張 超 李曉意 楊 吉 孫金旭 高群英 王 茜 高小寬

（衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 河北 衡水 053000）

河北省作為華北平原上的農(nóng)業(yè)大省，主要種植小麥、玉米、高粱和谷子等農(nóng)作物。因此，農(nóng)作物秸稈分布廣、產(chǎn)量大，僅衡水市每年可收集秸稈量就為485 萬(wàn)t，其中玉米秸稈276 萬(wàn)t，約占秸稈總量的56.9%[1]。玉米等農(nóng)作物秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等植物細(xì)胞壁組成，該類組分都屬于有機(jī)碳水化合物大分子，是優(yōu)質(zhì)的可再生資源[2]。但因其結(jié)構(gòu)致密、復(fù)雜，難以降解，導(dǎo)致利用率下降。因此，如何實(shí)現(xiàn)玉米秸稈的高效降解已成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)。

復(fù)合菌劑憑借自身豐富的秸稈降解酶系和菌株間相互協(xié)同促進(jìn)的降解作用，成為農(nóng)作物秸稈的重要研究方向。梅新蘭等[3]通過(guò)構(gòu)建細(xì)菌- 真菌復(fù)合菌劑，使水稻秸稈的降解率以及纖維素酶活顯著提高。江高飛等[4]研究真菌復(fù)合菌系降解玉米秸稈發(fā)現(xiàn)，降解菌多樣性的增加有助于增強(qiáng)秸稈的降解效果。本研究利用實(shí)驗(yàn)室保存的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)和地衣芽孢桿菌(Bacil-lus lincheniformis)構(gòu)建復(fù)合菌劑，研究其對(duì)玉米秸稈的降解性能，為高效降解秸稈提供菌株資源和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料。玉米秸稈采集于衡水市深州農(nóng)田，洗凈、晾干，粉碎后過(guò)30 目篩?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)和地衣芽孢桿菌(Bacillus lincheniformis)保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基配方。LB 培養(yǎng)基[5]。玉米秸稈降解培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g/L、(NH4)2SO42 g/L、MgSO40.5 g/L、K2HPO41 g/L、NaCl 0.5 g/L、玉米秸稈粉50 g/L、pH值7.0、121 ℃高溫滅菌20 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 芽孢桿菌種子液的制備。用無(wú)菌槍頭挑取3 種芽孢桿菌的單菌落，分別接入含100 ml LB 培養(yǎng)基的三角燒瓶中，轉(zhuǎn)移至恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.2 單菌株和復(fù)合菌劑降解玉米秸稈方法。收集種子液，10 000 r/min 離心，棄上清，菌體沉淀用無(wú)菌生理鹽水分別制備含枯草芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的菌懸液，使菌體濃度達(dá)到1 ×109CFU/ml。按5%接種量將3 種芽孢桿菌的菌懸液分別接入100 ml 玉米秸稈降解培養(yǎng)基中，形成單菌株玉米秸稈降解體系；將3 種芽孢桿菌的菌懸液按1∶1∶1的比例，5%的接種量接入玉米秸稈降解培養(yǎng)基，形成復(fù)合菌劑玉米秸稈降解體系。2 種體系均在25 ℃、100 r/min 的條件下發(fā)酵培養(yǎng)15 d。試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.3.3 纖維素酶活的測(cè)定。酶活測(cè)定包括羧甲基纖維素酶活(CMCase)和濾紙(FPA)酶活測(cè)定，具體方法如下：取發(fā)酵完成后的培養(yǎng)液，10 000 r/min 離心后取上清即為粗酶液，采用DNS 法[6]，以1 ml 1%CMC-Na 和100 mg 濾紙為底物，分別與1 ml 粗酶液完成反應(yīng)。酶活力單位(U)定義為：在上述條件下每分鐘催化底物生成1 μmol 還原糖所需酶量為1 個(gè)活力單位。

1.3.4 玉米秸稈降解率的測(cè)定。采用失重法評(píng)估玉米秸稈的降解效果，具體方法如下：將發(fā)酵完成后的玉米秸稈粉用濾紙過(guò)濾，蒸餾水反復(fù)清洗，105 ℃烘干8 h，稱重，按以下公式計(jì)算降解率。

公式中w0為對(duì)照玉米秸稈粉干重，mg；w為降解后玉米秸稈粉干重，mg。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)處理采用Graph Prism 7.0 軟件進(jìn)行分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 株芽孢桿菌和復(fù)合菌劑的纖維素酶活評(píng)價(jià)。由圖1 可知，3 株芽孢桿菌單菌株CMCase 活性相差較大，其中地衣芽孢桿菌的活性最高，達(dá)到39.290 ±2.499 U/ml，枯草芽孢桿菌次之，酶活為 37.458 ±1.335 U/ml，貝萊斯芽孢桿菌的酶活最低，僅 為 28.066 ±4.703 U/ml。而復(fù)合菌劑的CMCase活性較單菌株有顯著提升，達(dá)到113.522 ±5.528 U/ml；3 株芽孢桿菌的FPA 活性從大到小依次為貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，酶活分別為13.961 ±1.493 U/ml、11.153 ±1.746 U/ml和9.375 ± 0.441 U/ml，而復(fù)合菌劑的FPA 則高達(dá)29.851±3.061 U/ml。上述結(jié)果表明，與單菌株相比，復(fù)合菌劑纖維素酶活大幅提升，表現(xiàn)出明顯的菌株間協(xié)同促進(jìn)作用。

圖1 單菌株與復(fù)合菌劑的纖維素酶活

2.2 株芽孢桿菌和復(fù)合菌劑的秸稈降解效果評(píng)價(jià)。以玉米秸稈粉為試驗(yàn)材料，經(jīng)單菌株和復(fù)合菌劑15 d發(fā)酵降解后，過(guò)濾、洗滌、烘干和稱重，計(jì)算降解率，結(jié)果如圖2 所示，單菌株的降解率均低于40%，其中貝萊斯芽孢桿菌的降解率最高，達(dá)到36.53%，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的降解率分別為20.04%和28.49%，而復(fù)合菌劑的玉米秸稈降解率為72.47%，顯著高于上述單菌株降解率。

圖2 單菌株和復(fù)合菌劑的秸稈降解率

3 結(jié)論與討論

芽孢桿菌屬細(xì)菌種類豐富，且大多能分泌纖維素酶，用于玉米秸稈的降解可取得較好的降解效果，如林源等[7]利用1 株枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的纖維素酶，降解玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻用于造紙。倪志華等[8]使用1 株凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵酸解玉米秸稈用于乳酸生產(chǎn)。本研究選擇前期篩選的秸稈降解菌株，即枯草芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌構(gòu)建復(fù)合菌劑，經(jīng)15 d 發(fā)酵降解玉米秸稈，測(cè)得纖維素酶活，如CMCase 為113.522 ±5.528 U/ml 和FPA 為29.851 ±3.061 U/ml，秸稈降解率高達(dá)72.47%，顯著優(yōu)于單菌株降解效果，這為秸稈降解復(fù)合菌劑的開(kāi)發(fā)提供了參考。