熊 波,桑吉東知,倪梁紅,夏 云*

1.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科,上海 201999;2.西藏自治區(qū)藏醫(yī)院生藥研究所,拉薩 850000;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,上海 201203

粗壯秦艽GentianarobustaKing ex Hook. f.為龍膽科秦艽組多年生草本植物的根,分布于我國(guó)西藏南部,用藥歷史悠久,為藏藥“解吉”的原植物來(lái)源之一,具有散風(fēng)祛濕、清熱利膽、舒筋止痛之功效,臨床上主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、低熱盜汗、黃疸型肝炎、麻風(fēng)毒熱及各種出血腫脹等“赤巴病”[1-3]。粗壯秦艽是許多中成藥的主要原料,如十三味榜嘎散、二十五味大湯丸等[4]。目前,對(duì)粗壯秦艽的研究主要集中在物種基原鑒定方面[5-10],僅有少量研究報(bào)道了粗壯秦艽中含有龍膽苦苷、馬錢(qián)苷酸、獐牙菜苦苷等環(huán)烯醚萜類(lèi)及部分櫟癭酸、谷甾醇等成分[11-12],隨著對(duì)其藥理作用和臨床應(yīng)用研究的推進(jìn),對(duì)其化學(xué)成分的快速表征成為急需解決的問(wèn)題。

常規(guī)的中藥化學(xué)成分分析方法包括提取、分離、鑒定和波譜結(jié)構(gòu)解析等過(guò)程,整個(gè)過(guò)程繁瑣、周期長(zhǎng)、需要的技術(shù)成本高、損耗的資源多,并且由于對(duì)分離成分的盲目性,會(huì)導(dǎo)致被分離成分的重復(fù)或遺漏[13-15]。超高效液相色譜-電噴霧/四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS)技術(shù)具有高效、快速及分辨率、靈敏度、準(zhǔn)確性均高的優(yōu)點(diǎn),在化學(xué)成分的定性分析中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),在中藥化學(xué)成分的研究中占有重要的地位,與高效液相色譜(HPLC)法相比可大大縮短分析時(shí)間[16-18]。

本實(shí)驗(yàn)用UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)粗壯秦艽中的化學(xué)成分進(jìn)行快速表征,用對(duì)照品及參考文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)對(duì)需要鑒定的化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定[15],為粗壯秦艽化學(xué)成分的提取分離及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY UPLC?-I-CLASS/XEVO G2-XS Qtof(沃特世科技有限公司);ME204E電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司);DFY-X300高效多功能粉碎機(jī)(溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司);KQ-800DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);ELGA超純水系統(tǒng)(英國(guó)ELGA Lab Water公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品:馬錢(qián)苷酸(批號(hào)P01A9L67130)、龍膽苦苷(批號(hào)Y30J9Q66926)、獐芽菜苦苷(批號(hào)Y25J10H91429)、獐芽菜苷(批號(hào)P25O10F101344),質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%,均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;乙腈、甲醇為色譜純(默克股份兩合公司);水為ELGA系統(tǒng)純化水;其余試劑均為分析純。

粗壯秦艽于2019年10月采自西藏自治區(qū)山南市乃東區(qū)亞堆鄉(xiāng)。經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院倪梁紅副教授鑒定為GentianarobustaKing ex Hook. f.的根,樣品編號(hào)分別為CZ13-1、CZ13-2、CZ13-3、CZ14-1、CZ14-2、CZ14-3、CZ15-1、CZ15-2、CZ15-3;批號(hào)分別為CZ20191013-1、CZ20191013-2、CZ20191013-3、CZ20191014-1、CZ20191014-2、CZ20191014-3、CZ20191015-1、CZ20191015-2、CZ20191015-3。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

分別取粗壯秦艽樣品,粉碎成粉,過(guò)60目篩,每份0.5 g,精密稱(chēng)定質(zhì)量,分別置于錐形瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇25 mL,精密稱(chēng)定質(zhì)量,超聲處理(500 W,40 kHz)30 min,冷卻,補(bǔ)足質(zhì)量,取上清液,經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò),即得供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取馬錢(qián)苷酸對(duì)照品、獐芽菜苦苷對(duì)照品、龍膽苦苷對(duì)照品、獐牙菜苷對(duì)照品,精密稱(chēng)定,用甲醇溶解,分別制成含馬錢(qián)苷酸1.0 mg·mL-1、獐芽菜苦苷1.06 mg·mL-1、龍膽苦苷1.0 mg·mL-1、獐牙菜苷1.04 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取上述儲(chǔ)備液馬錢(qián)苷酸200 μL、獐牙菜苦苷100 μL、龍膽苦苷500 μL、獐牙菜苷50 μL,加甲醇至2 mL,混合均勻,即得馬錢(qián)苷酸100 μg·mL-1、獐牙菜苦苷50 μg·mL-1、龍膽苦苷260 μg·mL-1、獐牙菜苷26.5 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相為1 mL·L-1甲酸水溶液(A)-乙腈(B),流速為0.4 mL·min-1;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量為1 μL;梯度洗脫條件為0～ 5 min,95% A;5～10 min,95%～88% A;10～15 min,88%～72% A;15～20 min,72%～45% A;20～25 min,45%～20% A;25～30 min,20% A。

2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧(ESI)離子源,正、負(fù)離子模式下的Continuum模式。掃描范圍為m/z100～1 200 Da,掃描時(shí)間為0.1 s,毛細(xì)管電壓正離子為3 000 V,負(fù)離子為2 500 V;噴嘴電壓為40 V;干燥氣流速為800 L·h-1;離子源溫度為120 ℃;碰撞氣體為氬氣;碰撞能為20～50 eV,用Lock Mass通路對(duì)采集的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。

2.5 數(shù)據(jù)采集與篩選

用MassLynx 4.1軟件采集、管理和篩選UPLC-Q-TOF-MS/MS數(shù)據(jù)。根據(jù)出峰情況,進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,在正式分析樣本前,根據(jù)出峰情況,需進(jìn)2～3針?biāo)袠悠返幕旌衔?QC)以平衡系統(tǒng),然后每隔8～10個(gè)樣本進(jìn)1針QC,用于檢測(cè)和評(píng)估在組學(xué)樣本采集過(guò)程中儀器的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。通過(guò)對(duì)所有樣品的總離子流圖(TIC)進(jìn)行比較,篩選代表性樣品進(jìn)行質(zhì)譜解析。

2.6 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)UNIFI?科學(xué)信息系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)的瀏覽、存儲(chǔ)和綜合分析等。設(shè)置一定的篩選條件,根據(jù)測(cè)得的精確相對(duì)分子質(zhì)量設(shè)置一定的誤差范圍,一般為±6 ppm(1 ppm=1×10-6,下同),計(jì)算可能的元素組成,基于其內(nèi)置的質(zhì)譜分析平臺(tái),包括ChemSpider在線數(shù)據(jù)庫(kù)(PubMed、PubChem、MassBank等)和中藥數(shù)據(jù)庫(kù)(TCM Chiese[UNIFI1.9])進(jìn)行自動(dòng)匹配及篩選。結(jié)合保留時(shí)間、提取的MS和MS/MS質(zhì)譜圖和相關(guān)碎片信息,綜合文獻(xiàn)已報(bào)道的秦艽化學(xué)成分、裂解規(guī)律和對(duì)照品信息進(jìn)行篩選和鑒定,完成其主要化學(xué)成分的判別分析。

2.7 UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS定性分析結(jié)果

在色譜、質(zhì)譜條件下,測(cè)定正、負(fù)離子模式下的總離子流圖,粗壯秦艽居群1批號(hào)CZ20191013-1樣品的總離子流圖見(jiàn)圖1。用UNIFI軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,通過(guò)高分辨質(zhì)譜信息推測(cè)其可能的分子式,質(zhì)譜偏差范圍δ≤2.23×10-6。通過(guò)質(zhì)譜信息結(jié)合秦艽數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)文獻(xiàn),對(duì)化合物進(jìn)行指認(rèn)并結(jié)合化合物的質(zhì)譜及其裂解規(guī)律對(duì)化合物進(jìn)行分析和鑒定。共鑒定出39 個(gè)化合物,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 粗壯秦艽的化學(xué)成分質(zhì)譜鑒定結(jié)果

注:A.負(fù)離子模式;B.正離子模式;1.蔗糖;2.8-羥基-10-羥基獐芽菜苷;3.8-表番木鱉酸;4.secologanic acid;5.馬錢(qián)苷酸;6.山梔苷甲酯;7.莫諾苷;8.secologanoside;9.秦艽苷A;10.3′-O-β-D-葡萄吡喃糖基-龍膽苦苷;11.獐芽菜苦苷;12.紫藥苦苷;13.龍膽苦苷;14.紅白金花內(nèi)酯;15.阿魏酸;16.8-O-乙酰山梔苷甲酯;17.2′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷;18.獐芽菜苷;19. 4′-O-β-D-葡萄吡喃糖基-龍膽苦苷;20.異葒草素;21.1H-2-benzopyran-1-one, 8-(β-D-glucopyranosyloxy)-3,4-dihydro-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-,(3S)-;22.皂草黃苷;23.異牡荊苷;24.大葉苷C;25.大葉苷D;26.rindoside;27.gentimacroside;28.三花苷;29.2-甲氧基鱔藤酸;30.1β,2α,3α,24-tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid;31.2α,3β,24-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid ;32.1α,2α,3β,24-tetrahydroxyursa-12,20(30)-dien-28-oic acid;33.3β,6α,24-trihydroxyolean-12-en-28-oic acid ;34.3,24-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid;35.齊墩果酸;36.熊果酸;37.豆甾醇;38.櫟癭酸;39.科羅索酸。

2.7.1環(huán)烯醚萜類(lèi)成分鑒定 環(huán)烯醚萜是一類(lèi)特殊的單萜化合物,多具有環(huán)戊烷及半縮醛的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。在二級(jí)質(zhì)譜圖中,環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物通常會(huì)丟失中性分子(如CO2、H2O)、脫去糖等及二氫吡喃環(huán)的斷裂[19]。

峰5的母核離子m/z375,在負(fù)離子模式下響應(yīng)值較好,加合物為[M-H]-,在質(zhì)譜偏差范圍δ≤2.23×10-6的條件下,通過(guò)高分辨質(zhì)譜推測(cè)其分子式為C16H24O10。其在二級(jí)質(zhì)譜圖中的特征碎片離子有m/z213[M-H-C6H11O5]-,m/z[M-H-C6H11O5-CHO2]-,m/z151[M-H-C6H11O5-CHO2-H2O]-,m/z125,m/z113,m/z107。其中m/z169、m/z125、m/z107是二氫吡喃環(huán)上的開(kāi)裂。m/z151是在m/z169的基礎(chǔ)上失去一個(gè)H2O。m/z113是母核只剩下糖鏈。根據(jù)峰5的質(zhì)譜信息及裂解規(guī)律,結(jié)合文獻(xiàn)并與馬錢(qián)苷酸對(duì)照品的質(zhì)譜信息對(duì)比,鑒定峰5為馬錢(qián)苷酸,相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

注:A.馬錢(qián)苷酸;B.獐芽菜苦苷;C.龍膽苦苷;D.獐牙菜苷;E.科羅索酸;F.皂草黃苷。

峰11的母核離子m/z419,加合物為[M+HCOO]-,在質(zhì)譜偏差范圍δ≤2.23×10-6的條件下,通過(guò)高分辨質(zhì)譜推測(cè)其分子式為C16H22O10。其在二級(jí)質(zhì)譜圖中的特征碎片離子有m/z141[M+HCOO-C10H17O6]-。m/z141是糖苷鍵斷裂丟失環(huán)烯醚萜母核后留下的碎片。根據(jù)峰11的質(zhì)譜信息及裂解規(guī)律,結(jié)合文獻(xiàn)并與獐芽菜苦苷對(duì)照品的質(zhì)譜信息對(duì)比,鑒定峰11為獐芽菜苦苷,相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

峰13的母核離子m/z401,加合物為[M+HCOO]-,在質(zhì)譜偏差范圍δ≤2.23×10-6的條件下,通過(guò)高分辨質(zhì)譜推測(cè)其分子式為C16H20O9。其在二級(jí)質(zhì)譜圖中的碎片離子有m/z193[M+HCOO-C6H11O5]-、179[M+HCOO-C10H9O3]-、149[M+HCOO-C7H12O7]-。其中m/z193是糖苷鍵斷裂失去一個(gè)糖分子,m/z179是環(huán)烯醚萜母核的丟失,m/z149是環(huán)烯醚萜母核上二氫吡喃環(huán)斷裂后留下的碎片。根據(jù)峰13的質(zhì)譜信息及裂解規(guī)律,結(jié)合文獻(xiàn)并與龍膽苦苷對(duì)照品的質(zhì)譜信息對(duì)比,鑒定峰13為龍膽苦苷,相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

峰18的母核離子m/z403,加合物為[M+HCOO]-,在質(zhì)譜偏差范圍δ≤2.23×10-6的條件下,通過(guò)高分辨質(zhì)譜推測(cè)其分子式為C16H22O9。其在二級(jí)質(zhì)譜圖中的特征碎片離子有m/z195[M+HCOO-C6H11O5]-、m/z125[M+HCOO-C10H17O6]-,其中m/z195是糖苷鍵斷裂失去一個(gè)糖分子,m/z125是糖苷鍵斷裂失去環(huán)烯醚萜母核和糖上的部分側(cè)鏈。根據(jù)峰18的質(zhì)譜信息及裂解規(guī)律,結(jié)合文獻(xiàn)并與獐芽菜苷對(duì)照品的質(zhì)譜信息對(duì)比,鑒定峰18為獐芽菜苷,相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

2.7.2三萜類(lèi)成分鑒定 三萜的裂解規(guī)律[20]:①當(dāng)C環(huán)內(nèi)有雙鍵時(shí),一般都有較特征的逆狄爾斯-阿爾德反應(yīng)(retro Diels-Alder reaction,RDA反應(yīng))裂解;②當(dāng)C環(huán)內(nèi)無(wú)雙鍵時(shí),則常從C環(huán)斷裂成2個(gè)碎片;③有時(shí)RDA裂解和C環(huán)斷裂同時(shí)發(fā)生。

峰39的母核離子m/z471,在負(fù)離子模式下響應(yīng)值較好,加合物為[M-H]-,在質(zhì)譜偏差范圍δ≤2.23×10-6的條件下,通過(guò)高分辨質(zhì)譜推測(cè)其分子式為C30H48O4。其在二級(jí)質(zhì)譜中的特征碎片離子有m/z427[M-H-COOH]-、m/z409[M-H-COOH-OH]-、m/z393[M-H-COOH-OH-CH2]-、m/z125[M-H-C22H34O2-OH]-,其中m/z427、m/z409、m/z393均為側(cè)鏈斷裂,m/z125是化合物A環(huán)、B環(huán)同時(shí)斷裂所得到的碎片離子峰。根據(jù)其高分辨質(zhì)譜信息、碎片離子信息、裂解規(guī)律及相關(guān)文獻(xiàn)推測(cè)峰39為科羅索酸,相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

2.7.3黃酮類(lèi)成分鑒定 黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)C6-C3-C6單元的含氧雜環(huán)天然有機(jī)化合物,生物合成途徑為桂皮酸途徑。在二級(jí)質(zhì)譜中,黃酮苷元主要發(fā)生RDA裂解。黃酮苷元通過(guò)RDA裂解產(chǎn)生的主要碎片離子是通過(guò)C環(huán)上的C-C和C-O鍵的斷裂產(chǎn)生的Ai,j、Bi,j離子,i和j為C環(huán)上斷裂鍵的位置,常見(jiàn)的碎片還有中性分子,如CO、CO2、H2O等[21]。

峰22的母核離子m/z639,加合物為[M+HCOO]-,在質(zhì)譜偏差范圍δ≤2.23×10-6的條件下,通過(guò)高分辨質(zhì)譜推測(cè)其分子式為C27H30O15。其在二級(jí)質(zhì)譜中的特征碎片離子有m/z315[M+HCOO-C14H15O6]-、m/z281[M+HCOO-C14H17O8]、m/z153[M+HCOO-C20H25O11]-。其中m/z315是化合物黃酮C環(huán)1和2位C-O鍵的斷裂、3和4位C-C鍵的斷裂以及A環(huán)上7位糖苷鍵斷裂失去一分子糖得到的分子離子峰,m/z281是母核上脫去一個(gè)B環(huán)、A環(huán)上7位糖苷鍵斷裂失去一分子糖以及A環(huán)上6位所連糖分子上部分鍵發(fā)生斷裂所得到的分子離子峰,m/z153.017 17是化合物黃酮C環(huán)1和2位C-O鍵斷裂、3和4位C-C鍵斷裂以及A環(huán)上6和7位糖苷鍵斷裂失去兩分子糖得到的分子離子峰。根據(jù)其高分辨質(zhì)譜信息、碎片離子信息、裂解規(guī)律及相關(guān)文獻(xiàn)推測(cè)峰22為皂草黃苷,相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

2.7.4其他類(lèi)成分鑒定 粗壯秦艽的其他類(lèi)成分包括糖類(lèi)、甾類(lèi)、氧萘類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、酯類(lèi)等。峰1的保留時(shí)間tR為0.59 min,在負(fù)離子模式下有較好的響應(yīng)值,加合物為[M-H]-,根據(jù)高分辨質(zhì)譜信息、碎片離子信息、裂解規(guī)律及相關(guān)文獻(xiàn),鑒定峰1為蔗糖。峰15的保留時(shí)間tR為5.72 min,在正離子模式下有較好的響應(yīng)值,加合物為[M+H]+,根據(jù)高分辨質(zhì)譜信息、碎片離子信息、裂解規(guī)律及相關(guān)文獻(xiàn),鑒定峰15為阿魏酸。峰24的保留時(shí)間tR為10.86 min,在負(fù)離子模式下響應(yīng)值較好,加合物為[M+HCOO]-,根據(jù)高分辨質(zhì)譜信息、碎片離子信息、裂解規(guī)律及相關(guān)文獻(xiàn),鑒定峰24為大葉苷C。

3 討論

本研究首次用UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技術(shù)在正、負(fù)離子模式下對(duì)粗壯秦艽中各化學(xué)成分進(jìn)行了化學(xué)成分定性分析,通過(guò)各色譜峰在質(zhì)譜中的精確相對(duì)分子質(zhì)量、碎片信息、質(zhì)譜裂解規(guī)律和色譜保留規(guī)律,并結(jié)合對(duì)照品的質(zhì)譜信息和參考文獻(xiàn),鑒定出粗壯秦艽中的39個(gè)化合物,主要包括環(huán)烯醚萜類(lèi)、三萜類(lèi)和黃酮類(lèi)。對(duì)所有居群的粗壯秦艽樣品進(jìn)行分析,共檢出35個(gè)共有成分。在CZ13居群中檢測(cè)出全部的39種成分,在CZ14居群中未檢測(cè)到gentimacroside、紅白金花內(nèi)酯和阿魏酸,在CZ15居群中未檢測(cè)到gentimacroside、三花苷。不同居群粗壯秦艽中未檢測(cè)出的成分各有不同,這可能與其所處地理環(huán)境及土壤等因素不同有關(guān),針對(duì)這些差異化合物可進(jìn)一步深入研究,或可考慮將其作為鑒定粗壯秦艽真?zhèn)蔚奶卣餍猿煞?為建立粗壯秦艽的質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)體系提供參考。

《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》)規(guī)定的秦艽品種野生資源嚴(yán)重匱乏,臨床用藥供應(yīng)不足,而廣泛分布于我國(guó)西南、西北地區(qū)的粗壯秦艽,資源較豐富,本實(shí)驗(yàn)為鑒定粗壯秦艽中具有生物活性的成分提供了一種快速、簡(jiǎn)便、可靠的手段,可為粗壯秦艽藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量評(píng)價(jià)等方面的研究提供數(shù)據(jù)支撐,為確定《中國(guó)藥典》中規(guī)定的秦艽的替代資源提供一定科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。