郭燕華,劉志強(qiáng),王金平

1.張家口市第一醫(yī)院眼科,張家口 075000;2.河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院眼科,張家口 075100;3.廊坊市人民醫(yī)院眼科,廊坊 065000

青光眼是一種常見的不可逆性致盲性眼病,主要表現(xiàn)為眼壓升高、視神經(jīng)受到壓迫及視力損傷,其病理學(xué)基礎(chǔ)為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡及其所致的特征性視神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能損傷,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,小梁組織變異在其發(fā)病中發(fā)揮重要作用[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)[3],氧化應(yīng)激是小梁網(wǎng)細(xì)胞功能發(fā)生異常的原因之一。白花丹素為中藥白花丹的有效成分之一,具有抗炎、抗氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[4]。研究顯示[5],白花丹素可減輕視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,降低細(xì)胞凋亡率。本研究重點(diǎn)分析白花丹素對小梁網(wǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響,并探討其機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Shellab公司);DMi8-M型倒置相差顯微鏡(德國徠卡微系統(tǒng)有限公司);MODEL550酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 試藥

白花丹素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,批號180214,上海喬羽生物科技有限公司);Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(Kelch like ECH associated protein 1,Keap1)/核因子相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)信號通路抑制劑ML385(批號151123,美國Target Molecule Corp公司);丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX1)試劑盒均購自南京信帆生物技術(shù)有限公司;四唑鹽(MTT)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司);兔抗人Keap1、Nrf2和抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)一抗和山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin,IgG)二抗均購自美國Santa公司。

1.3 細(xì)胞

永生化的人眼小梁細(xì)胞系iHTM購自美國ATCC細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

取人眼小梁細(xì)胞系iHTM,加入含50 mg·L-1胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),溫度為37 ℃。貼壁85%以上開始傳代,傳代3次,取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞分組及處理

取第3代對數(shù)生長期細(xì)胞,分為對照組、抑制劑組、模型組、白花丹素聯(lián)合抑制劑組和白花丹素組。對照組正常培養(yǎng)細(xì)胞,其余4組建立小梁網(wǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型[6]:實(shí)驗(yàn)前取過氧化氫225 μL,溶于完全培養(yǎng)基1 mL中,混勻,制備100 μmol·L-1過氧化氫培養(yǎng)基混合液。小梁網(wǎng)細(xì)胞以50 mg·mL-1蛋白酶消化,細(xì)胞密度為104個(gè)·mL-1,在24孔板內(nèi)接種24 h,觀察細(xì)胞進(jìn)入平臺期,去除原有培養(yǎng)基,PBS沖洗。加100 μmol·L-1過氧化氫培養(yǎng)基混合液1 mL,細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。顯微鏡下觀察正常培養(yǎng)小梁網(wǎng)細(xì)胞、氧化應(yīng)激損傷小梁網(wǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。培養(yǎng)后,抑制劑組以10 μmol·L-1Keap1/Nrf2信號通路抑制劑ML385處理,白花丹素聯(lián)合抑制劑組以10 μmol·L-1ML385和5.0 μmol·L-1白花丹素處理,白花丹素組以5.0 μmol·L-1白花丹素處理,對照組、模型組以等量生理鹽水處理,均處理24 h。

2.3 檢測MDA、SOD和GPX 1

取2.2項(xiàng)下5組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用硫代巴比妥酸法檢測MDA,根據(jù)試劑盒說明書操作,記錄酶標(biāo)儀450、532、600 nm波長處的吸光度(A)值,計(jì)算MDA;用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD,根據(jù)試劑盒說明書操作,記錄酶標(biāo)儀550 nm波長處的A值,計(jì)算SOD。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測GPX 1,根據(jù)試劑盒說明書操作,記錄酶標(biāo)儀450 nm波長處的A值,計(jì)算GPX 1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 檢測細(xì)胞增殖活性

用MTT法檢測。取2.2項(xiàng)下5組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),細(xì)胞密度為104個(gè)·mL-1,接種在96孔板上,觀察細(xì)胞進(jìn)入平臺期,換無血清DMEM培養(yǎng)基,各組復(fù)孔數(shù)均為3,另設(shè)空白孔(僅加20 μL培養(yǎng)液),培養(yǎng)48 h。各孔加5 mg·mL-1MTT溶液20 μL,培養(yǎng)箱孵育1 h,振蕩,除去氣泡。測定各組酶標(biāo)儀450 nm波長處的A值,評估細(xì)胞增殖活性。

2.5 檢測細(xì)胞凋亡率

用流式細(xì)胞儀檢測。取2.2項(xiàng)下5組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),接種在96孔板上,各組復(fù)孔數(shù)均為3。觀察細(xì)胞貼壁后,加胰酶消化。以EP管收集細(xì)胞,PBS清洗。各管加1×binding buffer 200 μL,重懸細(xì)胞。細(xì)胞重懸液加Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測試劑5 μL,避光孵育10 min。各管加7-AAD 5 μL,吹打混勻。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡數(shù),計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù))×100%。

2.6 檢測活性氧

用活性氧特異熒光探針DCFH-DA檢測。取2.2項(xiàng)下5組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),細(xì)胞密度為104個(gè)·mL-1,接種在6孔板內(nèi),各組復(fù)孔數(shù)均為3。觀察細(xì)胞貼壁后,加DCFH-DA溶液(10 μmol·L-1),37 ℃避光孵育20 min。未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA以無血清培養(yǎng)基清洗。各孔加入2.5 g·L-1胰蛋白酶消化,制成細(xì)胞懸液,用流式管收集。用流式細(xì)胞儀測定各組DCF熒光強(qiáng)度,評估活性氧水平。

2.7 檢測Keap1、Nrf2、ARE蛋白的相對表達(dá)量

用蛋白質(zhì)印跡法檢測Keap1、Nrf2、ARE蛋白的相對表達(dá)量。取2.2項(xiàng)下5組細(xì)胞,加蛋白裂解液200 μL,冰上裂解,離心,取上清液?？捡R斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量,加2×上樣緩沖液,沸水浴10 min,變性。100 g·L-1聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)PVDF膜,脫脂奶粉封閉1 h。4 ℃下加兔抗人Keap1(1∶1 000)、Nrf2(1∶1 000)和ARE(1∶1 000)一抗,孵育,過夜,洗膜。37 ℃下加入山羊抗兔二抗IgG(1∶2 500),搖床孵育2 h,洗膜。加入ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影反應(yīng),以Scion Image圖像分析系統(tǒng)分析各條帶的灰度值。蛋白相對含量=各蛋白條帶的灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞形態(tài)

鏡下顯示,正常培養(yǎng)小梁網(wǎng)細(xì)胞外形呈梭形,細(xì)胞貼壁、伸展,折光性良好。氧化應(yīng)激損傷小梁網(wǎng)細(xì)胞大多呈圓卵形、多皺縮、懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)。見圖1。

注:A.正常培養(yǎng)小梁網(wǎng)細(xì)胞;B.氧化應(yīng)激損傷小梁網(wǎng)細(xì)胞。

3.2 MDA、SOD和GPX 1水平

各組間MDA、SOD和GPX 1水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較,其他4組MDA的水平均升高(P<0.01),SOD的水平均降低(P<0.01),GPX 1的水平均降低(P<0.01)。與抑制劑組比較,模型組、白花丹素聯(lián)合抑制劑組和白花丹素組MDA的水平均降低(P<0.01),SOD與GPX 1的水平均升高(P<0.01)。與模型組比較,白花丹素聯(lián)合抑制劑組、白花丹素組MDA水平降低(P<0.01),GPX 1水平升高(P<0.01),而且白花丹素組3項(xiàng)水平的變化更顯著(P<0.01)。見表1。

表1 各組MDA、SOD和GPX 1水平比較

3.3 細(xì)胞增殖活性

各組間細(xì)胞增殖活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較,其他4組細(xì)胞增殖活性均升高(P<0.01)。與抑制劑組比較,模型組、白花丹素聯(lián)合抑制劑組和白花丹素組的細(xì)胞增殖活性均降低(P<0.01)。與模型組比較,白花丹素聯(lián)合抑制劑組、白花丹素組的細(xì)胞增殖活性均降低(P<0.01),白花丹素組的細(xì)胞增殖活性最低(P<0.01)。見表2。

表2 各組A值的比較

3.4 細(xì)胞凋亡率

各組間細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較,其他4組的細(xì)胞凋亡率均升高(P<0.01)。與抑制劑組比較,模型組、白花丹素聯(lián)合抑制劑組和白花丹素組的細(xì)胞凋亡率均降低(P<0.01)。與模型組比較,白花丹素聯(lián)合抑制劑組、白花丹素組的細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01),白花丹素組的細(xì)胞凋亡率最低(P<0.01)。見圖2、表3。

表3 各組細(xì)胞凋亡率的比較

注:A.對照組;B.抑制劑組;C.模型組;D.白花丹素聯(lián)合抑制劑組;E.白花丹素組。

3.5 活性氧

各組間的活性氧水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較,其他4組活性氧的水平均升高(P<0.01)。與抑制劑組比較,模型組、白花丹素聯(lián)合抑制劑組和白花丹素組活性氧的水平均降低(P<0.01)。與模型組比較,白花丹素聯(lián)合抑制劑組、白花丹素組活性氧的水平降低(P<0.01),白花丹素組活性氧的水平最低(P<0.01)。見表4。

表4 各組活性氧水平的比較

3.6 Keap1、Nrf2和ARE蛋白的相對表達(dá)量

各組間Keap1、Nrf2和ARE蛋白相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較,其他4組Keap1蛋白的相對表達(dá)量升高(P<0.01),Nrf2蛋白的相對表達(dá)量降低(P<0.01),ARE蛋白的相對表達(dá)量降低(P<0.01)。與抑制劑組比較,模型組、白花丹素聯(lián)合抑制劑組和白花丹素組Keap1蛋白的相對表達(dá)量均降低(P<0.01),Nrf2與ARE蛋白的相對表達(dá)量均升高(P<0.01)。與模型組比較,白花丹素聯(lián)合抑制劑組、白花丹素組Keap1蛋白的相對表達(dá)量降低(P<0.01),Nrf2與ARE蛋白的相對表達(dá)量升高(P<0.01),而且白花丹素組3項(xiàng)水平的變化更顯著(P<0.01)。見圖3、表5。

表5 各組Keap1、Nrf2、ARE蛋白的相對表達(dá)量比較

注:A.對照組;B.抑制劑組;C.模型組;D.白花丹素聯(lián)合抑制劑組;E.白花丹素組。

4 討論

青光眼是一種以視神經(jīng)萎縮和視野缺損為特征的疾病,雖然高眼壓為導(dǎo)致其發(fā)病的主要因素,但目前研究也發(fā)現(xiàn)一些協(xié)同致病因素,如血管異常、一氧化氮代謝異常和由氧自由基過多引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷等[7-8]。氧化應(yīng)激損傷可導(dǎo)致小梁網(wǎng)細(xì)胞出現(xiàn)與青光眼類似的改變,而預(yù)先用抗氧化藥物處理可減弱這些改變[9]。

白花丹為我國傳統(tǒng)中藥之一,可祛風(fēng)除濕、消腫散瘀、解毒消瘡、活血化瘀,具有抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗腫瘤等作用[10]。白花丹素為白花丹的有效成分之一,其醌環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)酚羥基可通過中斷油脂氧化過程發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[11]。白花丹素可減輕肝損傷大鼠血清氧化應(yīng)激反應(yīng),其作用機(jī)制可能與白花丹素提高肝細(xì)胞抗氧化的能力有關(guān)[12]。研究顯示[13],白花丹素可抑制免疫球蛋白A腎病大鼠活性氧的形成,減輕氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制腎臟組織細(xì)胞凋亡。還有學(xué)者提出[14],白花丹素可抑制視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖,有效預(yù)防、治療增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變,但目前就白花丹素對青光眼小梁網(wǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用尚無明確定論。本研究結(jié)果顯示,用白花丹素處理后的細(xì)胞MDA水平降低,SOD、GPX 1水平升高,細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞凋亡率降低,活性氧含量減少,表明白花丹素可減輕小梁網(wǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,抑制細(xì)胞增殖、凋亡,促進(jìn)細(xì)胞存活。

Keap1/Nrf2信號通路是調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激、維持氧化還原平衡的重要通路,其中Keap1為細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要調(diào)控因子,Nrf2是細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵協(xié)調(diào)者,可維持細(xì)胞氧化-抗氧化平衡[15-16]。一旦出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷,Keap1內(nèi)半胱氨酸殘基出現(xiàn)修飾,可改變Keap1構(gòu)象,導(dǎo)致Nrf2易位到細(xì)胞核,并與ARE結(jié)合,調(diào)節(jié)抗氧化酶表達(dá),對抗氧化應(yīng)激損傷。Keap1表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致Nrf2活性及穩(wěn)定性降低,增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)[17]。黃金玲等[18]提出,通過調(diào)控Keap1、Nrf2表達(dá),可增強(qiáng)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜抗氧化能力,保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。研究顯示[19],白花丹素可通過調(diào)控Nrf2通路發(fā)揮抗氧化作用。另外,王曉莉等[20]研究還發(fā)現(xiàn),老年性青光眼患者小梁網(wǎng)組織中Keap1呈高表達(dá),Nrf2、ARE呈低表達(dá),其表達(dá)水平與氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。

本研究中,與對照組比較,模型組Keap1蛋白的相對表達(dá)量升高,Nrf2、ARE蛋白的相對表達(dá)量降低,與上述研究結(jié)果一致,表明Keap1/Nrf2信號通路可能在青光眼小梁網(wǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮一定作用,推測激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路可能有利于控制病情的發(fā)展。本研究結(jié)果還顯示,用白花丹素處理后的細(xì)胞Keap1蛋白的相對表達(dá)量降低,Nrf2、ARE蛋白的相對表達(dá)量升高,并通過Keap1/Nrf2通路抑制劑得到進(jìn)一步驗(yàn)證,表明白花丹素可激活Keap1/Nrf2信號通路,推測是白花丹素緩解小梁網(wǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的重要作用機(jī)制之一。

綜上所述,白花丹素可緩解小梁網(wǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡,其作用機(jī)制可能與激活Keap1/Nrf2信號通路有關(guān)。本研究局限之處在于僅分析了白花丹素通過Keap1/Nrf2信號通路發(fā)揮的作用,今后仍需進(jìn)一步深入分析。