沈佳穎,李由然,石貴陽*

1(江南大學(xué),糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

(R)-檸蘋酸 (R-citramalate) 是一種五碳羥基二羧酸,廣泛存在于某些細(xì)菌的代謝途徑當(dāng)中,例如,詹式甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)[1]、硫還原地桿菌(Geobactersulfurreducens)、黃桿菌(Chlorobaculumtepidum)中異亮氨酸的生物合成途徑;破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetanomorphum)中谷氨酸的厭氧代謝等,均涉及(R)-檸蘋酸的合成[2-4]。(R)-檸蘋酸是重要的多功能有機(jī)酸,其作為聚合物中間體甲基丙烯酸(methacrylic acid,MAA)的化學(xué)合成前體[5-7],不僅可以用于樹脂生產(chǎn)工業(yè)[8-10],而且可以作為酸化劑、除皺劑在食品加工、美容、醫(yī)療等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[11-13]。因此,(R)-檸蘋酸具有廣闊的應(yīng)用和市場前景。

檸蘋酸的合成方法主要為化學(xué)法,以氰化氫和乙基乙酰酯為底物通過縮合反應(yīng)合成[13]。但是,由于前體物質(zhì)的毒性及其所帶來的高成本等問題,難以滿足可持續(xù)發(fā)展的需求,極大限制了該方法的應(yīng)用。近些年來,隨著合成生物學(xué)的發(fā)展,檸蘋酸的生物合成已經(jīng)成為了更具吸引力的替代方案:以丙酮酸和乙酰-CoA為前體物質(zhì),在檸蘋酸合酶的催化下特異性縮合形成檸蘋酸[14](圖1)。PARIMI等[15]、WU等[16]在大腸桿菌(Escherichiacoli)中異源表達(dá)檸蘋酸合酶——CimA3.7(該酶來源于詹式甲烷球菌[1],是由ATSUMI等[17]經(jīng)過篩選和定向進(jìn)化后得到的穩(wěn)定性更高的酶),由此成功引入檸蘋酸合成途徑,得到高產(chǎn)檸蘋酸的重組大腸桿菌菌株。該研究以葡萄糖為底物,最終在搖瓶發(fā)酵水平產(chǎn)生2.9 g/L檸蘋酸[15]。雖然大腸桿菌遺傳操作簡單,但在工業(yè)化發(fā)酵過程中,其噬菌體侵染的問題仍缺乏有效的解決策略[18];再者,對(duì)于利用重組大腸桿菌生產(chǎn)檸蘋酸的過程,由于大腸桿菌對(duì)底物葡萄糖的耐受性以及產(chǎn)物積累造成環(huán)境pH值降低而導(dǎo)致細(xì)胞生長代謝受損,不利于高濃度檸蘋酸的積累[19-20]。地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)屬于厚壁菌門,可在酸性、高溫、營養(yǎng)匱乏等不利的外界環(huán)境中以芽孢的形式存在,具有抗逆性強(qiáng)、酶系豐富等眾多的優(yōu)勢,是理想的外源基因表達(dá)宿主[21],因此,有關(guān)地衣芽孢桿菌檸蘋酸合成途徑的構(gòu)建及優(yōu)化有很大的研究價(jià)值。

圖1 地衣芽孢桿菌中檸蘋酸合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of citramalate in Bacillus licheniformis注:cimA(檸蘋酸合酶);gltA(檸檬酸合酶);PEP(磷酸烯醇式丙酮酸,phosphoenolpyruvate);TCA(三羧酸循環(huán),tricarboxylic acid cycle)

目前,有關(guān)檸蘋酸生物生產(chǎn)的研究主要集中于傳統(tǒng)發(fā)酵法,尚未提出利用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化這一生產(chǎn)工藝進(jìn)行產(chǎn)物合成。與發(fā)酵法相比,高菌體濃度(OD600值)條件下的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法憑借著副產(chǎn)物少、產(chǎn)率高等眾多優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用。當(dāng)菌體處于高密度的環(huán)境中時(shí),生長受到限制從而更多的用于細(xì)胞轉(zhuǎn)化;此外,全細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中,完整的細(xì)胞體保護(hù)胞內(nèi)酶不受外界條件的影響,比游離酶更穩(wěn)定,從而使轉(zhuǎn)化能夠發(fā)生在高溫、低pH等較惡劣的環(huán)境中。如通過高密度培養(yǎng)大腸桿菌表達(dá)4-羥基苯乙酸酯3-羥化酶并進(jìn)行全細(xì)胞催化香豆酸高效生產(chǎn)咖啡酸,使得咖啡酸的最終產(chǎn)量可達(dá)到18.74 g/L[22];采用重組枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)作為工程菌株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸可達(dá)到93.78 g/L[23]。研究表明微生物體內(nèi)的乙酰-CoA作為檸檬酸與檸蘋酸的前體,主要與草酰乙酸縮合形成檸檬酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)而用于細(xì)胞生長[16],使得檸蘋酸合成的代謝流受到抑制。由此,首次提出重組地衣芽孢桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成檸蘋酸的研究,在限制生長的基礎(chǔ)上有效減少三羧酸循環(huán)的代謝流以增加檸蘋酸產(chǎn)量。

本研究首次以地衣芽孢桿菌作為底盤細(xì)胞,引入異源檸蘋酸合酶搭建了檸蘋酸合成途徑,以葡萄糖為底物實(shí)現(xiàn)了檸蘋酸的合成與積累,將地衣芽孢桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化系統(tǒng)應(yīng)用于檸蘋酸的合成,通過優(yōu)化重組菌株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)檸蘋酸的條件,以提高其產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究中使用的菌株、質(zhì)粒如表1所示。

表1 本研究所用的菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑與儀器

(R)-檸蘋酸標(biāo)準(zhǔn)樣品、氨芐青霉素、四環(huán)素,美國Sigma公司;2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)、DNA提取、純化、凝膠回收試劑盒均,南京諾唯贊生物科技有限公司;2×Rapid Taq PCR Master Mix、T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶,美國Thermo Fisher公司;棉籽蛋白,北京鴻潤寶順科技有限公司。

HYL-C組合式搖床,太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;可見分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司;CF16RXⅡ型冷凍離心機(jī),日本HITACHI公司;DYY-6C核酸電泳儀,北京六一廠;Sonics VCX-750型超聲波細(xì)胞破碎儀,美國Sonics公司;DIONEX Ulitimate U3000液相色譜儀,美國賽默飛Thermo公司。

1.1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

(1)LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10(固體培養(yǎng)基加15 g/L的瓊脂粉)。

(2)CMA發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨FP321 20、酵母粉FM408 10、葡萄糖100、玉米漿干粉5、K2HPO4·3H2O 9.12、KH2PO41.36、CaCl20.5、MgSO4·7H2O 0.5、(NH4)2HPO410[24]。

(3)CMB發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨FP321 20、酵母粉FM408 10、葡萄糖200、玉米漿干粉5、K2HPO4·3H2O 9.12、KH2PO41.36、CaCl20.5、MgSO4·7H2O 0.5、(NH4)2HPO410。

(4)CMC發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖100、棉籽蛋白30、K2HPO4·3H2O 9.12、KH2PO41.36、(NH4)2HPO410(pH 7.5)[25]。

(5)TB轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨12、酵母粉24、K2HPO412.54、KH2PO42.31、甘油5(pH 7.0)。

上述培養(yǎng)基所添加的氨芐青霉素或四環(huán)素的終質(zhì)量濃度分別為100、20 μg/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

參照ATSUMI等[17]關(guān)于檸蘋酸合酶基因(cimA)的突變結(jié)果,得到穩(wěn)定性更好的檸蘋酸合酶——CimA3.7,按照地衣芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化合成該基因,以其為模板,使用正向引物CimA-F和反向引物CimA-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并純化回收得到目的片段cimA3.7。以質(zhì)粒pEG(本實(shí)驗(yàn)室保藏)為模板,使用正向引物pHY-S09-F和反向引物pHY-S09-R反向PCR擴(kuò)增得到表達(dá)載體pHY-Pshuttle09。引物的兩端均引入酶切位點(diǎn)XhoI和EcoR I,分別雙酶切后使用T4連接酶將目的片段cimA3.7和表達(dá)載體pHY-Pshuttle09連接形成重組質(zhì)粒PA1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109,挑測序正確的陽性轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)于地衣芽孢桿菌細(xì)胞中,獲得重組地衣芽孢桿菌BLA。所用引物序列如表2所示。

表2 本研究所涉及引物序列Table 2 Primer sequences involved in this study

1.2.2 重組地衣芽孢桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)檸蘋酸

1.2.2.1 全細(xì)胞催化劑的制備

種子活化:將在-70 ℃甘油管保藏的重組地衣芽孢桿菌BLA劃線至帶有四環(huán)素抗性的固體LB平板,37 ℃培養(yǎng)12～16 h。從平板上挑取單菌落,接種于裝有15 mL LB培養(yǎng)基(含有終質(zhì)量濃度為20 μg/mL的四環(huán)素)的錐形瓶中,置于37 ℃、250 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h得到種子液。

搖瓶培養(yǎng):種子液以10%的接種量轉(zhuǎn)接于裝液量為30 mL的不同發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃、250 r/min培養(yǎng)。每隔24 h取1 mL發(fā)酵液,記錄菌株的光密度OD600值;將發(fā)酵液于12 000 r/min條件下離心20 min,上清液用于HPLC分析檢測檸蘋酸及樣液中各組分含量。

菌體收集:將重組地衣芽孢桿菌置于篩選出的最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃、250 r/min發(fā)酵培養(yǎng)48 h后進(jìn)行9 000 r/min、4 ℃離心15 min棄去上清液,收集菌體。

1.2.2.2 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化

使用預(yù)冷的TB溶液洗滌菌體2次,然后將菌體重懸于TB溶液中以形成細(xì)胞懸浮液,使得菌體濃度OD600值為60,加入終質(zhì)量濃度為100 g/L的葡萄糖以及20 μg/mL的四環(huán)素。全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系25 mL在250 mL搖瓶中于37 ℃、250 r/min恒溫?fù)u床上反應(yīng)24 h。

1.2.3 產(chǎn)物的檢測與鑒定

將發(fā)酵液于12 000 r/min條件下離心20 min,取上清液加入等體積95%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液于4 ℃條件下沉淀蛋白8～12 h。離心后上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾。

HPLC檢測條件如下:流動(dòng)相為硫酸-水(0.05%,體積分?jǐn)?shù));洗脫方式為等度洗脫;流速0.8 mL/min;示差檢測器;液相色譜柱為Dikma CarboPac H+(300 mm×8.0 mm,6 μm);柱溫50 ℃;進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

以發(fā)酵48 h后的菌體作為全細(xì)胞催化劑,后加入終質(zhì)量濃度為100 g/L的葡萄糖,于37 ℃、250 r/min反應(yīng)24 h的基礎(chǔ)上,分別考察菌體濃度(40～80)、搖床轉(zhuǎn)速(150～270 r/min)、轉(zhuǎn)化溫度(30～50 ℃)、葡萄糖質(zhì)量濃度(50～200 g/L)以及初始pH(4.5～8.5)和轉(zhuǎn)化時(shí)間(24～132 h)對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成檸蘋酸的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸蘋酸合酶基因的克隆與表達(dá)

如圖2-a所示,構(gòu)建質(zhì)粒pA1。首先以pEG重組質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室)為模板,通過反向PCR擴(kuò)增獲得表達(dá)載體pHY-Pshuttle09;以pUC57-A重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得cimA3.7目的基因片段。

M-5000 Marker;1-重組質(zhì)粒pA1a-質(zhì)粒pA1圖譜;b-重組質(zhì)粒酶切鑒定圖2 質(zhì)粒pA1圖譜及酶切鑒定電泳結(jié)果Fig.2 Construction map of plasmid pA1 and result for agarose gel electrophoresis of recombination vector

將表達(dá)載體pHY-Pshuttle09以及目的片段cimA3.7分別使用XhoI和EcoR I雙酶切,按照1.2.1的方法構(gòu)建了重組質(zhì)粒pA1。將重組質(zhì)粒用XhoI和EcoR I雙酶切,酶切后理論條帶大小是275 bp和5 152 bp,結(jié)果如圖2-b所示,電泳條帶大小與理論值一致,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 重組地衣芽孢桿菌全細(xì)胞催化劑的制備

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)質(zhì)上就是利用菌體內(nèi)的酶作為催化劑,將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的過程,所以通過發(fā)酵培養(yǎng)以獲取具有高密度、高催化活性的細(xì)胞是制備全細(xì)胞催化劑的關(guān)鍵因素。適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)微生物的生長代謝、酶的表達(dá)以及產(chǎn)物產(chǎn)出均會(huì)產(chǎn)生較大影響。分別選擇CMA、CMB、CMC 3種不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)重組地衣芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵,探究其對(duì)菌體生長及檸蘋酸產(chǎn)出的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,經(jīng)過168 h的發(fā)酵,使用CMB培養(yǎng)基與CMC培養(yǎng)基產(chǎn)生的檸蘋酸要明顯多于CMA培養(yǎng)基,且當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基為CMC時(shí),菌體生長狀況最好,最終菌體濃度OD600值達(dá)到29.13,檸蘋酸產(chǎn)量可達(dá)1.94 g/L,說明檸蘋酸合酶在該條件下能更好地表達(dá)。根據(jù)陸一鳴等[25]研究,分析其原因是培養(yǎng)基中碳源及氮源對(duì)重組菌產(chǎn)生的影響:CMA、CMB培養(yǎng)基均以葡萄糖為碳源,葡萄糖的快速利用使得發(fā)酵后期缺乏足夠碳源維持菌體生長;而CMC培養(yǎng)基以蔗糖作為唯一碳源,其作為二糖在發(fā)酵后期可以繼續(xù)為重組菌的生長提供碳源,更有利于菌體生長。除此之外,CMC發(fā)酵培養(yǎng)基使用棉籽蛋白作為氮源,蛋白質(zhì)含量高且含有維生素、游離氨基酸等營養(yǎng)成分,十分適合芽孢桿菌中酶的表達(dá)。因此,最終選擇CMC培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基來制備全細(xì)胞催化劑。

圖3 發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇Fig.3 Selection of fermentation medium

2.2.2 產(chǎn)物的檢測與鑒定

將發(fā)酵后的樣品根據(jù)1.2.3所示的方法檢測產(chǎn)物的出峰,液相結(jié)果如圖4所示,在9.50 min葡萄糖被洗脫下來,在10.29 min產(chǎn)物被洗脫下來,且產(chǎn)物與葡萄糖、檸蘋酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的出峰時(shí)間一致(圖4-a),由此判斷該產(chǎn)物為檸蘋酸,進(jìn)一步驗(yàn)證了重組地衣芽孢桿菌具有合成檸蘋酸的潛力。

a-葡萄糖、(R)-檸蘋酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品液相色譜圖;b-樣品液相色譜圖圖4 標(biāo)準(zhǔn)樣品(葡萄糖、R-檸蘋酸)和樣品的液相色譜圖Fig.4 Liquid chromatogram of standard (glucose、R-citramalate) and sample

2.2.3 重組地衣芽孢桿菌的發(fā)酵

選擇CMC發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行重組地衣芽孢桿菌的發(fā)酵,結(jié)果如圖5所示,對(duì)于重組菌BLA,0～6 h為其生長對(duì)數(shù)期,菌體濃度迅速增加,24 h后開始逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期,隨著發(fā)酵時(shí)間不斷延長,菌體量OD600值均呈現(xiàn)持續(xù)增長的趨勢。結(jié)合發(fā)酵過程中檸蘋酸生成的曲線可得,發(fā)酵36～48 h正處于菌體生長的穩(wěn)定期,且該階段檸蘋酸生成的速率最快,可能是因?yàn)榇穗A段菌體生物活性特征最好,綜合考慮檸蘋酸產(chǎn)量以及時(shí)間成本的問題,初步選擇發(fā)酵48 h后的菌體作為全細(xì)胞催化劑。

圖5 重組地衣芽孢桿菌BLA發(fā)酵過程分析Fig.5 Analysis of the fermentation process of recombinant Bacillus licheniformis BLA

2.3 重組地衣芽孢桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)檸蘋酸條件優(yōu)化

2.3.1 菌體濃度對(duì)檸蘋酸產(chǎn)量的影響

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程實(shí)質(zhì)上是胞內(nèi)酶的催化過程,不同的菌體濃度(OD600值)代表不同的添加酶量。在初始條件的基礎(chǔ)上,考察OD600值對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成檸蘋酸的影響,結(jié)果如圖6-a所示,當(dāng)OD600值為70時(shí),檸蘋酸的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率最高,可能是因?yàn)楫?dāng)菌體濃度過低時(shí),產(chǎn)生的酶量難以滿足細(xì)胞轉(zhuǎn)化所需,造成檸蘋酸產(chǎn)量低;當(dāng)菌體濃度過高時(shí),溶氧等因素受到了一定的限制,不利于產(chǎn)物的合成。所以O(shè)D600值為70是最適合檸蘋酸合成的條件。

a-菌體濃度;b-搖床轉(zhuǎn)速;c-溫度;d-葡萄糖質(zhì)量濃度;e-pH;f-轉(zhuǎn)化時(shí)間圖6 不同條件對(duì)檸蘋酸產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effects of different conditions on yield and conversion rate of citramalate

2.3.2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)檸蘋酸產(chǎn)量的影響

為探究溶氧對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成檸蘋酸的影響,通過控制搖床轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)不同溶氧的供應(yīng)。轉(zhuǎn)速較慢時(shí),發(fā)酵液中的溶氧量少,無法滿足細(xì)胞轉(zhuǎn)化所需;當(dāng)轉(zhuǎn)速過快的時(shí)候,可能會(huì)使菌體損傷大,影響酶的表達(dá)和檸蘋酸的合成[26]。結(jié)果如圖6-b所示,隨著轉(zhuǎn)速的升高,檸蘋酸的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率逐漸升高,到250 r/min時(shí)檸蘋酸產(chǎn)量達(dá)到最大,為3.35 g/L,轉(zhuǎn)化率為76.60 mg/g葡萄糖,之后過高的轉(zhuǎn)速不僅造成菌體損傷嚴(yán)重,而且主要副產(chǎn)物2,3-丁二醇的量也急劇增多,導(dǎo)致檸蘋酸的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率下降。

2.3.3 轉(zhuǎn)化溫度對(duì)檸蘋酸產(chǎn)量的影響

轉(zhuǎn)化溫度關(guān)系著酶活性的高低,同時(shí)溫度成本的控制也是實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物工業(yè)化的重要因素。通過選擇不同的溫度進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)檸蘋酸的驗(yàn)證,如圖6-c所示,隨著轉(zhuǎn)化溫度的升高,檸蘋酸的產(chǎn)量隨之升高,在37 ℃達(dá)到最高為4.78 g/L,轉(zhuǎn)化率為74.13 mg/g葡萄糖,之后產(chǎn)量逐漸降低?？赡苁且?yàn)樵?7 ℃時(shí),檸蘋酸合酶的活性以及穩(wěn)定性相對(duì)較高,因此選擇37 ℃為最適轉(zhuǎn)化溫度。

2.3.4 葡萄糖濃度對(duì)檸蘋酸產(chǎn)量的影響

檸蘋酸產(chǎn)生的直接前體物質(zhì)是丙酮酸和乙酰-CoA,但考慮到成本問題,選擇更加經(jīng)濟(jì)適用的間接前體物質(zhì)葡萄糖作為全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)檸蘋酸的底物。本實(shí)驗(yàn)考察了50、100、150、200 g/L葡萄糖對(duì)檸蘋酸產(chǎn)量的影響。如圖6-d所示,當(dāng)葡萄糖濃度過高或過低時(shí),均不利于檸蘋酸的產(chǎn)生,可能的原因是較少底物的添加不足以形成更多的產(chǎn)物,而過高濃度的葡萄糖可能會(huì)對(duì)菌體本身的代謝產(chǎn)生一定的抑制作用,不利于檸蘋酸的合成。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L時(shí),檸蘋酸的產(chǎn)量最高,為4.55 g/L,轉(zhuǎn)化率為78.85 mg/g葡萄糖,此濃度的葡萄糖在足夠維持菌體代謝循環(huán)的基礎(chǔ)上又不造成原料的浪費(fèi)。因此本研究最終選擇100 g/L的葡萄糖作為最佳反應(yīng)條件。

2.3.5 初始pH對(duì)檸蘋酸產(chǎn)量的影響

控制轉(zhuǎn)化時(shí)的pH環(huán)境關(guān)系著胞內(nèi)酶的活性及穩(wěn)定性的高低,不同的pH會(huì)改變細(xì)胞的代謝通路以及細(xì)胞膜的通透性,從而影響菌體生長和產(chǎn)物合成[26]。因此針對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化初始時(shí)的pH進(jìn)行優(yōu)化以確定最適pH。結(jié)果如圖6-e所示,最佳初始pH值為7.0,此時(shí)檸蘋酸產(chǎn)量為4.62 g/L,轉(zhuǎn)化率達(dá)到79.81 mg/g葡萄糖?？赡芤?yàn)榇藀H條件最適合檸蘋酸合酶的表達(dá)。

2.3.6 轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)檸蘋酸產(chǎn)量的影響

轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)檸蘋酸合成的影響十分顯著,隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的延長,菌體所處的環(huán)境及其本身的狀態(tài)均會(huì)發(fā)生變化,因此,本實(shí)驗(yàn)考察了轉(zhuǎn)化時(shí)間為24、48、72、96、120、132 h對(duì)檸蘋酸產(chǎn)量的影響。如圖6-f所示,轉(zhuǎn)化120 h后檸蘋酸產(chǎn)量達(dá)到8.57 g/L,轉(zhuǎn)化率為142.84 mg/g葡萄糖,繼續(xù)延長發(fā)酵時(shí)間,檸蘋酸產(chǎn)量不再增加,考慮到時(shí)間成本的問題,確定最優(yōu)的轉(zhuǎn)化時(shí)間為120 h。

3 結(jié)論與討論

本研究首次以地衣芽孢桿菌作為底盤細(xì)胞構(gòu)建了檸蘋酸生產(chǎn)途徑,通過優(yōu)化培養(yǎng)條件,實(shí)現(xiàn)了檸蘋酸合酶在重組地衣芽孢桿菌胞內(nèi)的高效表達(dá),并將重組菌用作全細(xì)胞生物催化劑合成檸蘋酸,利用優(yōu)化后的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件,采用CMC培養(yǎng)基制備全細(xì)胞催化劑,在37 ℃、pH 7.0、底物質(zhì)量濃度為100 g/L、菌體濃度OD600值為70、搖床轉(zhuǎn)速為250 r/min 進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化120 h后,生成檸蘋酸8.57 g/L,轉(zhuǎn)化率為142.84 mg/g葡萄糖,這是目前報(bào)道的搖瓶水平細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成檸蘋酸的最高產(chǎn)量,且沒有額外添加中和劑來維持細(xì)胞生長,進(jìn)一步證明了地衣芽孢桿菌憑借其高耐受性更有利于產(chǎn)物的合成,為生物法生產(chǎn)檸蘋酸的研究奠定了基礎(chǔ)。

由于檸蘋酸前體物質(zhì)的特殊性,在接下來的研究中,以檸蘋酸的產(chǎn)量為指標(biāo),通過代謝調(diào)控其前體物質(zhì)丙酮酸和乙酰-CoA,確定影響檸蘋酸合成的限速步驟,進(jìn)一步平衡二者的供應(yīng)、細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成,從而構(gòu)建高產(chǎn)檸蘋酸的菌株,同時(shí)也為其他與該途徑相關(guān)物質(zhì)的形成提供研究依據(jù)。