胡 杰,杜巖松,王萬宏

1.唐山市工人醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,唐山 063000;2.石家莊欒城人民醫(yī)院骨科,石家莊 051430;3.唐山市豐南區(qū)醫(yī)院神經(jīng)外科,唐山 063300

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)是一種臨床常見的關(guān)節(jié)風(fēng)濕性疾病,以膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、關(guān)節(jié)僵硬、喪失活動能力和關(guān)節(jié)軟骨細胞病變壞死為主要病理特點[1]。軟骨細胞作為關(guān)節(jié)軟骨的唯一細胞,僅靠關(guān)節(jié)液中的營養(yǎng)合成細胞外基質(zhì)維持關(guān)節(jié)軟骨的健康平衡,軟骨細胞的凋亡和外基質(zhì)缺失是KOA病程進展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。黃腐酚(xanthohumol)是從啤酒花中提取的天然多酚物質(zhì),約占啤酒花干質(zhì)量的1%,具有抗氧化、抗癌等多種藥理作用,中醫(yī)臨床中常用于治療糖尿病、消化系統(tǒng)疾病等[3-4]。研究表明,黃腐酚對細胞凋亡和自噬水平均有影響[5]。本研究通過建立KOA大鼠模型,探討黃腐酚對KOA大鼠軟骨損傷的修復(fù)作用和對軟骨細胞自噬水平的影響及其可能的作用機制,旨在為黃腐酚藥物開發(fā)及臨床治療骨關(guān)節(jié)炎提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Bio-Tek Elx800型全自動酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司);CFX Connect型熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 試藥

黃腐酚(質(zhì)量分數(shù)為98%,批號B20557,規(guī)格為20 mg,上海源葉生物科技有限公司);硫酸氨基葡萄糖膠囊(維固力膠囊,規(guī)格為0.25 g,羅達藥廠);白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assy,ELISA)試劑盒均購自英國Abcam公司;兔抗β-actin多克隆抗體、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)、哺乳動物雷帕霉菌靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)、哺乳動物ATG同源蛋白(mammalian ATG homologous protein, Beclin 1)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3-Ⅱ)多克隆抗體和山羊抗兔二抗免疫球蛋白G(immunoglobulin,IgG)均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗動物

60只7～8周齡SPF級雄性SD大鼠,動物來源于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,合格證號為SCXK(冀)2020-002。體質(zhì)量為220～250 g,所有大鼠于相同環(huán)境飼養(yǎng),用標(biāo)準飼料和清潔水源喂養(yǎng)7 d,定期更換墊料,保持良好通風(fēng)。環(huán)境條件設(shè)置為溫度20～24 ℃、相對濕度(50%±10%)。

2 方法

2.1 KOA大鼠模型建立

適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,選取48只大鼠用前后交叉韌帶斷離術(shù)建立KOA模型[6],腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,仰臥位固定于手術(shù)臺上,選取兩側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)部位,將手術(shù)部位腿毛剃除并消毒,無菌條件下縱向切開皮膚,暴露出整個膝關(guān)節(jié),找到髕腱內(nèi)緣切開關(guān)節(jié)囊,鈍性分離結(jié)締組織、血管,彎曲膝關(guān)節(jié),切斷前交叉韌帶,切除內(nèi)側(cè)半月板,保留關(guān)節(jié)軟骨面以避免損傷。用生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔,抽屜實驗陽性后快速止血,逐層縫合手術(shù)傷口,無菌包扎。術(shù)后連續(xù)3 d注射青霉素,預(yù)防感染,每日驅(qū)趕大鼠迫使其運動30 min,觀察大鼠狀態(tài),出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)腫脹、行走不便或跛行,表示建模成功。

2.2 分組與給藥

將造模成功大鼠隨機分為模型組、黃腐酚低劑量、黃腐酚高劑量組和西藥組;其余大鼠作為對照組(12只)。參照文獻方法[7-8],黃腐酚低劑量、高劑量組分別灌胃50、100 mg·kg-1黃腐酚混懸液(用生理鹽水配制),西藥組灌胃0.17 g·kg-1硫酸氨基葡萄糖膠囊,對照組及模型組給予等量生理鹽水,各組每日給藥1次,連續(xù)給藥28 d。

2.3 標(biāo)本采集

末次給藥后禁食24 h,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,開腹,經(jīng)腹主動脈采集血液,靜置30 min,于4 ℃以3 000 r·min-1離心15 min(離心半徑為12 cm),分離血清,-20 ℃保存。采血完畢后,脊椎脫臼法處死大鼠,分離左側(cè)膝關(guān)節(jié),剔除周圍肌肉和脂肪組織,取出軟骨組織,剪取部分置于無菌凍存管中,-80 ℃保存?zhèn)溆?其余軟骨組織置于4 g·mL-1多聚甲醛液中固定24 h,備用。

2.4 大鼠軟骨組織Mankin’s評分

將制好的軟骨組織切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)變化,根據(jù)軟骨組織結(jié)構(gòu)完整性、軟骨細胞數(shù)量和潮線完整性,用Mankin’s軟骨損傷組織學(xué)評定標(biāo)準對大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織病變程度進行評分,各分數(shù)相加為最終得分。評分越高表示KOA病變的程度越嚴重,詳細評定標(biāo)準見表1。

2.5 血清炎癥因子水平檢測

按照IL-6、IL-1β和TNF-α試劑盒說明書操作。取出相關(guān)板條,設(shè)置樣品孔與標(biāo)準孔,樣品孔加入待測樣本10 μL和稀釋液40 μL,標(biāo)準孔中加入不同質(zhì)量濃度對照品稀釋液50 μL。于各板孔中再加入酶標(biāo)抗體100 μL,37 ℃水浴鍋加熱60 min,棄液拍干吸去多余液體后,各板孔中加入顯色A液和B液各50 μL,37 ℃水浴鍋加熱10 min。最后加入終止液50 μL,用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各孔吸光度值,根據(jù)對照品梯度質(zhì)量濃度繪制對照品線性回歸曲線,計算各樣本的質(zhì)量濃度。

2.6 軟骨組織HE染色觀察

將固定24 h的軟骨組織取出,置于脫水盒中脫去組織水分,二甲苯中透明。完全浸入石蠟中包埋,-20 ℃冷凍臺冷卻凝固,修整蠟塊切成厚5 μm的薄片。切片放入二甲苯、無水乙醇和梯度乙醇溶液中進行脫蠟復(fù)水,浸入蘇木精染色液10 min,流水沖洗1 min,鹽酸分化1 s,氨水返藍后再次用流水沖洗,伊紅染液染色2 min,清水沖洗3 min,脫水透明,滴加中性樹脂封固,保存。在光學(xué)顯微鏡下觀察軟骨組織病理變化并拍照。

2.7 軟骨組織TUNEL染色觀察

室溫下將軟骨組織切片浸入二甲苯脫蠟5 min,浸入梯度體積分數(shù)乙醇脫水3 min,PBS潤洗切片,嚴格按照TUNEL試劑盒說明書操作,吸干多余液體后滴加配制好的20 μg·mL-1Proteinase工作液100 μL,室溫孵育20 min,PBS沖洗,再加入顯色劑,封膜孵育20 min,PBS沖洗3次,復(fù)染后封片,光學(xué)顯微鏡下移動切片觀察軟骨組織神經(jīng)細胞凋亡情況,用Image J軟件處理數(shù)據(jù),統(tǒng)計細胞總數(shù)和呈現(xiàn)棕黃色的凋亡陽性細胞數(shù),計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=(陽性細胞數(shù)量/總細胞數(shù)量)×100%。

2.8 RT-PCR檢測mRNA表達

取出軟骨組織,按照RNA提取試劑盒說明書操作提取總RNA,用分光光度計檢測RNA的質(zhì)量濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA。用cDNA配制PCR反應(yīng)體系(19.2 μL)。上、下游引物各0.4 μL,SYBR Premix Ex Tap 10 μL,ROX Refermce Dye Ⅱ 0.4 μL,cDNA 2 μL,RNase free ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 35 s,40個循環(huán)。取樣本CT值平均數(shù),以目的基因相對內(nèi)參的表達量計算各樣本中基因的相對表達水平,2-△△CT為各樣本基因的表達水平。引物序列為PI3K-F: 5′-ACACCACGGTTTGGACTATGG-3′、PI3K-R: 5′-GGCTACAGTAGTGGGCTTGG-3′;Akt-F:5′-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3′、Akt-R:5′-TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3′;mTOR-F:5′-CAGTTCGCCAGTGGACTGAAG-3′、mTOR-R:5′-GCTGGTCATAGAAGCGAGTAGAC-3′;以β-actin為內(nèi)參,β-actin-F: 5′-GGCTGTATTCCCCTCCAT-CG-3′、β-actin-R: 5′-CCAGTTGGTAACAATGCC-ATGT-3′。

2.9 Western blotting檢測蛋白表達

取軟骨組織,加入RIPA細胞裂解液進行裂解,制成勻漿后提取總蛋白,用BCA蛋白質(zhì)量濃度試劑盒測定質(zhì)量濃度。按照蛋白上樣量為40 μL,加入配制好的分離膠與濃縮膠,恒壓75 V電泳40 min,恒壓120 V電泳至溴酚藍及Marker位置即停止。轉(zhuǎn)至PDVF膜,TBST漂洗5 min,加入脫脂牛奶于搖床中封閉2 h,再加入1∶1 000稀釋一抗,于4 ℃搖床孵育,TBST漂洗5 min,加入1∶2 000稀釋二抗,室溫搖床封閉60 min,TBST漂洗,滴加顯影液進行顯影,避免曝光,保存圖像,以β-actin為內(nèi)參,觀察條帶上相應(yīng)的蛋白表達量并對目的條帶吸光度值進行計算、分析。

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 軟骨組織學(xué)評分比較

與對照組比較,模型組大鼠Mankin’s評分升高(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠的Mankin’s評分均降低(P<0.05)。與黃腐酚低劑量組比較,黃腐酚高劑量組和西藥組大鼠Mankin’s評分均降低(P<0.05),后2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 大鼠軟骨組織學(xué)Mankin’s評分的比較

3.2 血清炎癥因子水平比較

與對照組比較,模型組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05)。與黃腐酚低劑量組比較,黃腐酚高劑量組和西藥組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05),后2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平的比較

3.3 軟骨組織HE染色比較

結(jié)果顯示,對照組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)未見明顯異常,結(jié)構(gòu)完整,軟骨表面光滑,基質(zhì)均勻,細胞形態(tài)正常、排列整齊,各層細胞均未見破壞,未見細胞腫脹和炎性細胞浸潤等現(xiàn)象。模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)破壞嚴重,軟骨淺層出現(xiàn)明顯缺失及裂縫,裂隙深達鈣化層,深層細胞排列紊亂,潮線破壞情況嚴重,可見大量細胞增生,炎性細胞浸潤。3個給藥組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)受損現(xiàn)象得到改善,表層逐漸平整光滑,結(jié)構(gòu)清晰,偶見微小裂隙,軟骨細胞及細胞核形態(tài)正常且排列整齊,細胞腫脹和增生情況減少,炎性細胞明顯減少。見圖1。

注:A.對照組;B.模型組;C.黃腐酚低劑量組;D.黃腐酚高劑量組;E.西藥組。

3.4 軟骨組織細胞凋亡率比較

與對照組比較,模型組大鼠軟骨細胞凋亡率升高(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠軟骨細胞凋亡率降低(P<0.05)。與黃腐酚低劑量組比較,黃腐酚高劑量組和西藥組大鼠軟骨細胞凋亡率降低(P<0.05),后2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖2。

注:A.對照組;B.模型組;C.黃腐酚低劑量組;D.黃腐酚高劑量組;E.西藥組。

表4 各組大鼠軟骨組織細胞凋亡率的比較

3.5 mRNA水平比較

與對照組比較,模型組大鼠軟骨組織PI3K、Akt和mTOR mRNA的表達水平升高(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠軟骨組織PI3K、Akt和mTOR mRNA的表達水平降低(P<0.05)。與黃腐酚低劑量組比較,黃腐酚高劑量組和西藥組大鼠軟骨組織PI3K、Akt和mTOR mRNA的表達水平降低(P<0.05),后2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 PI3K、Akt和mTOR mRNA水平的比較

3.6 蛋白水平比較

與對照組比較,模型組大鼠軟骨組織PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白的表達水平升高,Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白的表達水平降低(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠軟骨組織PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白的表達水平降低,Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白的表達水平升高(P<0.05)。與黃腐酚低劑量組比較,黃腐酚高劑量組和西藥組大鼠軟骨組織PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白的表達水平降低,Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白的表達水平升高(P<0.05),后2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表6、圖3。

注:A.對照組;B.模型組;C.黃腐酚低劑量組;D.黃腐酚高劑量組;E.西藥組。

表6 PI3K、Akt、mTOR、Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白水平的比較

4 討論

關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨,能減少相鄰兩骨之間的摩擦,對緩沖運動時產(chǎn)生的壓力起重要作用。KOA的發(fā)病機制較為復(fù)雜,研究表明其發(fā)病不僅是因為關(guān)節(jié)退化,而且與關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡與自噬水平、滑膜和關(guān)節(jié)周圍組織均存在密切聯(lián)系[9]。KOA雖屬于慢性退化疾病,病程較為緩慢,但前期若不及時給予藥物干預(yù),會引起膝關(guān)節(jié)功能喪失,產(chǎn)生嚴重形變,后期疼痛會嚴重影響患者的生活質(zhì)量[10]。此外,KOA還會大大增加患者患心血管疾病的風(fēng)險[11]。黃腐酚具有抗癌、減脂和保護心血管的作用[12-13]。黃腐酚作為高效氧化活性的生物成分,可通過調(diào)控細胞自噬相關(guān)通路蛋白的水平來抑制細胞凋亡[14]。用前后交叉韌帶斷離術(shù)建立KOA模型準確性高、干擾因素少、造模時間短、成本低,通過改變關(guān)節(jié)內(nèi)平衡狀態(tài)造成關(guān)節(jié)受力失衡誘發(fā)KOA,其病程與人類KOA相似[15]。故本研究用前后交叉韌帶斷離術(shù)建立KOA大鼠模型,從分子機制上探討黃腐酚對關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細胞自噬水平的影響。結(jié)果顯示,模型組大鼠軟骨組織學(xué)Mankin’s評分和血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平及細胞凋亡率均升高,表明模型組大鼠軟骨組織受到損傷且伴有炎癥反應(yīng),KOA模型建立成功。不同劑量黃腐酚和西藥治療后大鼠均表現(xiàn)軟骨組織學(xué)Mankin’s評分和血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平及軟骨細胞凋亡率降低,表明大鼠軟骨組織損傷得到修復(fù),軟骨細胞的凋亡得到抑制,炎癥反應(yīng)明顯減輕。此外,軟骨組織HE染色結(jié)果也表明軟骨結(jié)構(gòu)受損現(xiàn)象得到改善,細胞腫脹、炎性細胞浸潤現(xiàn)象減少,進一步驗證黃腐酚對軟骨組織的修復(fù)作用。

自噬是細胞實現(xiàn)自身代謝和細胞器更新的重要方式,細胞通過自噬降解殘余蛋白和老化細胞器,為其他生理活動提供能量[16]。mTOR蛋白是調(diào)控細胞自噬水平的重要通路之一,在調(diào)控炎癥反應(yīng)時,mTOR可作為關(guān)鍵靶蛋白,對自噬水平進行調(diào)控[17-18]。PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活后,會影響多個下游因子的活化狀態(tài)[19],抑制細胞自噬水平,Beclin 1作為自噬水平的負調(diào)控因子,高度參與細胞自噬水平的調(diào)控過程[20]。在本研究中,模型組大鼠軟骨組織PI3K、Akt、mTOR mRNA的表達水平和PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達水平均升高,Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白的表達水平均降低,表明模型組大鼠PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活后,Beclin 1的表達被抑制,細胞自噬水平下降,軟骨細胞凋亡率升高,引起軟骨損傷。與模型組比較,黃腐酚各劑量組和西藥組大鼠軟骨組織PI3K、Akt、mTOR mRNA的表達水平和PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達水平降低,Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白的表達水平升高,可見黃腐酚能夠抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路、提高細胞自噬水平、抑制軟骨細胞凋亡,對大鼠軟骨損傷有積極影響。

綜上所述,黃腐酚能夠提高KOA大鼠細胞自噬水平、減輕炎癥反應(yīng)、抑制軟骨細胞凋亡,可能是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路發(fā)揮作用的,可為臨床治療KOA提供實驗依據(jù)。