劉宏基,余有貴*,伍強(qiáng),張旭,萬(wàn)勇,熊翔,楊志龍,譚文君

1(邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院,湖南 邵陽(yáng),422000) 2(生態(tài)釀酒新技術(shù)與應(yīng)用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 邵陽(yáng),422000)3(湖南湘窖酒業(yè)有限公司,湖南 邵陽(yáng),422000)

醬香型白酒是以高粱、小麥、水等為原料,經(jīng)傳統(tǒng)固態(tài)法發(fā)酵、蒸餾、貯存、勾兌而成的,未添加食用酒精及非白酒發(fā)酵產(chǎn)生的呈香呈味呈色物質(zhì),具有醬香風(fēng)格的白酒[1]。醬香型白酒生產(chǎn)工藝獨(dú)特,具有高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、貯存時(shí)間長(zhǎng)、用曲量大、輪次多的“四高兩長(zhǎng)一大一多”工藝特點(diǎn)[2]。醬香型白酒發(fā)酵工藝包括堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵兩部分。高溫堆積發(fā)酵是一個(gè)好氧發(fā)酵過(guò)程,是大曲醬香白酒生產(chǎn)環(huán)節(jié)當(dāng)中必不可少的一個(gè)關(guān)鍵工序,它既要滿足糖化功能的形成,又要滿足發(fā)酵力的生成,還要達(dá)到香味物質(zhì)的形成條件,直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量與產(chǎn)量[3]。窖池發(fā)酵是封閉式無(wú)氧發(fā)酵,醬酒醅在窖池內(nèi)發(fā)酵時(shí)的溫度最高可達(dá)40～48 ℃[4],相比于濃香型白酒和清香型白酒的發(fā)酵溫度要高出很多。窖池高溫發(fā)酵是為酒精的生成和醬香物質(zhì)的最后形成提供合適的發(fā)酵環(huán)境,發(fā)酵的作用是將糖轉(zhuǎn)化成酒,并且使香氣物質(zhì)伴酒而生,形成大曲醬香酒特有的香味和風(fēng)格。近年來(lái),有關(guān)醬香酒發(fā)酵微生物與風(fēng)味物質(zhì)的報(bào)道很多,例如吳成等[5]對(duì)醬香型白酒四輪次堆積發(fā)酵進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)與微生物群落的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),酵母菌主要與醇類(lèi)物質(zhì)呈正相關(guān),細(xì)菌主要與酸類(lèi)和酯類(lèi)物質(zhì)呈正相關(guān);麻穎垚等[6]運(yùn)用宏基因組學(xué)分析醬香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌與代謝功能的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后與發(fā)酵前相比,醇、酸類(lèi)物質(zhì)含量明顯增加,酯類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)豐富,判斷窖內(nèi)發(fā)酵階段菌群的主要代謝功能為碳水化合物代謝和氨基酸代謝。

湖南邵陽(yáng)四面環(huán)山,中間為丘陵盆地,森林覆蓋率高,空氣流動(dòng)慢,資江自西南向東北流貫全境,雨熱同季,獨(dú)特的自然環(huán)境和氣候條件造就了獨(dú)特的微生物區(qū)系,在這個(gè)特定的環(huán)境下所釀造出的醬香型白酒口感特征明顯,第三輪次酒醇甜,第五輪次酒帶焦苦味。細(xì)菌產(chǎn)香,酵母產(chǎn)酒,探究湘產(chǎn)醬香型白酒不同輪次發(fā)酵優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與酵母代謝通路上具有風(fēng)味特征的物質(zhì)的相互關(guān)系,更能體現(xiàn)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的功能所在,對(duì)揭示湘產(chǎn)醬香酒與貴州核心產(chǎn)區(qū)醬香酒相比口感有細(xì)微差異的原因更有幫助,具有明顯的地方特色。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酒醅樣品

30個(gè)樣品均采自湖南湘窖酒業(yè)有限公司醬酒車(chē)間二班組。堆積酒醅樣品從堆積結(jié)束后取樣,每個(gè)樣品為平行堆子上、中、下層酒醅的混合樣品,第三輪次5個(gè)樣品分別記為DJ 3-1～DJ 3-5,歸group 1;第四輪次5個(gè)樣品分別記為DJ 4-1～DJ 4-5,歸group 2;第五輪次5個(gè)樣品分別記為DJ 5-1～DJ 5-5,歸group 3。池內(nèi)發(fā)酵酒醅樣品從出窖后取樣,每個(gè)樣品為平行窖池上、中、下層酒醅的混合樣品,第三輪次5個(gè)樣品分別記為CJ 3-1～CJ 3-5,歸group 4;第四輪次5個(gè)樣品分別記為CJ 4-1～CJ 4-5,歸group 5;第五輪次5個(gè)樣品分別記為CJ 5-1～CJ 5-5,歸group 6。將每個(gè)混合樣品分成兩份,-80 ℃保存,進(jìn)行代謝組學(xué)分析和微生物組成分析。

1.1.2 試劑

水、甲醇、氯仿、甲氧胺鹽酸鹽吡啶、正己烷,德國(guó)CNW Technologies GmbH公司;辛酸甲酯(C8∶0)、壬酸甲酯(C9∶0)、癸酸甲酯(C10∶0)、十二烷酸甲酯/月桂酸甲酯(C12∶0)、十四烷酸甲酯/肉豆蔻酸甲酯(C14∶0)、十六烷酸甲酯/棕櫚酸甲酯(C16∶0)、十八烷酸甲酯/硬脂酸甲酯(C18∶0)、二十烷酸甲酯/花生酸甲酯(C20∶0)、二十二烷酸甲酯/山俞酸甲酯(C22∶0)、二十四烷酸甲酯/木蠟酸甲酯(C24∶0)、二十六烷酸甲酯(C26∶0),瑞典Larodan生物公司;乙腈、L-2-氯苯丙氨酸,上海恒創(chuàng)生物;DNA抽提試劑盒、Qubit dsDNA檢測(cè)試劑盒,德國(guó)凱杰生物公司;Agcourt AMPure XP純化磁珠,美國(guó)Beckman生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SB-5200DT超聲波清洗機(jī),寧波新芝生物科技有限公司;LNG-T98冷凍濃縮離心干燥器,太倉(cāng)市華美生化儀器廠;TYXH-I漩渦振蕩器,上海汗諾儀器有限公司;TGL-16MS高速冷凍離心機(jī),上海盧湘儀儀器有限公司;THZ-82A氣浴恒溫振蕩器,江蘇環(huán)宇科學(xué)儀器廠;DZF-6021真空干燥箱,上海慧泰有限公司;7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱,美國(guó)安捷倫公司;NovaSeq 6000測(cè)序儀器,美國(guó)Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 代謝風(fēng)味物質(zhì)分析

前處理:稱取60 mg樣本,放入1.5 mL的離心管中;加入2顆小鋼珠,加入600 μLV(甲醇)∶V(水)=1∶1(含2 μg/mLL-2-氯苯丙氨酸);在-40 ℃冰箱中預(yù)冷2 min后,放入研磨機(jī)中研磨(60 Hz,2 min);冰水浴超聲提取30 min;加入150 μL的氯仿,渦旋儀中渦旋2 min;冰水浴超聲提取30 min;-40 ℃靜置30 min;低溫離心10 min(13 000 r/min,4 ℃),取150 μL的上清液裝入玻璃衍生小瓶中;用離心濃縮干燥器揮干樣本;向玻璃衍生小瓶中加入80 μL的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液(15 mg/mL),渦旋振蕩2 min后,于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱中60 min,進(jìn)行肟化反應(yīng);將樣本取出后再加入50 μL的BSTFA衍生化試劑和20 μL的正己烷,加入10種內(nèi)標(biāo)(C8/C9/C10/C12/C14/C16/C18/C20/C22/C24,均為氯仿配制)10 μL,渦旋振蕩2 min后,于70 ℃反應(yīng)60 min;取出樣本后,在室溫放置30 min,進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)分析。

色譜條件:DB-5MS毛細(xì)管柱,載氣為高純氦氣(純度≥99.999%),流速1.0 mL/min,進(jìn)樣口的溫度為260 ℃。進(jìn)樣量1 μL,不分流進(jìn)樣,溶劑延遲6.2 min。柱溫箱的初始溫度為60 ℃,保持0.5 min;以8 ℃/min程序升溫至125 ℃;8 ℃/min升溫至210 ℃;15 ℃/min升溫至270 ℃;20 ℃/min升溫至305 ℃,保持5 min。質(zhì)譜條件:電子轟擊離子源(EI),離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式(SCAN),質(zhì)量掃描范圍:m/z50～500。

1.3.2 微生物組成分析

采用DNA抽提試劑盒對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度。使用V3、V4前端引物343F(5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′)和后端引物798R(5′-AGGGTATCTAATCCT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA基因[7],使用真菌的前端引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和后端引物ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)擴(kuò)增ITS區(qū)域[8]。PCR產(chǎn)物用Agcourt AMPure XP珠純化,用Qubit dsDNA檢測(cè)試劑盒定量,然后調(diào)整濃度進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序在Illumina NovaSeq 6000上進(jìn)行,兩個(gè)成對(duì)末端讀取周期各250個(gè)堿基(Illumina公司,圣地亞哥,加州;OE生物科技公司;中國(guó)上海)。

原始數(shù)據(jù)為FASTQ格式。首先使用cutadapt軟件,對(duì)raw data序列,剪切掉引物序列,然后使用DADA2,將上一步合格的雙端raw data按照QIIME 2(2020.11)默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾,降噪,拼接及去嵌合體等質(zhì)控分析[9-10],得到代表序列及擴(kuò)增子序列變異(amplicon sequence variants,ASV)豐度表格。使用QIIME 2軟件包挑選出各個(gè)ASV的代表序列后,并將所有代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋,16S使用Silva(version138)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),ITS使用Unite數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。物種比對(duì)注釋使用q2-feature-classifier軟件默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)屬水平分類(lèi)操作單元(operational taxonomic units,OTUs)的相對(duì)豐度計(jì)算微生物群落組成,采用pheatmap軟件包進(jìn)行相關(guān)性分析,并采用相關(guān)熱圖進(jìn)行可視化,在屬水平上顯示代謝風(fēng)味物質(zhì)與微生物之間的關(guān)系。繪圖利用R包實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物的群落結(jié)構(gòu)組成

在屬水平下,根據(jù)豐度排序Top15細(xì)菌屬繪圖如圖1所示,堆積發(fā)酵的細(xì)菌屬中,乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、克羅彭施泰特氏菌屬(Kroppenstedtia)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、枝芽胞桿菌屬(Virgibacillus)、羅爾斯通菌屬(Ralstonia)、意大利小海員菌屬(Nautella)和芽孢桿菌屬(Bacillus)的相對(duì)豐度較高,與第四、五輪次相比,第三輪次堆積發(fā)酵酒醅中細(xì)菌區(qū)系差異更大,整體上不及第四、五輪次豐富,這與用曲量、酒醅酸度和環(huán)境溫度有關(guān),第三、四、五輪次投曲量是依次減少的,第三輪次酸度要低于第四、五輪次,第三輪次堆積發(fā)酵時(shí)環(huán)境溫度也更低。第四、五輪次堆積酒醅細(xì)菌群系更豐富說(shuō)明第四、五輪次堆積發(fā)酵更全面,細(xì)菌代謝物更豐富,為四、五輪次基酒風(fēng)味更飽滿、酒質(zhì)更優(yōu)創(chuàng)造了很好的前提條件。Lactobacillus在第四輪次堆積酒醅樣品中相對(duì)豐度高達(dá)58%,有研究表明,Lactobacillus在貴州核心產(chǎn)區(qū)的堆積酒醅中和車(chē)間釀造環(huán)境中均比較豐富,作為有益菌群參與醬香酒的堆積發(fā)酵過(guò)程[10-11]。Kroppenstedtia在第四輪次堆積酒醅樣品中占比最高,達(dá)39%,Kroppenstedtia屬于嗜熱菌屬,在其他菌屬無(wú)法正常生長(zhǎng)的高溫環(huán)境下,它依然可以保持較高的活性[12]。Virgibacillus在第三輪次堆積發(fā)酵酒醅中的相對(duì)豐度明顯低于第四、五輪次,這與酒醅的酸度密切相關(guān),Virgibacillus可利用麥芽糖、果糖、蔗糖、葡萄糖產(chǎn)酸,可為發(fā)酵產(chǎn)生物淀粉酶、蛋白酶。Bacillus能降解淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)產(chǎn)生一些生物活性物質(zhì),它們是醬香酒風(fēng)味物質(zhì)的前體[13]。窖池發(fā)酵的細(xì)菌屬中,Lactobacillus占比最大,是窖池發(fā)酵的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)功能細(xì)菌屬,Lactobacillus的生長(zhǎng)代謝與發(fā)酵酒醅的溫度密切相關(guān),它的代謝消長(zhǎng)可以直接影響整個(gè)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的演替[14]。極端嚴(yán)格好氧菌醋酸桿菌屬(Acetobacter)能產(chǎn)生細(xì)菌纖維素,氧化葡萄糖和乙醇,轉(zhuǎn)化成影響醬香酒風(fēng)味的酯類(lèi)物質(zhì)[15],它在第三輪次～第五輪次發(fā)酵細(xì)菌屬中的占比依次降低,在第五輪次堆積發(fā)酵酒醅樣品中基本未檢出,在出窖酒醅中相對(duì)豐度極低。WANG等[16]對(duì)北方醬香酒第五、六輪次酒醅發(fā)酵優(yōu)勢(shì)細(xì)菌研究發(fā)現(xiàn),3個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬分別為L(zhǎng)actobacillus、大洋芽孢桿菌(Oceanobacillus)、Virgibacillus,與湖南地區(qū)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬基本相同,但由于氣候環(huán)境的差異,各地優(yōu)勢(shì)菌群豐度有所不同。

圖1 不同輪次發(fā)酵酒醅優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬群落結(jié)構(gòu)組成Fig.1 Dominant bacterial community structure of fermented grains collected from different fermentation cycle of soy sauce aroma style Baijiu

在屬水平下,根據(jù)豐度排序Top15的真菌屬組成如圖2所示,在堆積發(fā)酵的真菌屬中,紅曲霉屬(Monascus)、畢赤酵母屬(Pichia)、絲依霉屬(Byssochlamys)、釀酒酵母屬(Saccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、擬青霉屬(Paecilomyces)、近地傘屬(Parasola)和嗜熱絲孢菌屬(Thermomyces)的相對(duì)豐度較高,其中Monascus的相對(duì)豐度最高達(dá)96%,在第四輪次堆積酒醅真菌屬中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。Monascus具有較高的產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的能力,對(duì)于醬香酒風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要貢獻(xiàn)[17],沈毅等[18]從四川郎酒的大曲、酒醅和窖泥中對(duì)比分析得知四川產(chǎn)區(qū)醬酒醅中Monascus的相對(duì)豐度也很高。Byssochlamys在第三輪次和第五輪次堆積酒醅中占比高,Byssochlamys能產(chǎn)生耐熱的子囊孢子,在85 ℃以上的環(huán)境中都能存活,并且在低氧條件下也能保持較高的活力,它能產(chǎn)生果膠分解酶,有利于酒醅糖化[19]。窖池發(fā)酵的真菌屬中,第三輪次Thermoascus占比最高,第四輪次Monascus占比最高,第五輪次Parasola占比最高。Thermoascus是一種耐熱性較強(qiáng)的菌屬,能長(zhǎng)時(shí)間在45 ℃以上的高溫環(huán)境中正常生長(zhǎng)代謝,代謝產(chǎn)生耐熱的纖維素酶和木聚糖酶[20]。有研究表明,Thermoascus為貴州核心產(chǎn)區(qū)醬香型大曲中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌屬[21],說(shuō)明發(fā)酵酒醅中Thermoascus來(lái)源于高溫大曲,其豐度表現(xiàn)與用曲量密切相關(guān)。從堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵一個(gè)完整的發(fā)酵輪次來(lái)看,第三、四、五輪次優(yōu)勢(shì)真菌屬Saccharomyces的相對(duì)豐度表現(xiàn)很穩(wěn)定,且每一輪次池內(nèi)發(fā)酵Saccharomyces的豐度要高于同輪次堆積發(fā)酵。釀酒酵母是醬香型白酒釀造中最常見(jiàn)的產(chǎn)乙醇的真菌微生物,在發(fā)酵過(guò)程中它不僅可以產(chǎn)生大量的乙醇,還可以將原輔料中的氨基酸等物質(zhì)轉(zhuǎn)化成各種風(fēng)味成分[22],對(duì)醬香酒的風(fēng)味形成具有非常重要的作用。

圖2 不同輪次發(fā)酵酒醅優(yōu)勢(shì)真菌屬群落結(jié)構(gòu)組成Fig.2 Dominant fungal community structure of fermented grains collected from different fermentation cycle of soy sauce aroma style Baijiu

2.2 差異代謝產(chǎn)物的篩選與鑒定

對(duì)30個(gè)發(fā)酵酒醅樣品進(jìn)行代謝組學(xué)鑒定,共鑒定出269個(gè)代謝物,按照發(fā)酵輪次進(jìn)行分組共篩選出74個(gè) 差異代謝物,見(jiàn)附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035367)。包括有機(jī)氧化合物24個(gè),羧酸及衍生物8個(gè),脂肪?；?lèi)化合物7個(gè),核苷酸類(lèi)4個(gè),甘油酯類(lèi)2個(gè),內(nèi)酯類(lèi)2個(gè),有機(jī)氮化合物 2個(gè),呋喃類(lèi)1個(gè),黃酮類(lèi)1個(gè),其他類(lèi)23個(gè)。將主要差異代謝產(chǎn)物映射到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出7條顯著的代謝通路[23],均與釀酒酵母相關(guān),選擇顯著性富集pathway進(jìn)行氣泡圖繪制,如圖3所示。7條顯著性代謝通路分別為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白代謝、β-丙氨酸代謝、磷酸戊糖途徑代謝、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯相互轉(zhuǎn)化和丙酮酸代謝。

圖3 代謝通路富集氣泡圖Fig.3 Enrichment bubble plot of metabolic pathway

附表1顯示,所有差異代謝物中葡萄糖的相對(duì)表達(dá)量最高,第三輪次堆積發(fā)酵為4.250±0.465,窖池發(fā)酵為2.475±0.135,第四輪次堆積發(fā)酵為2.541±0.074,窖池發(fā)酵為1.073±0.201,第五輪次堆積發(fā)酵為2.520±0.441,窖池發(fā)酵為0.358±0.031,整體上表達(dá)量第三輪次高于第四、五輪次,葡萄糖與發(fā)酵前期霉菌及其所產(chǎn)酶對(duì)淀粉的糖化密切相關(guān),它為活細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng),是糖酵解糖異生和蛋白質(zhì)代謝的重要基礎(chǔ),是醬香酒發(fā)酵中最主要的糖,在發(fā)酵過(guò)程中被酵母充分利用產(chǎn)生酒精。L-谷氨酰胺是β-丙氨酸代謝的前體,在第三輪次堆積發(fā)酵酒醅樣品中的相對(duì)表達(dá)量為1.744±0.049,第四輪次堆積發(fā)酵為0.390±0.751,第五輪次堆積發(fā)酵為0.018±0.001,呈明顯依次下降的趨勢(shì),窖池發(fā)酵同樣是第三輪次的相對(duì)表達(dá)量最高,表明在第三輪次發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖和谷氨酰胺的代謝較為旺盛。D-甘露糖在第三輪次堆積發(fā)酵酒醅中的相對(duì)表達(dá)量為1.954±0.476,高于第四、五輪次,在第三輪次窖池發(fā)酵酒醅中的相對(duì)表達(dá)量為0.534±0.110,同樣高于第四、五輪次。D-甘露糖是一種低熱量的單糖,甜度分別是蔗糖和葡萄糖的60%和86%[24],它是釀酒酵母細(xì)胞壁的主要組成成分。D-甘露糖是合成甘露糖醇的前體,通過(guò)果糖和甘露糖代謝途徑轉(zhuǎn)化成D-甘露糖醇,D-甘露糖醇呈甜味,水溶液中甜味閾值達(dá)40.0 mmol/L,具有涼爽感[25],D-甘露糖醇可能是讓第三輪次酒具有醇甜且尾爽凈特點(diǎn)的重要風(fēng)味物質(zhì)之一。D-木酮糖是阿拉伯糖醇的前體物質(zhì),參與磷酸戊糖途徑以及戊糖和葡萄糖醛酸酯相互轉(zhuǎn)化,阿拉伯糖醇呈甜味,水溶液中甜味閾值達(dá)43.1 mmol/L[25]。D-木酮糖在第三輪次窖池發(fā)酵酒醅中的相對(duì)表達(dá)量為0.330±0.015,高于第四輪次和第五輪次,堆積發(fā)酵酒醅相對(duì)表達(dá)量同樣也是第三輪次最高,D-木酮糖可能是讓第三輪次酒具有醇甜口感的重要前體物質(zhì)。海藻糖是酵母進(jìn)行ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白代謝、淀粉與蔗糖代謝的產(chǎn)物,海藻糖穩(wěn)定性強(qiáng),能維持生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能,是評(píng)價(jià)酵母乙醇耐受性的重要指標(biāo)[26]。海藻糖呈甜味,在第三輪次堆積發(fā)酵酒醅中的相對(duì)表達(dá)量為0.894±0.125,高于第四輪次和第五輪次,海藻糖可能是讓第三輪次酒具有醇甜口感的重要前體物質(zhì)。異麥芽糖在第三輪次堆積發(fā)酵酒醅中的相對(duì)表達(dá)量為1.563±0.144,窖池發(fā)酵酒醅中的相對(duì)表達(dá)量為0.558±0.056,整體上第四輪次和第五輪次與之相比要低很多,表明第三輪次發(fā)酵過(guò)程中淀粉酶分解淀粉以及葡萄糖焦糖化反應(yīng)旺盛。亞麻酸呈焦苦味,帶澀,水溶液中苦味閾值為0.6～1.2 mmol/L[25],參與釀酒酵母α-亞麻酸代謝過(guò)程。亞麻酸在第五輪次堆積發(fā)酵酒醅中的相對(duì)表達(dá)量為0.206±0.008,窖池發(fā)酵酒醅中的相對(duì)表達(dá)量為0.171±0.004,明顯高于第三輪次和第四輪次,亞麻酸可能是造成第五輪次酒具有焦苦口感的重要風(fēng)味物質(zhì)。

2.3 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與主要差異代謝物的關(guān)聯(lián)分析

微生物的代謝產(chǎn)物種類(lèi)含量的不同是造成第三、四、五輪次酒具有細(xì)微口感差別的關(guān)鍵原因,優(yōu)勢(shì)細(xì)菌與差異代謝物的關(guān)聯(lián)更是體現(xiàn)其功能所在?；谙嚓P(guān)性分析計(jì)算細(xì)菌和代謝物數(shù)據(jù)間的關(guān)聯(lián)性,選取P<0.05的關(guān)系對(duì)繪制成網(wǎng)絡(luò)圖[27-28],見(jiàn)圖4。黃色線代表正相關(guān),藍(lán)色線代表負(fù)相關(guān),線的粗細(xì)代表相關(guān)性系數(shù)的高低。

圖4 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與差異代謝物相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Network diagram of correlation between dominant bacterial genera and differential metabolites

差異代謝物與優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的相關(guān)性分析表明,Kroppenstedtia與海藻糖和油酸酰胺呈正相關(guān),與D-木酮糖和己糖呈負(fù)相關(guān);Virgibacillus與海藻糖和油酸酰胺呈正相關(guān),與D-木酮糖和己糖呈負(fù)相關(guān);Oceanobacillus與松三糖、乳糖醇、海藻糖和油酸酰胺呈正相關(guān),與D-木酮糖和己糖呈負(fù)相關(guān);Bacillus與海藻糖和油酸酰胺呈正相關(guān),與D-木酮糖和己糖呈負(fù)相關(guān);Staphylococcus與海藻糖和油酸酰胺呈正相關(guān),己糖呈負(fù)相關(guān)。Kroppenstedtia、Virgibacillus、Oceanobacillus、Bacillus和Staphylococcus均與海藻糖和油酸酰胺呈正相關(guān),表明這5個(gè)細(xì)菌屬對(duì)釀酒酵母進(jìn)行ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白代謝和淀粉與蔗糖代謝起到了很好的協(xié)同作用,對(duì)脂肪酸的生物合成起到了很好的促進(jìn)作用。Kroppenstedtia、Virgibacillus、Oceanobacillus、Bacillus和Staphylococcus均與D-木酮糖呈負(fù)相關(guān),表明這5個(gè)細(xì)菌屬共同參與了磷酸戊糖途徑以及戊糖和葡萄糖醛酸酯相互轉(zhuǎn)化,參與了阿拉伯糖醇的調(diào)控,對(duì)縮小不同輪次醬香型白酒醇甜口感差異具有重要作用。

3 結(jié)論與討論

基于微生物多樣性檢測(cè)探究了不同輪次發(fā)酵酒醅中細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)特征,基于GC-MS非靶向代謝組學(xué)分析了醬香酒不同輪次發(fā)酵酒醅代謝產(chǎn)物的差異,與微生物的聯(lián)合分析表明,8個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中有5個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬對(duì)釀酒酵母的關(guān)鍵代謝具有協(xié)同作用,這為人工改善醬香酒發(fā)酵微生態(tài)提供了理論支撐。另外,海藻糖、D-木酮糖、D-甘露糖等對(duì)第三輪次酒醇甜口感的影響、亞麻酸對(duì)第五輪次酒焦苦口感的影響還需進(jìn)一步驗(yàn)證,這是研究醬香型白酒黃金輪次酒口感細(xì)微差異亟需解決的問(wèn)題,對(duì)定向調(diào)控發(fā)酵酒醅特征代謝物的合成進(jìn)程,提升醬香型白酒品質(zhì)具有重要意義。