王玉榮,葛東穎,蔡文超,劉忠軍,宋子赟,郭千璋,郭壯*

1(湖北文理學院,湖北省食品配料工程技術研究中心,湖北 襄陽,441053) 2(襄陽市釀酒生物技術與應用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心,湖北 襄陽,441053) 3(清香型白酒生物技術襄陽市重點實驗室,湖北 襄陽,441053)4(山西老雄山酒業(yè)有限公司,山西 長治,047100)

大曲是中國白酒釀造中的糖化發(fā)酵劑,富含微生物、水解酶和風味物質,對白酒的生產起著至關重要的作用。根據最高培養(yǎng)溫度和風味特征的不同,大曲可以劃分為低溫、中溫和高溫大曲,其中低溫大曲的曲胚溫度在40～50 ℃,用其釀造的白酒具有入口綿、落口甜和清香純正等風味特征[1]。俗話說“曲乃酒之骨”,大曲品質的好壞對于白酒的生產具有重要影響,大量研究表明曲中微生物的組成與大曲的品質之間存在一定的關聯(lián)性[2]。WU等[3]的研究表明庫德畢赤酵母菌(Pichiakudriavzevii)是白酒發(fā)酵中的關鍵菌種,可產生醇類、酸類和酯類等芳香化合物,該物種在谷類基質的發(fā)酵過程中可產生2-苯乙醇等香氣物質。作為白酒釀造中的功能微生物,JIN等[4]的研究表明以曲霉屬(Aspergillus)為代表的絲狀真菌具有糖化淀粉的能力,該屬也被認為是形成白酒中吡嗪、酯類和某些芳香化合物的關鍵微生物。因此,解析大曲中微生物的菌群結構是調控和提升大曲品質的關鍵。

Illumina Miseq高通量測序技術在解析微生物多樣性上具有通量高和速度快的優(yōu)點,因而在大曲微生物類群解析中應用較為廣泛[5]?；谠摷夹g,ZHOU等[6]對低溫、中溫和高溫大曲的真菌菌群進行了解析,發(fā)現(xiàn)大曲加工溫度對真菌群落結構有著重要影響。電子鼻仿生技術具有易操作和準確性高等優(yōu)點,通常用于食品領域中的風味品質檢測[7],雷炎等[8]使用該技術選擇出了適用于紅棗酒發(fā)酵的扣囊復膜酵母菌株。山西是清香型白酒的發(fā)源地,其中呂梁地區(qū)出產的汾酒更是成為了清香型白酒的代表,吸引國內眾多學者對其微生物類群和風味品質開展了研究[9]。山西省長治、臨汾和太原等地區(qū)亦有制作低溫大曲和釀造清香型白酒的傳統(tǒng),然而目前有關長治地區(qū)低溫大曲中真菌菌群結構及其風味品質特征的研究較少。

本研究首先采用Illumina Miseq測序技術解析長治地區(qū)低溫大曲中真菌的菌群結構,繼而使用電子鼻識別大曲中的揮發(fā)性物質,并在此基礎上對大曲中蘊含的真菌類群與風味品質的關聯(lián)性進行了分析評價,以期為后續(xù)低溫大曲的工業(yè)化生產提供部分參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

低溫大曲:11個大曲樣品均采自山西省長治市長治縣(北緯35°49′～37°07′,東經111°59′～113°44′),所有樣品均屬于青茬曲,且以大麥和豌豆為主要原料,由當?shù)鼐茝S車間工人制作而成,制曲溫度在40～50 ℃,樣品編號記為LXS1～LXS11。大曲樣品采集時間為2022年4月,制作完成后的大曲在曲庫存放時間均大于3個月,樣品采集時將曲塊放于20 cm×20 cm的自封袋中密封,送回實驗室后打磨成粉末狀放于-20 ℃冰箱備用。

1.1.2 試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基,青島海博生物技術有限公司;QIAGEN DNeasy maricon Food Kit DNA基因組提取試劑盒,德國QIAGEN公司;FastPfu Fly DNA Polymerase、5×Trans StartTM、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTPs)Mix和FastPfu Buffer,北京全式金生物技術有限公司;引物ITS4R/ITS3F,武漢天一輝遠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

JFSD-100Ⅱ粉碎機,上海隆拓儀器設備有限公司;Veriti FAST梯度PCR擴增儀,美國ABI公司;UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng),美國Protein Simple公司;MiSeq PE300高通量測序平臺,美國Illumina公司;R930機架式服務器,美國DELL公司;LTF-8D水浴鍋,上海龍躍儀器有限公司;PEN3電子鼻,德國Airsense公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 霉菌和酵母菌平板菌落計數(shù)

參照汪臘云等[10]的方法對大曲樣品中的霉菌和酵母菌進行計數(shù),其中樣品10倍稀釋至10-6梯度,取1 mL稀釋液與約20 mL培養(yǎng)基混勻后待平板凝固,正置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,隨后對平板中生長的菌落進行計數(shù)。

1.3.2 宏基因組提取、PCR擴增和Illumina MiSeq測序

使用試劑盒提取低溫大曲中微生物的宏基因組DNA[11],參照KANG等[12]的方法對ITS2區(qū)域進行PCR擴增,將具有明亮且清晰條帶的擴增產物寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司用Illumina MiSeq PE300高通量測序平臺進行測序。

1.3.3 生物信息學分析

參照WANG等[13]的方法對下機序列進行拼接和質控,基于QIIME(V1.9.1)分析平臺[14]并使用PyNAST軟件對原始序列進行校準和對齊[15],在100%和97%相似性下使用UCLUST軟件劃分分類操作單元(operational taxonomic unit,OTU)[16],使用ChimeraSlayer軟件剔除含有嵌合體的OTU[17],通過與UNITE數(shù)據庫比對明確各分類學地位[18]。

1.3.4 基于電子鼻技術低溫大曲的風味品質評價

準確稱取20 g低溫大曲樣品于電子鼻專用樣品瓶中,在50 ℃水浴鍋中水浴30 min后放于室溫平衡30 min,使用PEN3電子鼻進行檢測,測試參數(shù)參照張鑫等[19]的方法。每個樣品設置3個平行,在60 s的測試時間中取已達到平穩(wěn)的第49 s、第50 s和第51 s時傳感器響應值的平均值作為測試值。

1.3.5 數(shù)據處理

使用Cytoscape軟件(v3.7.2)繪制真菌屬的相關性網絡圖;使用R軟件(v4.1.2)的“BiodiversityR”包繪制物種累積箱形圖,“waterfall”包繪制瀑布圖,“pacman”、“reshape”、“psych”、“ggtree”、“aplot”、“ggplot2”和“pheatmap”包繪制真菌屬與風味品質的相關性熱圖;使用Graph Pad Prism9軟件繪制樣品風味品質評價的小提琴圖;其余圖均為使用Origin 2018軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 長治地區(qū)低溫大曲的測序結果及α多樣性分析

本研究首先對長治地區(qū)低溫大曲樣品中霉菌和酵母菌進行了計數(shù),發(fā)現(xiàn)其含量在7.00～7.37 lg CFU/g,進一步采用高通量測序技術解析11個大曲樣品的真菌菌群結構,對各樣品測序結果進行了分析整合,如表1所示。

表1 低溫大曲樣品測序結果及各分類地位數(shù)量Table 1 Sequencing results of low-temperature Daqu samples and the number of taxonomic status

由表1可知,本研究共產生421 223條優(yōu)質序列,平均每個樣品38 293條,經97%相似度聚類分析共得到5 852個OTU,所有樣品中的真菌隸屬于6個門、15個綱、27個目、39個科和51個屬。當測序量在25 010條序列時,樣品LXS8具有最高的Chao1指數(shù)為733,樣品LXS5具有最高的Shannon指數(shù)為5.19,由此可見,樣品LXS8的真菌菌群豐度最高,而樣品LXS5的真菌菌群多樣性最高。

為評估本研究的測序深度是否滿足后續(xù)生物信息學分析的需要,繪制了物種累積箱型圖,如圖1所示。

圖1 低溫大曲中物種累積箱型圖Fig.1 Box diagram of species accumulation in low-temperature Daqu

由圖1可知,隨著納入本研究樣本數(shù)的增加,可觀察到物種的多樣性也隨之遞增,而曲線上升的趨勢逐漸接近平穩(wěn),可見本研究中涵蓋的樣品數(shù)已滿足實驗的要求,若再增加大曲的樣品數(shù),物種數(shù)也不會再發(fā)生大幅度變化,這表明測序數(shù)據量足以反映納入本研究所有樣品的大多數(shù)微生物信息并滿足后續(xù)生物信息學分析的要求。

2.2 長治地區(qū)低溫大曲的真菌菌群結構解析

本研究將在11個低溫大曲樣品中均存在,且平均相對含量>1.0%的真菌門、屬和OTU,定義為核心優(yōu)勢真菌門、屬和OTU,同時比較分析了各樣品中核心優(yōu)勢真菌門和屬的組成與含量,如圖2所示。

a-真菌門;b-屬圖2 低溫大曲中核心優(yōu)勢真菌門和屬的相對含量分析Fig.2 Analysis of relative content of core dominant fungal phyla and genera in low-temperature Daqu

由圖2可知,在長治地區(qū)低溫大曲樣品中3個核心優(yōu)勢真菌門分別為毛霉門(Mucoromycota,64.00%)、子囊菌門(Ascomycota,32.81%)和擔子菌門(Basidiomycota,1.36%),7個核心優(yōu)勢真菌屬分別為根霉屬(Rhizopus,59.48%)、曲霉屬(Aspergillus,14.31%)、雙足囊菌屬(Dipodascus,4.15%)、絲畢赤酵母屬(Hyphopichia,3.95%)、梗霉屬(Lichtheimia,2.70%)、根毛霉屬(Rhizomucor,2.36%)和復膜孢酵母屬(Saccharomycopsis,1.70%)。CAI等[20]亦采用高通量測序的方法,發(fā)現(xiàn)湖北襄陽地區(qū)的30個低溫大曲中優(yōu)勢真菌屬為Saccharomycopsis(81.05%)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus,7.47%)和紅曲霉屬(Monascus,3.39%)。由此可見,不同地區(qū)、工藝、原料和環(huán)境等因素可能對于大曲中微生物的組成有一定的影響。值得一提的是,Saccharomycopsis是兩個地區(qū)低溫大曲的共有優(yōu)勢真菌屬,LI等[21]的研究表明隸屬于Saccharomycopsis的扣囊復膜孢酵母菌(S.fibuligera)能產生大量淀粉酶,將淀粉水解成葡萄糖,但它不能將葡萄糖發(fā)酵成乙醇,在白酒釀造中通常與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)混合培養(yǎng)用以提高乙醇的產量。由此可見,積極開發(fā)具有優(yōu)良發(fā)酵特性S.fibuligera的篩選和應用,對于提高大曲的品質可能具有積極意義。

核心優(yōu)勢真菌屬的相關性網絡圖,如圖3所示。

圖3 低溫大曲中核心優(yōu)勢真菌屬的相關性網絡圖Fig.3 Correlation network of core dominant fungal genera in low-temperature Daqu注:實線代表正相關,虛線代表負相關;加粗線段代表P<0.05

由圖3可知,7個核心優(yōu)勢真菌屬之間共存在8個正相關和13個負相關,其中Lichtheimia和Rhizomucor呈顯著正相關(P<0.05),Hyphopichia和Saccharomycopsis亦呈顯著正相關(P<0.05)。DU等[22]的研究表明,Hyphopichia具有一定的耐熱性,并且能產生乙酸乙酯等多種重要的風味物質,是引起大曲表層形成的關鍵真菌。MA等[23]的研究表明,Saccharomycopsis可以產生α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶等各種酶,在將淀粉轉化為可溶性糖方面表現(xiàn)出良好的性能,并對乙酸乙酯、乳酸乙酯和β-苯乙醇等揮發(fā)性化合物的生產過程產生具有積極影響。由此可見,低溫大曲樣品中真菌菌群之間存在一定的關聯(lián)性,其中核心優(yōu)勢真菌屬之間存在明顯的正相關性,這可能是低溫大曲中風味形成的基礎。

本研究進一步在OTU水平上解析了低溫大曲樣品中真菌的菌群結構,繪制了核心優(yōu)勢OTU的瀑布圖,如圖4所示。

圖4 低溫大曲中核心優(yōu)勢OTU的瀑布圖Fig.4 Waterfall diagram of core dominant OTU in low-temperature Daqu

由圖4可知,雖然在所有低溫大曲樣品中均存在的OTU高達207個,但其中核心優(yōu)勢OTU僅有13個,分別為隸屬于Rhizopus的OTU 1978、OTU 1783、OTU 1647、OTU 2047、OTU 783、OTU 2785和OTU 693,其累計平均含量為43.29%;隸屬于Aspergillus的OTU 790和OTU 2266,其累計平均含量為13.27%;隸屬于Dipodascus的OTU 756,其平均含量為4.13%;隸屬于Rhizomucor的OTU 2144,其平均含量為2.34%以及隸屬于Lichtheimia的OTU 141,其平均含量為1.10%。作為納入本研究低溫大曲中含量最豐富的真菌屬,WANG等[24]的研究表明Rhizopus的菌株具有糖化和合成脂肪酶的能力,對酒體風味具有獨特的貢獻。由此可見,長治地區(qū)低溫大曲樣品中蘊含豐富的真菌菌群,解析不同樣品中真菌的菌群組成對于研究大曲的品質具有重要意義。

2.3 長治地區(qū)低溫大曲的風味品質評價

PEN3電子鼻在食品風味和大氣質量的評價中均有廣泛應用[25],其中傳感器W5S、W6S和W1S主要是用于評價大氣中的氮氧化物、氫氣和甲烷含量,故而本研究中對上述3個傳感器進行了屏蔽,使用剩余7個傳感器對低溫大曲的風味品質進行了評價,其響應值箱型圖如圖5所示。

W1C-對芳香味物質靈敏;W3C-對芳香類物質靈敏;W5C-對烷烴、 芳香類物質靈敏;W1W-對有機硫化物、萜類物質靈敏; W2S-對乙醇靈敏;W2W-對有機硫化物靈敏;W3S-對烷烴靈敏圖5 低溫大曲樣品的風味品質評價Fig.5 Flavor quality evaluation of of low-temperature Daqu samples

由圖5可知,納入本研究大曲的風味物質含量相對較少,僅有W1W(對有機硫化物、萜類物質靈敏)和W2S(對乙醇靈敏)2個傳感器在所有樣品中響應值的平均值大于5,可見長治地區(qū)低溫大曲的揮發(fā)性物質含量較少,且主要的揮發(fā)性物質體現(xiàn)在有機硫化物、萜類物質和乙醇上。由圖5亦可知,所有樣品在風味指標上的差異主要表現(xiàn)在W1W上,變異系數(shù)為5.37%,這說明不同樣品中揮發(fā)性風味物質的差異主要在有機硫化物和萜類物質上。有機硫化物作為長治地區(qū)低溫大曲中一個較為突出的風味物質,SONG等[26]的研究表明,2-甲基-3-呋喃硫醇和2-糠基硫醇兩個有機硫化物對清香型和濃香型白酒的總體香氣特征有顯著貢獻,并且這些化合物可用于區(qū)分清香型、濃香型和醬香型白酒。

2.4 長治地區(qū)低溫大曲真菌菌群和風味品質的相關性分析

本研究在解析低溫大曲中的真菌菌群并使用電子鼻識別樣品中揮發(fā)性物質的基礎上,對核心優(yōu)勢真菌屬與風味品質的關聯(lián)性進行了分析,結果如圖6所示。

圖6 低溫大曲中核心優(yōu)勢真菌屬與風味指標的相關性熱圖Fig.6 Heatmap of the correlation between core dominant fungal genera and odor indexes in low-temperature Daqu注:*代表P<0.05

由圖6可知,Rhizomucor與W2W傳感器(對有機硫化物靈敏)的響應值呈顯著正相關(P<0.05),Lichtheimia與W3C傳感器(對芳香類物質靈敏)的響應值呈顯著負相關(P<0.05),由于有機硫化物和芳香類物質是大曲的特征指標,故而Rhizomucor和Lichtheimia對大曲風味的形成具有重要作用。DENG等[27]的研究表明,Rhizomucor可以分解大曲原料中的淀粉,促進丙酮酸和氨基酸的轉化,為其他微生物的生長提供營養(yǎng),并為后期酒精發(fā)酵積累還原糖,此外Rhizomucor還能分泌脂肪酶和蛋白酶,它們在酯、醛、脂肪酸等揮發(fā)性物質的合成過程中起著關鍵作用。FAN等[28]的研究表明Lichtheimia是淀粉酶的主要生產者,表現(xiàn)出水解淀粉的強產糖活性,有研究亦表明乙酸、乙醇、苯乙醇和乙酸乙酯等揮發(fā)性代謝物與Lichtheimia有關。由此可見,積極選育具有提升大曲風味品質特性的Rhizomucor和Lichtheimia菌株,對于提高大曲的品質亦可能具有積極意義。

3 結論

長治地區(qū)低溫大曲中存在豐富的真菌菌群,在門水平上主要由Mucoromycota、Ascomycota和Basidiomycota構成,在屬水平上主要由Rhizopus、Aspergillus、Dipodascus、Hyphopichia、Lichtheimia、Rhizomucor和Saccharomycopsis構成。大曲樣品中主要的揮發(fā)性物質體現(xiàn)在有機硫化物、萜類物質和乙醇上,并且Rhizomucor與有機硫化物呈顯著正相關,Lichtheimia與芳香類物質呈顯正相關。