樊秦凱 楊晨光 胡書新 徐春華 李明 陸穎?
1) (中國科學(xué)院物理研究所,北京凝聚態(tài)物理國家研究中心,軟物質(zhì)物理重點實驗室,北京 100190)
2) (中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)
單分子表面誘導(dǎo)熒光衰逝(single molecule surface-induced fluorescence attenuation,smSIFA)技術(shù)是一種基于二維材料受體、用于研究生物大分子法向運動的精密測量方法,該方法不受二維平面運動的干擾.作為受體的二維材料,其特征淬滅距離決定法向上探測的距離和精度.近年來以氧化石墨烯(graphene oxide,GO)和石墨烯作為介質(zhì)受體的SIFA 技術(shù)在生物大分子的研究中發(fā)揮了重要作用,但石墨烯和GO 具有固定的特征淬滅距離,探測范圍有限.調(diào)整探測范圍需要更換介質(zhì)材料,面臨材料選擇與制備的困難,亟需開發(fā)用于技術(shù)的可調(diào)控材料.本文改良了以GO 為介質(zhì)受體的單分子SIFA 技術(shù),利用熱還原的方法對GO 進行還原,通過控制還原溫度,制備出了還原程度不同的還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide,rGO),調(diào)控特征淬滅距離,利用熒光標(biāo)記的DNA 測量rGO 的特征淬滅距離.將rGO 用于單分子SIFA 技術(shù),對Holliday junction 構(gòu)象變化的觀察,論證了rGO 的探測范圍.
單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(single molecule fluorescence resonance energy transfer,smFRET)是研究生物大分子動力學(xué)過程的常用方法,具有較高的時間和空間分辨率[1-4].膜蛋白是生物膜功能的主要承擔(dān)者,在細(xì)胞內(nèi)約有1/3 的基因編碼膜蛋白[5].研究膜蛋白在細(xì)胞膜上的取向和插膜深度對于理解其結(jié)構(gòu)與功能至關(guān)重要[6,7].由于細(xì)胞膜具有流動性,處于細(xì)胞膜上的膜蛋白會發(fā)生橫向位移,將FRET 用于膜蛋白的研究時具有局限性[8-10].近年來基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理發(fā)展的表面誘導(dǎo)熒光衰逝(surface-induced fluorescence attenuation,SIFA)技術(shù)是將二維介質(zhì)作為熒光受體,通過分析其對熒光供體的光強衰逝程度,可以計算出熒光供體距和材料表面的法向距離[11,12].熒光衰逝效率和供體距介質(zhì)表面法向距離的關(guān)系由(1)式描述:
式中:I0為沒有介質(zhì)存在時熒光供體的初始強度;I為當(dāng)介質(zhì)存在時測得的供體熒光強度;d0為介質(zhì)的特征淬滅距離,是I/I0=0.5 時熒光供體和介質(zhì)表面的法向距離.在選擇二維介質(zhì)作為熒光受體時不僅要考慮到材料的親生物性,同時還要考慮到材料的光學(xué)性能以及制備難易度.近年來基于氧化石墨烯(graphene oxide,GO)的SIFA 方法在膜蛋白的研究中有著廣泛的應(yīng)用[13,14],基于石墨烯的單分子熒光成像也取得了一定成果[15,16].以往研究表明,GO 的d0=4 nm[11],石墨烯的d0≈ 18 nm[16-18].GO 的d0較小,適合探測距離其表面2—6 nm 范圍內(nèi)的信號[11];石墨烯的d0較大,適合探測距離其表面12 nm 以外的區(qū)域[16].圖1(a)展示了利用GO和石墨烯作為介質(zhì)受體時的局限,以石墨烯和GO作為介質(zhì)受體時并不能全方位的覆蓋近細(xì)胞膜表面的區(qū)域,存在無法探測的區(qū)間.圖1(b)展示了不同d0的距離淬滅曲線,在d0附近衰減曲線的斜率最大,探測的靈敏度最高,當(dāng)熒光供體距離介質(zhì)表面較近或較遠(yuǎn)時探測的靈敏度顯著下降.不同的二維材料的d0不同,能夠探測的范圍不同,進行SIFA實驗時需要根據(jù)目標(biāo)大分子的尺寸以及熒光標(biāo)記位點等信息來選擇具有目標(biāo)d0的材料.
圖1 調(diào)控d0 的SIFA 方法 (a) SIFA 方法示意圖;(b) 熒光供體光強衰減和表面距離的關(guān)系;(c) SIFA 探測靈敏度和熒光供體距表面距離的關(guān)系Fig.1.SIFA method of adjustable d0: (a) Schematic representation of SIFA method;(b) relationship between degree of attenuation of a fluorescent donor and donor-surface distance;(c) relationship between detection sensitivity of SIFA and donor-surface distance.
SIFA 方法探測熒光供體距離細(xì)胞膜法向距離的變化是通過測量供體的光強來實現(xiàn)的,因此SIFA的靈敏度受制于儀器對于熒光供體光強的探測.通常認(rèn)為儀器能夠分辨的光強變化率約為10%[11],基于此可以利用(1)式計算出不同d0的距離探測靈敏度.圖1(c)展示了SIFA 探測的距離靈敏度曲線,GO 的d0=4 nm,在d0附近的探測靈敏度可以接近0.5 nm,在距離其表面2—6 nm 的范圍內(nèi)可以實現(xiàn)1 nm 的分辨率,然而一旦超出3—6 nm 的靈敏范圍之后,GO 的探測分辨率將低至3 nm,并且隨著距離的增加分辨率呈指數(shù)下降.當(dāng)d0提高到10 nm 時,雖然能夠探測距離介質(zhì)表面距離更遠(yuǎn)范圍的熒光信號,但即便是在最靈敏的d0附近也只能實現(xiàn)1 nm 的探測精度.在進行SIFA 實驗時,如果要實現(xiàn)1 nm 的空間分辨率,則介質(zhì)受體的d0應(yīng)不大于10 nm.如圖1(c)所示,要對介質(zhì)受體表面12 nm 以內(nèi)的生物大分子進行探測,以彌補石墨烯和GO 探測的局限,并保證1 nm 的空間分辨率,需要對d0在4—10 nm 之間進行連續(xù)調(diào)節(jié).制備d0在3—10 nm 的介質(zhì)材料并用于SIFA實驗來觀察生物大分子面臨材料選擇和制備的困難.有研究表明,對石墨烯進行通電使其氧化可以減小d0,但石墨烯氧化具有不均勻性[19].還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide,rGO)是GO 通過加熱、化學(xué)和電學(xué)等方法進行還原后所得到的材料,rGO制備方便,且物理和化學(xué)性質(zhì)和石墨烯接近[20-22].有研究表明,rGO 對熒光的淬滅效果介乎與GO 和石墨烯之間[23,24],但rGO 仍缺乏單分子熒光成像的應(yīng)用.本文采用熱還原方法制備rGO,并用于單分子熒光成像.通過熒光白標(biāo)記的雙鏈DNA 標(biāo)尺精確測量了不同還原程度rGO 的d0,改良了已有的SIFA 技術(shù),并通過與GO進行對比,驗證了rGO-SIFA 技術(shù)的優(yōu)勢.
GO 分散液制作方法參照 Hummers 方法[25,26].取1 g NaNO3,46 mL H2SO4以及1 g 石墨,于0 ℃溫度下混合均勻,對混合物進行冰浴以保持其環(huán)境溫度為0 ℃,并向混合物中緩慢加入6 g KMnO4.此后不斷攪拌約2 h,而后將混合物整體移至35 ℃繼續(xù)攪拌2 h,將120 mL 去離子水緩慢加入混合溶液中(30 min),最后將6 mL H2O2(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%)緩慢加入混合溶液中,并培養(yǎng)20 min 左右.超高速離心(15000 r/min) 20 min 制得的混合溶液,去除上清液,將得到的沉淀再次分散溶于去離子水中,進行超聲(100 W,30 min),對多層氧化石墨進行剝離.對溶液進行低速離心(1000 r/min)10 min,去除沉淀保留上清液,重復(fù)該步驟3—4 次,直到不再出現(xiàn)明顯的沉淀.將收集到的溶液進一步離心,每次離心取走上清液后將沉淀再次溶解進行下一次離心.分別以8000,6000,4000 r/min離心25 min,4000 r/min 離心后的沉淀溶解后再次以2000 r/min 離心25 min,所得到的上清液即為實驗所用的GO 分散液.
用硝酸纖維素膜(直徑47 mm,孔徑0.2 mm,Whatman)對制備的GO 分散液進行真空抽濾[27],所形成的薄膜自然晾干之后從濾膜上分離下來.剪取少量GO 薄膜,用2 片干凈的蓋玻片將GO 薄膜夾在中間,放置于真空管式爐內(nèi)烘烤,升溫速度設(shè)為8 ℃/ min,升溫至目標(biāo)溫度后維持2 h,而后自然冷卻至室溫.將加熱還原后的rGO 薄膜與GO薄膜在中國科學(xué)院物理研究所的X 射線光電子能譜儀(XPS,Thermo Fisher Scientific ESCALAB 250X)上測量結(jié)合能,所用X-射線源為單色化的鋁Kα射線,能量為1486.6 eV.
rGO-SIFA 實驗包含rGO-SIFA 樣品腔室制備、單分子熒光實驗材料與樣品制備,以及熒光觀測三部分.
2.3.1 rGO-SIFA 樣品腔室的制備過程
實驗所用的蓋玻片需要清洗掉表面的熒光雜質(zhì),以免對單分子熒光成像實驗造成影響.具體清洗流程是先使用丙酮對蓋玻片超聲清洗30 min,然后用去離子水超聲清洗洗去丙酮殘留,再用甲醇超聲清洗30 min,并在超聲清洗結(jié)束后用去離子水超聲清洗洗去甲醇?xì)埩?用1 mol/L 的NaOH溶液對蓋玻片進行超聲清洗,每次清洗10 min 后更換NaOH 溶液,共超聲清洗3 次,得到干凈且沒有熒光雜質(zhì)的蓋玻片.
利用LB(Langmuir-Blodgett)技術(shù)將GO 分散液中的單層GO 轉(zhuǎn)移至清洗干凈的蓋玻片上[28],將另一塊干凈的蓋玻片覆蓋其上,放置于真空管式爐內(nèi)烘烤,升溫速度設(shè)為8 ℃/min,升溫至目標(biāo)溫度后維持2 h,而后自然冷卻至室溫.用雙面膠將rGO 蓋玻片和清洗干凈的載玻片黏合在一起,做成適合裝載在全內(nèi)反射熒光顯微鏡上的樣品腔室.
2.3.2 單分子熒光實驗材料與樣品制備
實驗所用的DNA 序列采購于上生工生物工程(上海)股份有限公司,雙鏈DNA 的序列為TATGGTCAACTGCTGAGCGTAG-biotin,ATACCAGTTGACGACTCGCAT.DNA Holiday junction 的4 條鏈序列如表2 所示.退火緩沖液(pH=7.5)成分為50 mmol/L NaCl,25 mmol/L Tris-HCl.雙鏈DNA 退火時將2 條單鏈DNA 按照1∶1 混合,退火緩沖液(pH=7.5)成分為50 mmol/L NaCl,25 mmol/L Tris-HCl,加熱至95 ℃孵育5 min,而后在7 h 內(nèi)緩慢冷卻至室溫.
觀察雙鏈DNA 樣品時的緩沖液成分為50 mmol/L NaCl,25 mmol/L Tris-HCl,pH=7.5.觀察DNA Holiday junction 樣品時的緩沖液成分為50 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2,25 mmol/L Tris-HCl,pH=7.5.在進行單分子熒光成像時緩沖液內(nèi)需要加入抗淬滅體系,成分為0.8% D-葡萄糖、1 mg/mL 葡萄糖氧化酶、0.4 mg/mL 過氧化氫酶、1 mmol/L Trolox.
2.3.3 rGO-SIFA 熒光觀測的步驟
首先,將1 mg/mL 生物素修飾的牛血清蛋白(biotin-BSA)注入樣品腔室,孵育5 min 后用PBS緩沖液沖洗掉游離的biotin-BSA;加入10 μg/mL鏈霉親和素(strepavidin,SA)溶液孵育5 min 后用PBS 緩沖液沖洗掉游離的SA.然后,將100 pmol/L末端標(biāo)記了biotin 的熒光標(biāo)記DNA 注入樣品腔室,孵育5 min 后用PBS 緩沖液沖洗掉游離的DNA.最后,將緩沖液和抗淬滅體系混合注入樣品腔內(nèi)進行單分子熒光成像.實驗裝置采用以全內(nèi)反射熒光顯微鏡和EMCCD 為基礎(chǔ)的雙通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移觀測裝置[29-31],EMCCD 曝光時間設(shè)為50 ms.利用ImageJ 和Matlab 等軟件記錄及分析光強數(shù)據(jù).
利用LB 技術(shù)可以便捷、低成本地在蓋玻片上修飾單層GO,以制備成樣品腔室進行單分子SIFA實驗[11].實驗所用的蓋玻片最高能夠在600 ℃高溫下不發(fā)生斷裂與形變,基于此,將修飾了單層GO的蓋玻片直接放置于真空管式爐內(nèi)進行烘烤,便可得到修飾了rGO 的蓋玻片,并進行SIFA 實驗.
不同還原程度的rGO 在物理、化學(xué)和光學(xué)等性質(zhì)上可能存在區(qū)別[32].通過XPS 方法測量GO與rGO 的表面化學(xué)成分和結(jié)合狀態(tài),可以分析經(jīng)過管式爐烘烤后GO 的還原情況[33].單層GO 片徑大多在微米級別[11],小于XPS 的探測范圍,直接對蓋玻片上的rGO 進行測量時玻璃成分的蓋玻片會對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾,因此將GO 分散液制備成GO 薄膜,用2 塊蓋玻片將GO 薄膜夾在中間,與修飾了GO 的玻片同時烘烤,并對熱還原后的rGO 薄膜進行XPS 分析.
如圖2(a)所示,GO 的C1S 譜圖展示出了3 個峰,分別對應(yīng)C—C (sp2雜化碳)、C—O(羥基和環(huán)氧化物)、C=O(羰基)[27].經(jīng)過300 ℃和400 ℃烘烤2 h 進行還原的rGO 其C—O 與C=O 的峰明顯變低(圖2(b),(c)),表明大部分含氧基團已被去除.XPS 全譜的結(jié)果也表明經(jīng)過烘烤后GO 得到了很好的還原,如圖2 右側(cè)一列所示,未還原的GO,300 ℃溫度下烘烤2 h 還原的rGO (300 ℃-2h-rGO),以及400 ℃溫度下烘烤2 h 還原的rGO(400℃-2 h-rGO),C/O 比值分別是1.14,2.48 和3.29.這一結(jié)果和以往的研究一致,熱還原rGO 的還原程度主要取決于還原溫度和還原時間[34,35].還原溫度和還原時間的調(diào)節(jié)是連續(xù)的,通過設(shè)定不同還原參數(shù)可以對rGO 的還原程度進行連續(xù)調(diào)控.
圖2 初始GO 以及rGO 薄膜的XPS 譜 (a) 初始GO 薄膜C 1s 的XPS 譜(左)以及XPS 全譜(右);(b) 300 ℃-2 h-rGO 薄膜C 1s 的XPS 譜(左)以及XPS 全譜(右);(c) 400 ℃-2 h-rGO 薄膜C 1s 的XPS 譜(左)以及XPS 全譜Fig.2.XPS spectra of original GO and rGO thin films: (a) C 1s XPS spectra (left) and XPS survey spectra (right) for original GO thin films;(b) C 1s XPS spectra (left) and XPS survey spectra (right) for 300 ℃-2 h-rGO thin films;(c) C 1s XPS spectra (left)and XPS survey spectra (right) for the 400 ℃-2 h-rGO thin films.
在應(yīng)用以rGO 作為介質(zhì)受體的SIFA 技術(shù)研究生物大分子在細(xì)胞膜表面的法向運動之前還面臨2 個問題: 一是驗證rGO 是否能夠用于生物大分子的研究;二是測定rGO 的d0.雙鏈DNA 在溶液中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,熒光標(biāo)記的DNA 不僅可以作為單分子熒光成像技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品來驗證方法的可行性,還可以用于研究與DNA 相互作用的蛋白質(zhì).將同時標(biāo)記了Cy3 和biotin 的雙鏈DNA 通過biotin-BSA 以及SA 連接在rGO 表面,如圖3(a)所示.通過測量Cy3 的光強,與玻璃表面測得的光強進行對比,即可利用(1)式計算出rGO 的d0.圖3(b)左列是在DNA 未鏈接到表面上之前對樣品腔室進行成像,右列是DNA 連接后的成像圖.經(jīng)過熱還原后的rGO 已不自發(fā)熒光,通過圖像已無法區(qū)分熒光點處于rGO 區(qū)域還是玻璃區(qū)域,因此需要分析和統(tǒng)計所有單個Cy3 分子的光強.圖3(c)—(e)的首行分別展示了Cy3 標(biāo)記在雙鏈DNA 第1 bp、第9 bp、第21 bp 位點時單個Cy3 分子的光強曲線,以及光強的統(tǒng)計圖.結(jié)果表明: Cy3 標(biāo)記在雙鏈DNA 上時的光強穩(wěn)定,并且熒光強度和標(biāo)記位點無關(guān).Cy3 的光強呈高斯分布,峰值即為I0.圖3(c)第2 行和第3 行分別是在300 ℃-2 h-rGO和400 ℃-2 h-rGO 樣品腔內(nèi)對Cy3 標(biāo)記在第1 bp的DNA 進行成像所得到的單個Cy3 的熒光強度曲線以及強度分布.在rGO 樣品腔內(nèi)觀察到Cy3具有2 個穩(wěn)定的光強,較高的光強和玻璃上成像的強度相同,表明此時DNA 連接在了玻璃上.較低的光強是因為DNA 連接在了rGO 上,rGO 對Cy3有衰逝作用,從而導(dǎo)致Cy3 光強降低.Cy3 光強較低的曲線光強穩(wěn)定、不波動,表明Cy3 距離rGO的高度保持恒定.
圖3 熒光標(biāo)記DNA 測量rGO 的d0 (a) DNA 成像實驗示意圖;(b) 在300 ℃-2 h-rGO (上)以及400 ℃-2 h-rGO (下)樣品腔內(nèi)觀察DNA;Cy3 標(biāo)記在1 bp (c),9 bp (d)和21 bp (e) 處的DNA 在玻璃以及rGO 上成像時的單分子光強Fig.3.Determination of d0 of rGO by fluorescence labeled DNA: (a) Schematic representation of DNA imaging;(b) DNA imaging on 300 ℃-2 h-rGO (upper) and 400 ℃-2 h-rGO (lower);intensities of Cy3 labeled at 1 bp (c),9 bp (d) and 21 bp (e) of DNA on glass and rGO.
300 ℃-2 h-rGO 和400 ℃-2 h-rGO 樣品腔內(nèi)Cy3的低光強存在差異,分別是0.66I0和0.45I0,表明400 ℃-2 h-rGO 對熒光的衰逝作用比300 ℃-2 h-rGO要強.在rGO 樣品腔對Cy3 標(biāo)記在第9 bp 的DNA進行成像并分析單個Cy3 分子的光強,如圖3(d)所示,當(dāng)Cy3 標(biāo)記在第9 bp 時光強比標(biāo)記在第1 bp 時要強,這是由于Cy3 距離rGO 表面的距離比標(biāo)記在1 bp 時要遠(yuǎn).在300 ℃-2 h-rGO 樣品腔內(nèi)對Cy3 標(biāo)記在第21 bp 的DNA 進行成像,此時單個Cy3 分子只有一個光強,且和玻璃樣品腔內(nèi)測得的光強接近,表明此時rGO 對Cy3 的熒光衰逝效果已經(jīng)不顯著了.統(tǒng)計結(jié)果表明Cy3 的光強只有一個峰,但峰寬較玻璃上測得的I0分布要寬.Cy3 標(biāo)記在第21 bp 的DNA 在400 ℃-2 h-rGO樣品腔內(nèi)依舊能夠展示出2 個光強分布,表明400℃-2 h-rGO 具有更強的熒光衰逝效果.
雙鏈DNA 在溶液中的駐留長度為50 nm[36],相鄰堿基對的距離是0.34 nm[37],因此實驗所用的21 bp 雙鏈DNA 可以近似看作是長7.1 nm 的桿狀剛體.在計算Cy3 與rGO 表面的高度時只需要考慮雙鏈DNA 與rGO 表面法向的夾角.有研究表明溶液中固定在表面的短雙鏈DNA 和表面法向的夾角是恒定的,并且夾角約為60°[38,39],再結(jié)合以往研究表明BSA 的尺寸大約是3 nm[40],SA 的尺寸大約是4.2 nm[41],Cy3 標(biāo)記在第1 bp、第9 bp以及第21 bp 時和rGO 表面的法向距離便可以計算出來.表1 總結(jié)了不同熒光標(biāo)記的DNA在玻璃以及rGO 上進行成像,利用光強與距離信息計算出的d0.在相同的rGO 樣品腔內(nèi)對不同熒光標(biāo)記的DNA 進行成像并計算d0,所得到的結(jié)果接近,更加證實了rGO-SIFA 方法的可行性.在相同還原條件的rGO 上對不同熒光標(biāo)記位置的DNA 進行成像并計算d0屬于獨立實驗,可將獨立實驗的結(jié)果聯(lián)合起來得到更為準(zhǔn)確的結(jié)果,通過加權(quán)平均計算后可以得到300 ℃-2 h-rGO 的d0=(6.3 ±0.5) nm,400 ℃-2 h-rGO 的d0=(7.9 ± 0.5) nm.將計算得到的300℃-2 h-rGO 的d0以及Cy3 標(biāo)記在第21 bp時的高度代入(1)式可以計算出Cy3 的理論光強,大約為0.9I0.由于單分子的差異以及儀器測量存在誤差,Cy3 的光強呈高斯分布,具有一定的峰寬,即便光強分布具有0.9I0和I0兩個峰也無法區(qū)分,和實驗測量的結(jié)果一致.300 ℃-2 h-rGO 和400 ℃-2 h-rGO 的d0存在差異,可以預(yù)計的結(jié)果是通過降低還原溫度d0能從6.3 nm逐漸向4 nm 過渡.本文采用最高還原溫度為400 ℃,距離實驗所用蓋玻片的600 ℃耐高溫上限還有升溫空間.另一方面也可以將玻璃蓋玻片更換為石英蓋玻片,從而實現(xiàn)更高溫度的熱還原,以進一步提高d0.
表1 熒光標(biāo)記DNA 測量rGO 的d0Table 1. Determination of d0 of rGO by fluorescence labeled DNA.
將不同d0的受體介質(zhì)用于單分子SIFA 技術(shù)時能夠探測距離細(xì)胞膜表面不同高度的生物大分子動力學(xué)過程.利用熒光標(biāo)記的雙鏈DNA 來測量rGO 的d0時在rGO 上連接的DNA 只有一個光強,即目標(biāo)生物大分子只有一個狀態(tài).為了更好地驗證rGO-SIFA 方法的可行性,應(yīng)選擇一個熒光標(biāo)記位點距離rGO 高度發(fā)生變化的生物大分子來進行研究,這個生物大分子在溶液中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,并且被研究得比較充分.Holliday junction 是DNA復(fù)制以及同源重組的重要中間體,是由4 條DNA鏈組成的四鏈結(jié)構(gòu)[42].在溶液中沒有2 價金屬離子存在時,Holliday junction 呈現(xiàn)出靜止的十字形結(jié)構(gòu),當(dāng)溶液中有2 價金屬離子存在時,Holliday junction 將堆疊成X 型結(jié)構(gòu)[43].Holliday junction堆疊成的X 型結(jié)構(gòu)存在2 種不同的構(gòu)象,并且這2 種構(gòu)象在不斷地互相轉(zhuǎn)換,轉(zhuǎn)換速率受到2 價金屬離子濃度的調(diào)控[44,45].Holliday junction 的構(gòu)象變換是發(fā)生同源重組的必要條件,其中心區(qū)域的核苷酸序列會影響2 種構(gòu)象的轉(zhuǎn)換速率以及構(gòu)象持續(xù)時間[45,46].由于Holliday junction 的結(jié)構(gòu)簡單、易于制備,且在溶液中能夠穩(wěn)定觀察到2 種構(gòu)象的互相轉(zhuǎn)換,熒光標(biāo)記的Holliday junction 常用于高級單分子熒光成像技術(shù)的驗證[47,48].構(gòu)建如圖3 所示的Holliday junction,表2 展示了構(gòu)成Holliday junction 的4 條短鏈DNA 的核苷酸序列,以及Cy3的標(biāo)記位置,該序列的Holliday junction 可被連接到蓋玻片表面,并在2 價金屬離子存在時存在穩(wěn)定的構(gòu)象變換[46,48].
表2 DNA Holliday junction 的核苷酸序列Table 2. Nucleotide sequence of DNA Holliday junction.
Cy3 標(biāo)記在H 鏈的3’末端,Holliday junction通過H 鏈5’末端標(biāo)記的biotin 固定在表面.在50 mmol/L Mg2+,50 mmol/L Na+條件下Holliday junction 不斷地發(fā)生構(gòu)象變化,處于state 1 時Cy3距離rGO/GO 或玻璃表面距離近(約7.5 nm),處于state 2 的時候距離表面距離遠(yuǎn).
圖4(a)是玻璃樣品腔內(nèi)對Holliday junction進行觀察的結(jié)果,左列展示了單個Cy3 分子的光強,光強穩(wěn)定未發(fā)生任何波動,統(tǒng)計結(jié)果表明Cy3的光強為高斯分布,中心值即為I0.圖4(b)是在GO 樣品腔內(nèi)對Holliday junction 進行觀察,未觀測到Cy3 的光強發(fā)生變化.Cy3 距離表面最近的距離約為7.5 nm,GO 的d0=4 nm,通過(1)式可以計算出Cy3 距離GO 較近時的理論光強為0.94I0.距離7.5 nm 已經(jīng)超出了GO 的靈敏范圍,此時隨著距離的增大光強從0.94I0逐漸靠近I0,這一微小的光強變化已經(jīng)低于儀器探測的靈敏度.對GO 上Cy3 的光強進行統(tǒng)計,結(jié)果為高斯分布,但半高寬較玻璃上要大.這一現(xiàn)象的原因有2 個:一是理論計算表明GO 上Cy3 有2 個光強,并且這2 個光強大小都和I0很接近,實驗上很難區(qū)分出這2 個光強;二是GO 本身會自發(fā)微弱的熒光,在GO 上對單分子進行成像所得到的信噪比要比玻璃上差,因此光強分布的峰寬會比玻璃上要大.圖4(c)是在400 ℃-2 h-rGO 樣品槽內(nèi)對Holliday junction 進行觀察,Cy3 的光強不斷在高和低2 個值之間跳變.在400 ℃-2 h-rGO 上觀察Cy3 標(biāo)記的雙鏈DNA 時Cy3 的光強穩(wěn)定、不波動,表明400 ℃-2 h-rGO 只對Cy3 的光強有衰逝作用,但并不影響Cy3 光強的穩(wěn)定性.因此,觀察到Holliday junction所標(biāo)記的Cy3 光強發(fā)生變化是由于Cy3 距離400℃-2h-rGO 的高度發(fā)生了變化.對Cy3 的光強進行時間加權(quán)統(tǒng)計,結(jié)果表明Cy3 的光強呈現(xiàn)2 個峰的分布,峰值分別是0.42I0和0.83I0.利用(1)式,代入400 ℃-2 h-rGO 的d0=(7.9±0.5) nm 可以計算出Cy3 與rGO 表面的法向距離分別是7.3 nm以及11.7 nm,與Cy3 的理論距離7.5 nm 以及11.1 nm 比較接近.根據(jù)圖4(c)中Cy3 的光強分布圖可以計算出高光強和低光強的峰高比為1∶2,表明Holliday junction 的state 1 構(gòu)象持續(xù)時間是state 2 的2 倍,和以往采用相同DNA 序列的Holliday junction 研究結(jié)果一致[46].基于以上兩點,證實了用400 ℃-2 h-rGO 觀察到了Holliday junction的構(gòu)象變換,并且這一構(gòu)象變換無法被GO 觀察到.造成這一結(jié)果差異的原因是400 ℃-2 h-rGO具有比GO 更大的d0,能夠觀測更遠(yuǎn)的范圍.熱還原的rGO 可以通過控制還原溫度來調(diào)控d0,在進行具體研究時應(yīng)根據(jù)目標(biāo)大分子的尺度和熒光標(biāo)記位點來靈活設(shè)還原溫度,以選擇適合觀測的d0.
圖4 SIFA 觀察Holliday junction 的構(gòu)象變換,在玻璃 (a),GO (b)和400 ℃-2 h-rGO (c)上觀察Cy3 標(biāo)記的Holliday junction,左列為單個Cy3 的光強時間曲線,中間為Cy3 的光強統(tǒng)計圖,右列為Holliday junction 構(gòu)象變換導(dǎo)致Cy3 光強變化的示意圖Fig.4.Observing conformational transformation of Holliday junction by SIFA,observing the Cy3 labeled Holliday junction on glass(a),GO (b) and 400 ℃-2 h-rGO (c),left columns show intensity-time curves of a single Cy3,middle columns show distribution of intensities of Cy3,right columns show schematic representation of the change of Cy3 light intensity caused by the conformational transformation of Holiday junction.
本文進一步拓展了課題組研究的SIFA 技術(shù),將修飾了GO 的蓋玻片置于真空管式爐內(nèi)烘烤,通過控制溫度獲取不同還原程度的rGO,從而調(diào)控特征淬滅距離,使得該方法廣泛用于具有二維體系的單分子研究.本文采用熒光標(biāo)記的DNA 測量出了300 ℃-2 h-rGO 的d0=(6.3±0.5) nm,400 ℃-2 hrGO的d0=(7.9±0.5) nm.可預(yù)計的結(jié)果是在室溫和400 ℃之間改變還原溫度能夠?qū)崿F(xiàn)d0從4 nm到7.9 nm 的連續(xù)調(diào)節(jié).本文分別在400 ℃-2 h-rGO和GO 上對Cy3 標(biāo)記的Holliday junction 進行觀察,GO 不能探測到Cy3 光強發(fā)生變化,而400 ℃-2 h-rGO 上可以看到Cy3 的光強不斷地在高低之間跳變,并通過光強計算出了Cy3 和rGO 表面的距離,計算結(jié)果和理論距離接近,表明基于rGO的SIFA 不僅提升了SIFA 的適用范圍,更具有較高的測量精度以及空間分辨率.此外,由于rGO 本身不發(fā)熒光,在進行單分子熒光成像時并不會影響圖像的信噪比,將SIFA 技術(shù)和FRET 技術(shù)聯(lián)用起來可以實時地觀察生物大分子的三維運動與構(gòu)象變換信息.期待未來在膜蛋白功能和結(jié)構(gòu)的研究中,rGO-SIFA 技術(shù)能得到更廣泛的應(yīng)用.