盧知浩,趙曉涵,裴晨皓,馮曉文,程青麗,谷瑞增,李國(guó)明*,劉文穎*

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京,100015) 2(北京城市學(xué)院 生物醫(yī)藥學(xué)部,北京,100083)

中國(guó)作為糧食生產(chǎn)消費(fèi)大國(guó),對(duì)糧食作物的開(kāi)發(fā)利用是國(guó)內(nèi)研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。玉米和小麥?zhǔn)俏覈?guó)傳統(tǒng)的種植作物,利用酶解等方法對(duì)糧食原料進(jìn)一步加工可從中獲得相應(yīng)的低聚肽[1]。相關(guān)研究表明玉米低聚肽(以下簡(jiǎn)稱(chēng)玉米肽)和小麥低聚肽(以下簡(jiǎn)稱(chēng)小麥肽)在抗腫瘤[2]、抗氧化[3-4]、降血壓[5-6]等方向展現(xiàn)了多樣的生物活性,在作為功能性食品基礎(chǔ)原料等研究中有巨大的應(yīng)用價(jià)值。肽可作為主體與客體金屬離子配位,進(jìn)而形成肽-金屬螯合物。該類(lèi)結(jié)構(gòu)利用肽的吸收機(jī)制提高了金屬離子的生物利用率,可進(jìn)一步發(fā)展為新型金屬離子補(bǔ)充劑,有助于對(duì)微量元素的吸收[7-10]。

隨著人們對(duì)自身健康的重視程度提高,食品藥品的抗氧化能力和抗過(guò)敏活性成為該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。肽-金屬螯合物獨(dú)特的功能結(jié)構(gòu)使其在食藥領(lǐng)域有廣闊的發(fā)展前景,但目前肽-金屬螯合物的研究主要集中在制備工藝、金屬離子吸收和抗菌活性等方向[11-13],對(duì)螯合物的抗氧化作用和抗過(guò)敏活性的研究則相對(duì)少見(jiàn)[14-15]。鈣和鐵作為人體的必需元素常被選為螯合物研究中的客體金屬離子,但該兩種元素與小麥肽、玉米肽的螯合物研究并不常見(jiàn),注重于該類(lèi)螯合物的抗氧化作用和抗過(guò)敏活性的研究也更為稀少。

本文選擇無(wú)水氯化鈣和氯化亞鐵分別作為鈣源和鐵源制得的新型的玉米肽-Ca螯合物和小麥肽-Fe螯合物,對(duì)玉米肽、小麥肽和兩種螯合物的抗氧化和抗過(guò)敏活性進(jìn)行研究,為相關(guān)螯合物在生物活性方向和食品應(yīng)用方向研究的進(jìn)一步發(fā)展提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

玉米低聚肽、小麥低聚肽,浙江海氏生物科技有限公司;DPPH(色譜純),Biotopped公司;乙腈(色譜純),Fisher公司;水楊酸(分析純),天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;無(wú)水氯化鈣、七水合硫酸亞鐵、氯化鐵、抗壞血酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無(wú)水乙醇(均為分析純),北京化工廠;三氯乙酸、氯化亞鐵、鐵氰化鉀(均為分析純),天津市福晨化學(xué)試劑廠;30%過(guò)氧化氫(分析純),西隴化工股份有限公司;三氟乙酸(分析純),美國(guó)Alfa Aesar公司;去離子水,實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 儀器與設(shè)備

F30200150凱氏定氮儀,意大利Velp Scientifica公司;KQ-250E超聲波振蕩器,昆山市超聲儀器有限公司;Dynex Spectra Mr酶標(biāo)儀、EL20pH計(jì),瑞士Mettler Toledo公司;1204007恒溫水浴鍋,蘇州珀西瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,北京陸?？萍加邢薰?LC-20AD高效液相色譜儀,日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料低聚肽理化性質(zhì)分析

參考QB/T 5298—2018和QB/T 4707—2014,分別對(duì)原料小麥肽和玉米肽進(jìn)行理化性質(zhì)分析[16-17]。

1.2.2 肽-金屬螯合物的合成

1.2.2.1 玉米低聚肽-Ca螯合物

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的玉米低聚肽水溶液。調(diào)節(jié)溶液pH=5后,加入一定量無(wú)水氯化鈣使玉米低聚肽與無(wú)水氯化鈣質(zhì)量比為8∶1。50 ℃下攪拌反應(yīng)60 min。冷卻至室溫后,加入4倍體積95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇進(jìn)行醇沉,靜置過(guò)夜。在4 000 r/min下離心20 min后,將沉淀取出置于37 ℃烘箱干燥,得到目標(biāo)螯合物。

1.2.2.2 小麥低聚肽-Fe螯合物

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的小麥低聚肽水溶液。向溶液中加入一定量抗壞血酸使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。調(diào)節(jié)溶液pH=5后,加入一定量氯化亞鐵使小麥低聚肽與氯化亞鐵質(zhì)量比為10∶1。75 ℃下攪拌反應(yīng)65 min。冷卻至室溫后,加入4倍體積95%乙醇進(jìn)行醇沉,靜置過(guò)夜。在4 000 r/min下離心20 min后,將沉淀取出置于37 ℃烘箱干燥,得到目標(biāo)螯合物。

1.2.3 抗氧化能力測(cè)試

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定[18]

配制不同質(zhì)量濃度的樣品水溶液,于96孔板中分別加入200 μL樣品溶液與等體積0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混合,室溫避光反應(yīng)30 min后,測(cè)定反應(yīng)液在517 nm的吸光度(AX1)。將DPPH乙醇溶液替換為無(wú)水乙醇作為對(duì)照組,將樣品溶液替換為去離子水作為空白組,將無(wú)水乙醇與去離子水等體積混合溶液作為溶劑組,進(jìn)行相似實(shí)驗(yàn)操作,并分別測(cè)定各反應(yīng)液的吸光度(空白組為A01,對(duì)照組為A11,溶劑組為AS1)。對(duì)樣品DPPH自由基清除率(X1)的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.2.3.2 羥自由基清除能力測(cè)定[19]

配制濃度為5 mmol/L的水楊酸乙醇溶液、過(guò)氧化氫水溶液和硫酸亞鐵水溶液,以及不同濃度的樣品水溶液。分別取100 μL樣品溶液、200 μL水楊酸溶液和200 μL硫酸亞鐵溶液依次加入到2 mL離心管中。加入100 μL過(guò)氧化氫溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng),搖勻后置于37 ℃水浴。反應(yīng)1 h后取反應(yīng)液200 μL加入到96孔板中,測(cè)定其在510 nm的吸光度(AX2)。對(duì)照組將過(guò)氧化氫溶液替換為去離子水啟動(dòng)反應(yīng)。空白組將樣品溶液替換為去離子水,溶劑組將樣品溶液和過(guò)氧化氫溶液均替換為去離子水,進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)操作,分別測(cè)定反應(yīng)液吸光度(空白組為A02,對(duì)照組為A12,溶劑組為AS2)。對(duì)樣品羥自由基清除率(X2)的計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

1.2.3.3 還原能力測(cè)定[20]

配制0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.8),質(zhì)量濃度10 g/L的鐵氰化鉀水溶液,質(zhì)量濃度100 mg/mL 的三氯乙酸水溶液和質(zhì)量濃度1 mg/mL的氯化鐵水溶液,以及不同濃度的樣品水溶液。分別取100 μL磷酸鹽緩沖溶液、鐵氰化鉀溶液和樣品溶液置于2 mL離心管中,搖勻后在50 ℃水浴下保溫。保溫20 min后加入100 μL三氯乙酸溶液。取100 μL 反應(yīng)液置于96孔板中,加入100 μL去離子水和20 μL氯化鐵溶液,放置10 min后測(cè)定反應(yīng)液在700 nm處吸光度AX3。

1.2.4 螯合物抗過(guò)敏活性測(cè)試[21]

配制0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.6)和不同濃度的樣品水溶液。取0.5 mL樣品溶液和0.5 mL 500 unit/mL透明質(zhì)酸酶溶液(醋酸-醋酸鈉緩沖液作溶劑)混合。37 ℃下保溫20 min后,加入0.1 mL 2.5 mol/L氯化鈣水溶液,37 ℃下保溫20 min。加入0.5 mL 0.6 mg/mL透明質(zhì)酸鈉溶液(醋酸-醋酸鈉緩沖液作溶劑)。37 ℃保溫40 min后,室溫放置10 min。加入0.5 mL去離子水、0.1 mL 5 mol/L 氫氧化鈉水溶液、1 mL新鮮配制乙酰丙酮溶液(3.5 mL乙酰丙酮溶于50 mL 1.0 mol/L碳酸鈉溶液)混合,沸水水浴15 min后立即冰浴10 min,放置室溫10 min后加入1 mL P-DAB試劑(0.8 g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶于15 mL濃鹽酸和15 mL無(wú)水乙醇混合均勻),充分振蕩后加無(wú)水乙醇至8 mL,放置30 min顯色。將透明質(zhì)酸酶溶液和透明質(zhì)酸鈉溶液均替換為醋酸-醋酸鈉緩沖液作為對(duì)照組,將樣品溶液替換為去離子水作為空白組,將對(duì)照組中樣品溶液替換為去離子水作為溶劑組,分別測(cè)定4組反應(yīng)液在530 nm下的吸光度(樣品組為Ax4,空白組為A04,對(duì)照組為A14,溶劑組為As4)。對(duì)樣品透明質(zhì)酸酶抑制率(X4)的計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 原料低聚肽理化性質(zhì)分析

參考QB/T 5298—2018和QB/T 4707—2014及其中國(guó)標(biāo)測(cè)試方法,測(cè)定了2種低聚肽的理化性質(zhì)(表1)。由表1可知,2種低聚肽樣品中水分和灰分含量均小于5%,蛋白含量則均高達(dá)86%,表明樣品中蛋白含量高。樣品酸溶蛋白含量均超過(guò)80%,重均分子量<500,表明2種低聚肽成分多為二肽或三肽,易于被人體消化吸收,適用于進(jìn)一步的食品加工。

表1 原料低聚肽理化性質(zhì)參數(shù)Table 1 Physicochemical properties of oligopeptides

2.2 螯合物抗氧化能力

2.2.1 DPPH自由基清除能力

DPPH結(jié)構(gòu)中苯環(huán)的位阻效應(yīng)和π-π共軛使其中心氮原子上的不成對(duì)電子可穩(wěn)定存在,形成自由基?？寡趸瘎┑碾娮涌膳c自由基的電子配對(duì)進(jìn)而清除自由基,故采用測(cè)定DPPH自由基清除率的方式可評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力。由圖1可知,底物多肽和相應(yīng)的螯合物均有很好的DPPH自由基清除能力,實(shí)驗(yàn)最終清除率均可達(dá)到84%,但均遠(yuǎn)弱于抗壞血酸的DPPH自由基清除能力。利用樣品的DPPH自由基清除率隨濃度變化的曲線可計(jì)算樣品的IC50(表2)。玉米肽-Ca螯合物的IC50雖小于玉米肽的IC50,但在最終質(zhì)量濃度10 mg/mL時(shí)玉米肽-Ca螯合物的清除率大于玉米肽本身,質(zhì)量濃度>1 mg/mL時(shí)兩樣品清除率之間也均沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。結(jié)合清除率隨濃度變化的曲線和顯著性分析綜合判斷,可認(rèn)為玉米肽與其鈣螯合物的DPPH自由基清除能力基本相同,無(wú)還原性鈣離子的加入對(duì)玉米肽的DPPH自由基清除能力沒(méi)有明顯影響。小麥肽-Fe螯合物的清除率隨濃度增長(zhǎng)則明顯快于其他低聚肽或螯合物,其IC50也因此更小,推測(cè)原因是螯合物本身帶有的Fe2+具有強(qiáng)還原性,使螯合物在極低濃度下清除率即可達(dá)到85%,表明小麥肽-Fe螯合物的DPPH自由基清除能力明顯強(qiáng)于小麥肽本身。

a-玉米肽、小麥肽、玉米肽-Ca;b-小麥肽-Fe;c-抗壞血酸圖1 螯合產(chǎn)物、低聚肽和抗壞血酸的DPPH自由基清除能力Fig.1 The DPPH radical scavenging ability of chelates, oligopeptides, and ascorbic acid

表2 螯合產(chǎn)物、低聚肽和抗壞血酸清除DPPH自由基IC50和實(shí)驗(yàn)最終清除率Table 2 The IC50 value and ending ratio for DPPH radical scavenging of chelates, oligopeptides and ascorbic acid

2.2.2 羥自由基清除能力

羥自由基具有極強(qiáng)的得電子能力,氧化電位為2.8 V,僅次于單質(zhì)氟,因此常被用于評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力。如圖2所示,所測(cè)樣品中兩類(lèi)肽-金屬螯合物有較強(qiáng)的羥自由基清除能力,清除率可達(dá)80%,但弱于作為對(duì)照的抗壞血酸。而用于合成螯合物的原料低聚肽和金屬離子(鈣離子一般無(wú)還原性故省略)的清除能力不強(qiáng),在實(shí)驗(yàn)濃度范圍中清除率未過(guò)40%,其中具有強(qiáng)還原性的氯化亞鐵清除率約為11%。利用樣品的羥自由基清除率隨濃度變化的曲線可計(jì)算樣品的IC50(表3)。由上述現(xiàn)象,可見(jiàn)低聚肽與金屬離子螯合后其羥自由基清除能力明顯增強(qiáng),各濃度下螯合物樣品清除率顯著高于單體的清除率(P<0.05)。螯合物客體金屬離子所測(cè)得的清除率最低,由此推測(cè)實(shí)驗(yàn)中樣品清除羥自由基主要依靠低聚肽結(jié)構(gòu)。螯合物的清除能力強(qiáng)于低聚肽本身,且清除率也大于低聚肽和金屬離子清除率的加和,推測(cè)其原因是客體金屬離子與主體低聚肽配位改變了低聚肽的電荷分布,使低聚肽更偏向于負(fù)電性,更易向自由基提供電子進(jìn)而將自由基清除。

a-螯合產(chǎn)物、低聚肽、氯化亞鐵;b-抗壞血酸圖2 螯合產(chǎn)物、低聚肽、氯化亞鐵和抗壞血酸的羥自由基清除能力Fig.2 The hydroxyl radical scavenging ability of chelates, oligopeptides, ferrous chloride, and ascorbic acid

表3 螯合產(chǎn)物、低聚肽、氯化亞鐵和抗壞血酸清除羥自由基IC50和實(shí)驗(yàn)最終清除率Table 3 The IC50 value and ending ratio for hydroxyl radical scavenging of chelate, oligopeptide, ferrous chloride and ascorbic acid

2.2.3 還原能力測(cè)試

利用鐵氰化鉀和氯化鐵與樣品產(chǎn)生普魯士藍(lán)進(jìn)行的還原能力測(cè)試也是評(píng)價(jià)抗氧化能力的常見(jiàn)方式。圖3顯示出與圖1類(lèi)似的現(xiàn)象。玉米肽與其螯合物吸光度隨濃度變化相似,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)吸光度可達(dá)0.3～0.4,在約10 mg/mL時(shí)吸光度已沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。小麥肽-Fe螯合物與氯化亞鐵因其內(nèi)含有鐵元素,其吸光度可達(dá)3.5～4.0,與小麥肽本身(實(shí)驗(yàn)吸光度最大值為0.45)有明顯不同。小麥肽-Fe螯合物與氯化亞鐵兩者實(shí)驗(yàn)最終吸光度沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),但吸光度增長(zhǎng)趨勢(shì)發(fā)生明顯變化的濃度不同。氯化亞鐵在4 mg/mL開(kāi)始曲線趨于平緩,而小麥肽-Fe螯合物則在8 mg/mL曲線不再上升,推測(cè)該現(xiàn)象是因?yàn)橄嗤瑵舛鹊膬煞N樣品中鐵元素濃度不同,氯化亞鐵的鐵元素濃度更大也因此增長(zhǎng)趨勢(shì)發(fā)生明顯變化的濃度較小。也由此推測(cè)小麥肽-Fe螯合物的還原能力主要依靠客體亞鐵離子。以具有強(qiáng)還原性的抗壞血酸作為對(duì)照,其曲線趨于平緩的濃度遠(yuǎn)小于其他樣品,實(shí)驗(yàn)最終吸光度可達(dá)0.4,與不含鐵元素的樣品類(lèi)似。氯化亞鐵和抗壞血酸均是強(qiáng)還原劑,表明4種樣品均有較強(qiáng)的還原能力。

a-玉米肽、小麥肽、玉米肽-Ca;b-FeCl2、小麥肽-Fe;c-抗壞血酸圖3 螯合產(chǎn)物、低聚肽、氯化亞鐵和抗壞血酸的還原能力Fig.3 The reductive ability of chelates, oligopeptides, ferrous chloride, and ascorbic acid

2.3 螯合物抗過(guò)敏活性測(cè)試

透明質(zhì)酸酶是一種糖苷酶,其活性與常見(jiàn)的I型過(guò)敏反應(yīng)有很強(qiáng)的相關(guān)性[22-23],有文獻(xiàn)表明小分子質(zhì)量低聚肽具有一定透明質(zhì)酸酶抑制能力進(jìn)而獲得了抗過(guò)敏活性[24],該法也因此被應(yīng)用于比較分子抗過(guò)敏活性強(qiáng)弱[25]。本文以透明質(zhì)酸酶抑制率為指標(biāo),對(duì)小麥肽、玉米肽、玉米肽-Ca螯合物和小麥肽-Fe螯合物的抗過(guò)敏活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

首先在100 mg/mL,對(duì)上述4種樣品進(jìn)行透明質(zhì)酸酶抑制實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖4所示。小麥肽的抗過(guò)敏活性很高,100 mg/mL的小麥肽透明質(zhì)酸酶抑制率可達(dá)83%。玉米肽也具有一定的抗過(guò)敏活性但與小麥肽相比較低,100 mg/mL的玉米肽透明質(zhì)酸酶抑制率僅有51.79%。在螯合物方面,100 mg/mL的小麥肽-Fe螯合物具有66.07%的透明質(zhì)酸酶抑制率,相較于同濃度的玉米肽-Ca螯合物表現(xiàn)出更好的透明質(zhì)酸酶抑制性。進(jìn)一步,對(duì)4種樣品抑制透明質(zhì)酸酶的量效關(guān)系進(jìn)行研究。由圖4可知,在低質(zhì)量濃度時(shí)(0～20 mg/mL)螯合物與相應(yīng)低聚肽的抑制率均存在顯著性差異(P<0.05),小麥肽-Fe螯合物、玉米肽-Ca螯合物抑制率可分別達(dá)到25.86%、44.83%,與小麥肽和玉米肽(均小于10%)相比具有更好的透明質(zhì)酸酶抑制性。中高質(zhì)量濃度時(shí)(20～100 mg/mL)小麥肽和玉米肽對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率隨濃度的變化出現(xiàn)了明顯的增大趨勢(shì):在100 mg/mL,玉米肽與玉米肽-Ca螯合物的抑制率已無(wú)顯著性差異(P>0.05),小麥肽的抑制率則已顯著高于小麥肽-Fe螯合物(P<0.05)。然而兩種螯合物的抑制率在中高濃度區(qū)間的增長(zhǎng)則趨于平緩。不同濃度范圍下螯合物和低聚肽對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制率的增長(zhǎng)趨勢(shì)有明顯區(qū)別,螯合物在低濃度時(shí)已經(jīng)具有相對(duì)較高的透明質(zhì)酸酶抑制活性,而低聚肽本身則需要更大的濃度獲得相同的抑制活性。

圖4 螯合產(chǎn)物、低聚肽對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制活性Fig.4 Hyaluronidase inhibition activity of chelates and oligopeptides

3 結(jié)論

本文利用DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和還原能力三類(lèi)指標(biāo),對(duì)樣品的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)表明玉米肽、小麥肽、玉米肽-Ca螯合物和小麥肽-Fe螯合物均有很強(qiáng)的還原能力和DPPH自由基清除能力,其中小麥肽-Fe螯合物因含有亞鐵離子表現(xiàn)尤甚。在羥自由基清除能力的測(cè)試中,螯合物則明顯強(qiáng)于低聚肽和螯合所用鹽,證明螯合物的抗氧化能力并非是簡(jiǎn)單的單體疊加而是依靠了螯合的工藝。此外,利用透明質(zhì)酸酶抑制法對(duì)相同樣品的抗過(guò)敏活性進(jìn)行測(cè)試,樣品在低濃度范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與羥自由基清除實(shí)驗(yàn)近似,均是螯合物的能力強(qiáng)于低聚肽,由此可推測(cè)物質(zhì)的抗氧化能力與抗過(guò)敏活性存在一定的正相關(guān)聯(lián)系;在中高濃度范圍內(nèi)低聚肽的抑制能力增長(zhǎng)則明顯快于螯合物,這種抑制率增長(zhǎng)趨勢(shì)隨濃度變化而變化的現(xiàn)象可應(yīng)用于樣品抗過(guò)敏活性的進(jìn)一步精細(xì)研究。

鐵和鈣是人體必需的元素,中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦成人的每日鈣攝入量800 mg,攝入過(guò)量則會(huì)增加動(dòng)脈斑塊堆積和心臟損傷等風(fēng)險(xiǎn)[26];推薦成年男性攝入鐵元素12 mg,成年女性攝入鐵元素20 mg,攝入過(guò)量會(huì)引發(fā)肝纖維化、肝癌等疾病[27]。因此市面上的食品和藥品中鐵和鈣元素的含量需嚴(yán)格控制,應(yīng)處于低濃度范圍。本文中的抗氧化能力和透明質(zhì)酸酶抑制測(cè)試說(shuō)明小麥肽-Fe螯合物和玉米肽-Ca螯合物在低濃度(0～20 mg/mL)時(shí)已經(jīng)具有較高的抗氧化能力和抗過(guò)敏活性,表明兩類(lèi)螯合物在抗過(guò)敏、抗氧化食品藥品方向具有廣闊的發(fā)展前景和巨大的應(yīng)用潛能。