朱曉璐*，程 浩，趙文杰，尹 曦，盧勝波

（1.河海大學(xué) 機(jī)電工程學(xué)院，江蘇 常州；2.康達(dá)斯（南京）科技有限公司，江蘇 南京）

銅是生物體必須的微量元素，成年人每天正常的銅攝入量約為1.5～3 mg[1]。生物體銅離子濃度需維持在一個(gè)相對穩(wěn)定的水平(如，血清銅10～20 μmol/L)，濃度過高或過低會(huì)造成嚴(yán)重生理問題，甚至危及生命[2-3]。銅對細(xì)胞代謝具有重要作用[4]，銅代謝障礙會(huì)引起Menkes 氏綜合征和Wilson 氏綜合征。

為了實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的非破壞式的金屬離子吸收度的高靈敏度且滿足生物學(xué)研究需求的高精度定量檢測，本文提出針對細(xì)胞培養(yǎng)基的特性，優(yōu)化基于汞膜修飾工作電極的電化學(xué)測量設(shè)置，在對細(xì)胞完全培養(yǎng)基內(nèi)銅離子濃度標(biāo)定的基礎(chǔ)上，通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中剩余銅離子濃度，推導(dǎo)出細(xì)胞在生長過程對銅離子的吸收量。最后討論了汞膜修飾電極特點(diǎn)、培養(yǎng)基內(nèi)銅離子溶出峰的特點(diǎn)及C2C12 細(xì)胞對銅離子的吸收機(jī)制。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器和試劑

試驗(yàn)儀器：恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置生物顯微鏡、實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)、FA1004 電子分析天平、RST5060F 電化學(xué)工作站、SN-MS-1D 磁力攪拌器、電化學(xué)三電極系統(tǒng)，修飾的玻碳電極為工作電極(3 mm GCE)，AgCl/Ag 電極為參比電極，鉑片電極為對電極。

試驗(yàn)試劑材料與細(xì)胞培養(yǎng)方法：濃度120 mg/L Hg2+溶液；濃度0.1 g/L Cu2+溶液；濃度0.1 g/L Pb2+溶液；醋酸- 醋酸鈉緩沖液（0.1 mol/L）；Dulbecco's modified eagle medium（DMEM）培養(yǎng)基；完全培養(yǎng)基是包含10% 胎牛血清和1% 青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM 溶液。實(shí)驗(yàn)所用C2C12 細(xì)胞，于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，約每48 h 傳代一次。

1.2 玻碳電極預(yù)處理

先將裸玻碳（Glassy Carbon，GC）電極用去離子水沖洗，然后在麂皮上用2 μm、200 nm 和30 nm 的Al2O3漿連續(xù)拋光，之后用去離子水沖洗，緊接著放入硝酸(20%)、乙醇(75%)和去離子水中分別超聲1 min，并在室溫下干燥，得到表面清潔且呈鏡面的玻碳電極。

1.3 修飾電極的制備

在工作電極上涂覆汞膜對于檢測銅離子具有靈敏度提高，穩(wěn)定性更好等特點(diǎn)[5]。取50 mL 濃度為120 mg/L 的Hg2+溶液于電解池中，加入攪拌子，置入三電極并接入電化學(xué)工作站，打開磁力攪拌器，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為300 rpm，選擇“恒電位電解i-t 曲線”，在-0.2 V 電壓下富集240 s，得到汞膜修飾的玻碳電極，備用。圖1 是裸玻碳電極和汞膜修飾電極在Cu2+和Pb2+濃度為50 ng/mL 的DMEM 培養(yǎng)基（不含血清）中的溶出伏安曲線對比。由圖1 可知，汞膜修飾電極上電子傳遞效率優(yōu)于裸電極。

圖1 汞膜修飾的玻碳電極（Hg/GCE）與裸玻碳電極(GCE)對銅離子的檢測對比曲線

1.4 電化學(xué)測量方法與步驟

完全培養(yǎng)基內(nèi)Cu2+含量標(biāo)定：完全培養(yǎng)基中含有Cu2+，主要因?yàn)槠浜械奶ヅＱ逯泻珻u2+，所以，需要用去離子水對其中的Cu2+含量進(jìn)行標(biāo)定：（1）首先將去離子水對照組的用醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋5倍，最終pH 3.75, 體積為50 mL；（2）然后滴加2.5 μL 濃度10 mg/L 的CuCl2溶液，攪拌均勻后得到Cu2+濃度為0.5 ng/mL；（3）將汞膜修飾電極置入培養(yǎng)基中，設(shè)置參數(shù)如下：富集電位-1.2 V，富集時(shí)間480 s，起始電位-0.6 V，終止電位0 V，電位增量1mV，脈沖幅度0.1V，脈沖周期0.08 s，脈沖寬度0.01 s，采樣寬度0.002 s，得0.5 ng/mL 時(shí)的差分脈沖溶出伏安曲線；（4）繼續(xù)滴加CuCl2溶液，重復(fù)步驟3，最終得到0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 ng/mL 條件下的差分脈沖溶出伏安曲線（以下簡稱曲線）。

1.5 樣品標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線的測定步驟

以檢測10 ng/mL Cu2+為例，（1）首先將空白對照組（不含胎牛血清的DMEM, 未加銅離子）的培養(yǎng)基用醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋5 倍，體積為50 mL；（2）然后滴加5 μL 濃度10 mg/L 的CuCl2溶液，攪拌均勻；（3）將汞膜修飾電極置入培養(yǎng)基中，設(shè)置參數(shù)同上；（4）繼續(xù)滴加CuCl2溶液，重復(fù)步驟（3），最終得到濃度為1，2，3，4，5，6 ng/mL 條件下曲線；(5) 將培養(yǎng)C2C12 細(xì)胞3 天后回收的10 mL 完全培養(yǎng)基按步驟(1)稀釋5 倍，按照步驟(3)，得到外加 10 ng/mL Cu2+的曲線；(6) 計(jì)算得到外加10 ng/mL 完全培養(yǎng)基中剩余Cu2+的含量。同理，對外加50 ng/mL 和500 ng/mL 銅離子的情況進(jìn)行測量。

2 結(jié)果與討論

2.1 完全培養(yǎng)基內(nèi)所含Cu2+的濃度的測定結(jié)果

由于牛血清中的銅藍(lán)蛋白和胺氧化酶都含有銅，所以完全培養(yǎng)基本身就含有一定量的銅[6]，只是并非全部以離子形式存在。根據(jù)此測量，得到稀釋5 倍后的完全培養(yǎng)基中Cu2+濃度為3.14 ng/mL，故原完全培養(yǎng)基中的銅離子濃度近似為3.14×5=15.7 ng/mL。

2.2 Cu2+對C2C12 生長增殖的影響

圖2 表示加入梯度濃度Cu2+72 h 后對C2C12 細(xì)胞生長和增殖的影響。圖2(a)表示對照組和初始添加10，50，500 ng/mL Cu2+的完全培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)組以初始細(xì)胞數(shù)為300 k 培養(yǎng)72 h 后的細(xì)胞生長形貌（10 cm培養(yǎng)皿），圖2(b)表示細(xì)胞數(shù)量（10 cm 培養(yǎng)皿）。10 ng/mL Cu2+對細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。50 ng/mL Cu2+對細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用且增殖率相對于10 ng/mL條件下更大。500 ng/mL Cu2+對細(xì)胞增殖具有抑制作用且作用很明顯。

圖2 加入不同濃度的Cu2+ 72 h 后對C2C12 細(xì)胞生長和增殖后數(shù)量的影響。第三天的細(xì)胞數(shù)量為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.3 C2C12 成肌細(xì)胞對Cu2+吸收度的測量結(jié)果及討論

在空白對照組培養(yǎng)基（DMEM）中添加預(yù)設(shè)定量的銅離子，進(jìn)而測量出不同標(biāo)準(zhǔn)濃度對應(yīng)的峰電流，進(jìn)而確定標(biāo)準(zhǔn)曲線；接著利用峰電流與濃度之間的線性關(guān)系，確定實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中剩余Cu2+濃度。圖3(a)中，用醋酸-醋酸鈉緩沖液，將目標(biāo)培養(yǎng)液稀釋為原來體積的5 倍, 測得紅線條峰值對應(yīng)濃度約為2.1 ng/mL，故3 天后銅離子濃度接近10.5 ng/ml，即相對初始Cu2+濃度(25.7 ng/ml), 細(xì)胞約吸收了15.2 ng/ml 銅離子。同理，根據(jù)圖3(b)，50 ng/mL 實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)72 h 后，培養(yǎng)基中剩余Cu2+濃度為7.214 ng/mL × 5 = 36.07 ng/mL，表明細(xì)胞對Cu2+吸收量為50+15.7-36.07=29.63 ng/ml。根據(jù)圖3(c)，得到500 ng/mL 實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)72 h 后，細(xì)胞吸收Cu2+的量為129.44 ng/ml。

圖3 加入不同濃度的Cu2+ 溶液72 h 后培養(yǎng)基中剩余Cu2+濃度的差分脈沖溶出伏安曲線及相應(yīng)范圍的濃度標(biāo)定曲線

上述試驗(yàn)結(jié)果表明了本三電極體系及相關(guān)的參數(shù)配置能夠定量檢測培養(yǎng)基中的銅離子(最小可檢測濃度變化量為0.5 ng/mL)，且試驗(yàn)結(jié)果高度可重復(fù)。對于本體系中采用的汞膜修飾工作電極利于捕獲銅離子的機(jī)制方面的解釋如下：Cu2+在一定的預(yù)電解電位下富集后在汞膜上形成汞齊，靜止一段時(shí)間后，再反掃到初始電位，使汞齊中已經(jīng)被還原的銅單質(zhì)氧化，變成銅離子后進(jìn)入溶液。當(dāng)測量時(shí)的溶液是醋酸鹽緩沖液（不含培養(yǎng)基）時(shí)，Cu2+在-0.05 V 附近出現(xiàn)溶出峰，當(dāng)介質(zhì)溶液為細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)，銅溶出峰左移。其內(nèi)在機(jī)制可能是培養(yǎng)基中的氨基酸、谷氨酰胺和多種維生素等使得銅離子在工作電極的沉積時(shí)受到干擾，銅汞之間的微觀作用力相對減小，所以銅在培養(yǎng)基溶液中更容易溶出(溶出峰偏左）。

3 結(jié)論

本研究能夠檢測培養(yǎng)基內(nèi)銅離子最低0.5 ng/mL的變化量，線性測量范圍：1-150 ng/mL。當(dāng)介質(zhì)溶液為細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)，銅溶出峰左移。外加銅離子濃度達(dá)到50 ng/mL 時(shí)成肌細(xì)胞依然保持增殖，但外加銅離子濃度達(dá)到500 ng/mL 時(shí)成肌細(xì)胞數(shù)量下降，且細(xì)胞對銅離子的吸收度隨初始添加的銅離子濃度變化而變化。