暖、地理變遷、人為破壞等因素影響急速減少，處于更加瀕危狀態(tài)。目前，為保護(hù)種質(zhì)資源，擴(kuò)大種群數(shù)量，加大資源開發(fā)利用沙冬青人工種植規(guī)模不斷擴(kuò)大。沙冬青葉部病害發(fā)生于春季葉片返青時(shí)期，發(fā)病率高，侵染速度快，防治不當(dāng)往往集中連片死亡，造成嚴(yán)重?fù)p失。由于沙冬青葉部病害鮮有報(bào)道，病原菌生物學(xué)特性和種類未知，本研究開展沙冬青葉部病害病原菌的分離和鑒定，田間開展藥劑防治研究，以期為沙冬青葉部病害防治提供理論基礎(chǔ)和有效的技術(shù)措施。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品及沙冬青2021 年在寧夏中寧縣轎子山林場沙冬青種質(zhì)資源圃采集沙冬青發(fā)病葉片，采用常規(guī)組織分離法分離病原菌。采集中寧轎子山林場種質(zhì)資源圃沙冬青健康幼嫩枝條用于離體接種材料。

1.1.2 培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉8 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。高氏1號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂8 g，pH 7.4～7.6。PD培養(yǎng)液：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

1.1.3 試劑和儀器Fungal DNA 提取試劑盒，Omega Bio-Tek 公司；DNA 純化回收試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、2×Det PCR MasterMix，天根生化科技（北京）有限公司；D2000 DNA Marker、2×GC Buffer II、dNTP、Taq酶、T4 DNA Ligase、pGEM(R)-TEasy載體，寶生物工程（大連）有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。BX53 熒 光 顯 微 鏡，日 本Olympus 公 司；Eppendore 5810R 高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendore 公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)，美國Therom公司；Applied Biosystems 2720 thermal cycler PCR 儀、Applied Biosystems 3730XL測序儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；君意JY04S-3C 凝膠成像系統(tǒng)及君意JY300C Power Supply電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.1.4 供試藥劑 波爾多液等銅制劑、福美鐵等殺菌劑、75%百菌清可濕性粉劑600 倍液，以清水做對照。噴孔直徑為0.8 mm的MATABI Super Green 16型背負(fù)式噴霧器。

1.2 方法

1.2.1 病原真菌的分離與純化 采用組織分離法進(jìn)行病原真菌分離，單孢純化法進(jìn)行病原真菌純化[13]，25℃培養(yǎng)5～7 d，待菌落長出后用5 mm 打孔器在菌落邊緣打孔，菌餅用于致病性接種，另取菌餅保存于15%甘油中-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測定 采集一年生沙冬青幼嫩枝條，無菌水沖洗晾干，用滅菌脫脂棉包裹枝條基部，滴上無菌水保濕，選取枝條前端完全展開葉片，每片葉子正面接種1 個(gè)菌餅，設(shè)6 次重復(fù)。將消毒后的托盤鋪無菌濾紙，用無菌水浸濕，接種后的枝條斜置于托盤中，噴灑無菌水后用保鮮膜封住托盤，25℃黑暗培養(yǎng)，接種2、5 d后觀察葉片發(fā)病情況。以葉片產(chǎn)生病斑作為致病性評價(jià)指標(biāo)，對發(fā)病組織重新進(jìn)行病原菌分離純化，原接種菌株一致的純化菌株為致病菌株。

1.2.3 致病真菌形態(tài)學(xué)觀察 將純化后的致病菌株接種于PDA 平板上，25℃黑暗培養(yǎng)5 d 后測量菌落直徑，觀察并記錄菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地等[14]。采用玻片培養(yǎng)檢視法進(jìn)行觀察，待致病菌株產(chǎn)生分生孢子與附著胞時(shí)，顯微鏡觀測分生孢子形態(tài)、菌絲附著胞形態(tài)與產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。

1.2.4 致病真菌的分子生物學(xué)鑒定 參照Fungal DNA提取試劑盒說明書提取菌株基因組DNA，DNA濃度和純度用超微量分光光度計(jì)檢測，以濃度為50 ng/μL 的標(biāo)準(zhǔn)液備用。采用真菌ITS 序列通用引 物 ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG) 和 ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物由北京奧維森基因科技有限公司合成。

50 μL PCR 擴(kuò) 增 體 系：2×TsingKE MasterMix 25 μL、正反向引物(10 μm)各1 μL、50 ng/μL DNA 1 μL、ddH2O 22 μL。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，循環(huán)30次；72℃保溫10 min。

取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR 產(chǎn)物純化后由北京奧維森基因科技有限公司測序，使用3730xl對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行收集。

1.2.5 沙冬青真菌病害的田間防治

（1）施藥方法。防治試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，重復(fù)3次，藥劑處理區(qū)和對照區(qū)面積均為30 m2，清水處理作對照。試驗(yàn)期為春季沙冬青返青長出3～5 片新葉的發(fā)病初期。以清水均勻噴施空白為對照區(qū)，另劃定藥劑處理區(qū)，以低濃度噴霧處理完成后，洗凈噴霧器再進(jìn)行高濃度噴霧處理，于2021年3月25日、4月4日間隔10 d各噴藥1次，共噴2次。

（2）調(diào)查方法。第2次施藥14 d后調(diào)查病情指數(shù)，共調(diào)查3次。每小區(qū)調(diào)查10株，記錄病葉數(shù)和葉片發(fā)病指數(shù)。

（3）藥效計(jì)算方法。沙冬青葉斑病分級標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[15]統(tǒng)計(jì)。0 級—無病斑，1 級—病斑面積占葉面積的10%以下，2級—病斑面積占葉面積的11%～30%，3 級—病斑面積占葉面積的31%～50%，4 級—病斑面積占葉面積的50%以上。藥效按式(1)～(2)計(jì)算。

式中，DI為病情指數(shù)，LN為病葉數(shù)，RE為相對極值，Ln為調(diào)查總?cè)~數(shù)，CE為防治效果，DICK為對照區(qū)病情指數(shù)，DIET為處理區(qū)病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原真菌分離與致病性測定

對采集到的沙冬青病葉進(jìn)行病原菌分離純化，經(jīng)沙冬青嫩枝接種驗(yàn)證獲得1 株致病菌株SDQ。由SDQ 引起的沙冬青病害主要侵染葉部（圖1a、1b），造成葉部產(chǎn)生凸起斑點(diǎn)，斑點(diǎn)周圍葉片變黃干枯（圖1c、1d）。葉部凸起斑點(diǎn)在體式顯微鏡下觀察（圖1e、1f）呈不規(guī)則盤座狀，內(nèi)部密生分生孢子。將SDQ接種至沙冬青幼嫩枝條葉片上進(jìn)行致病性測定，接種2 d后接種點(diǎn)可見壞死斑點(diǎn)（圖1g），接種5 d后葉部病斑擴(kuò)大，表現(xiàn)與田間相似癥狀（圖1h）。

圖1 沙冬青葉部病害癥狀

2.2 病原菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征

SDQ 菌株在PDA 和高氏1 號培養(yǎng)基平板上正常生長，28℃黑暗培養(yǎng)5 d 菌落直徑8 cm，絨毛狀、灰白色、致密氣生菌絲，背面呈灰黑色輪紋狀（圖2a、2b）。經(jīng)玻片黑暗保濕培養(yǎng)5 d 后菌絲直柔曲狀，有隔（圖2c、2d）；培養(yǎng)7 d 后產(chǎn)生深色分生孢子梗，以合軸式延伸，頂端單生褐色分生孢子（圖2e、2f）。

圖2 菌株SDQ的菌落和形態(tài)特征

2.3 病原真菌分子生物學(xué)鑒定

采用真菌ITS 序列通用引物，對菌株SDQ 進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖3），得到有效序列587 bp（圖4）。測序后對rDNA ITS序列在NCBI中進(jìn)行序列比對，下載相似性99%及以上序列，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，SDQ 與Alternaria alstroemeriaeCBS 118809 ITS region(NR_163 686.1)相似性為99.82%，與Alternaria eichhorniaeATCC 22255 ITS region(NR _111832.1)相似性為99.46% ；與Alternaria destruensATCC 204363(NR_13714 3.1)相似性達(dá)到100%。

圖3 SDQ ITS擴(kuò)增結(jié)果

圖4 沙冬青病原菌ITS序列

圖5 基于ITS序列構(gòu)建的沙冬青病原菌及相關(guān)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 沙冬青葉部病害的田間防治

沙冬青葉部病害田間藥劑防治試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，75%百菌清可濕性粉劑和波爾多液2000倍液對病害均有一定的防治效果，其中75%百菌清可濕性粉劑噴施2 次對沙冬青葉部病害的防治效果達(dá)到87%，波爾多液2000 倍液的防治效果為57.9%，75%百菌清可濕性粉劑的防治效果優(yōu)于波爾多液2000倍液。

表1 第2次施藥后7 d沙冬青葉部病害防治效果

3 結(jié)論

沙冬青具有獨(dú)特的研究應(yīng)用價(jià)值，在生物科學(xué)研究、城市景觀設(shè)計(jì)、水土保持和改善環(huán)境等方面對其開展了大量的研究和應(yīng)用，但對沙冬青的病害鮮有報(bào)道。寧夏轎子山林場建立的沙冬青種質(zhì)資源圃，春季返青時(shí)期葉部發(fā)生病害，流行性較強(qiáng)，發(fā)病速度快，易造成毀滅性危害。本研究從沙冬青葉部斑狀組織中分離病原菌，經(jīng)形態(tài)和ITS序列鑒定與A.destruensATCC 204363(NR_13714 3.1)相似性達(dá)到100%，初步確定為半知菌亞門絲孢綱絲孢目鏈格孢屬。

由于沙冬青葉部病害在葉部返青時(shí)期流行性較強(qiáng)，易造成毀滅性危害。作為首次報(bào)道的病害，本研究主要采用不同藥劑對沙冬青葉部病害進(jìn)行田間防治。沙冬青返青長出3～5 片新葉時(shí)期，在發(fā)病初期連續(xù)噴藥2 次，間隔10 d，75%百菌清可濕性粉劑噴施2 次的田間防治效果優(yōu)于波爾多液2000 倍液，防治效果達(dá)到87%，可作為沙冬青葉部病害防治藥劑選擇使用。

4 討論

鏈格孢菌A. destruens作為植物病原菌僅在2019年首次報(bào)道在中國引起女貞葉斑病[16]，尚無其侵染其他植物的報(bào)道。作為夾竹桃科龍膽屬植物的內(nèi)生真菌[17]，A.destruens產(chǎn)生的α-葡萄糖苷酶抑制劑可作為抗菌和抗生物膜制劑。同時(shí)，A.destruens已注冊為控制菟絲子生物除草劑的有效成分之一[18]，可以與草甘膦、硫酸銨綜合治理菟絲子。鏈格孢屬中包括許多植物病原菌，如馬鈴薯早疫病病原菌A alternate[19-20]，引起胡蘿卜黑腐病的A radicina、A carotiincultae、A.atrocariis[21]等病原菌，引起紅棗黑斑病的A.alternate和A.tenuissima[22]。鏈格孢屬也是一些植物內(nèi)生真菌，如在月季上分離到A.alternate和A.tenuissima，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物細(xì)交鏈格孢菌酮酸在適合濃度對月季沒有傷害而對月季長管蚜有趨避作用[23]。

A.destruens作為沙冬青葉部病害的病原真菌為首次報(bào)道，其致病機(jī)理尚不清楚，有必要進(jìn)一步開展生物學(xué)特性、生理生化特性等研究，系統(tǒng)研究病原菌致病機(jī)理，為病害的防治奠定理論基礎(chǔ)。