黃秋霞 歐海玲 黃克強 劉姍姍

廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院病理科,廣西南寧市 530023

宮頸癌(cervical cancer,CC)是全球范圍內(nèi)最常見的婦科癌癥之一,據(jù)統(tǒng)計,2020年共新增60.4萬例CC,死亡病例34.2萬例[1]。盡管HPV疫苗能在一定程度上預防宮頸上皮內(nèi)瘤變和CC,但仍有部分CC的發(fā)生與HPV感染無關(guān)[2]。因此,開展CC的相關(guān)研究,探索與CC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的機制十分必要。

長非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子,近年來研究發(fā)現(xiàn)lncRNA參與轉(zhuǎn)錄后修飾,從而參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[3-4]。LOC285194(又稱TUSC7,LSAMP-AS3),是一個與腫瘤發(fā)展相關(guān)的lncRNA。研究表明,LOC285194在子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌的組織中低表達[5-6]。然而,鮮有研究探討LOC285194在CC中的表達。一項研究揭示LOC285194在CC組織和患者血清中低表達[7],但缺乏多中心、大量樣本的驗證。因此,有必要利用大量樣本進一步探究LOC285194在CC組織或細胞中的表達及相關(guān)的分子機制。

本研究檢索GEO、TCGA、Array Express等數(shù)據(jù)庫,收集多中心樣本數(shù)據(jù),探究lncRNA LOC285194在CC組織中的表達。同時,通過探究LOC285194在CC中相關(guān)的內(nèi)源競爭RNA(competing endogenous RNA,ceRNA),進一步研究LOC285194在CC中的潛在分子機制。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取及處理 截至2022年1月10日,通過檢索GEO、ArrayExpress、SRA等數(shù)據(jù)庫,篩選CC相關(guān)的高通量數(shù)據(jù)集。檢索式如下:(cervical cancer or cervical carcinoma) and (mRNA or gene or miRNA or microRNA or lncRNA or lincRNA or long non-coding RNA)。數(shù)據(jù)集納入標準:(1)樣本來源于CC患者;(2)樣本未做任何處理;(3)包含mRNA或lncRNA或miRNA表達數(shù)據(jù);(4)CC組和非癌對照組的樣本均≥3例;(5)有相應(yīng)的探針注釋文件。最終,納入CC中l(wèi)ncRNA LOC285194相關(guān)數(shù)據(jù)集6個,分別為GSE6791、GSE27678、GSE63514、GSE75132、GSE145372、GSE167362。將來自同一平臺的數(shù)據(jù)集合并,并用R語言(v4.0.4)軟件包sva校正批次效應(yīng)。同時,下載來自TCGA數(shù)據(jù)庫CC患者的RNA測序數(shù)據(jù),與GTEx數(shù)據(jù)庫中的正常宮頸組織RNA測序數(shù)據(jù)合并。

此外,以相同方法收集了與CC相關(guān)的30個信使RNA(messenger RNA,mRNA)數(shù)據(jù)集和7個微小RNA(microRNA,miRNA)數(shù)據(jù)集(見表1)。利用R語言(v4.0.4)軟件包meta計算每個mRNA和miRNA的標準化均數(shù)差(standard mean difference,SMD),滿足SMD>0且P<0.05的被認為是CC中高表達的mRNA和miRNA;滿足SMD<0且P<0.05的被認為是CC中低表達的mRNA和miRNA[8]。

表1 高通量數(shù)據(jù)集

1.2 LOC285194在CC組織與正常宮頸組織中的表達水平差異 在本研究中,通過散點圖探索LOC285194在CC組織與正常宮頸組織中表達水平的差異,該過程借助軟件GraphPad Prism 8完成。同時,繪制受試者工作特征(ROC)曲線,通過曲線下面積(AUC)評估LOC285194區(qū)別CC組織與正常宮頸組織的能力。其中0.5

此外,為了綜合評估LOC285194在CC組織與正常宮頸組織中的表達水平差異,利用Stata軟件v15.1(TX,USA)計算所有包含LOC285194表達數(shù)據(jù)的高通量數(shù)據(jù)集的合并SMD值,當統(tǒng)計量I2<50%時,可以認為異質(zhì)性較小,使用固定效應(yīng)模型(fixed effects model)合并SMD值;當統(tǒng)計量I2≥50%時,使用隨機效應(yīng)模型(random effects model)合并SMD值。SMD值的判讀標準同2.1所述[9]。同時,繪制綜合受試者工作特征(summary receiver operating characteristics,SROC)曲線來綜合評估LOC285194區(qū)別CC組織與正常宮頸組織的能力。

1.3 構(gòu)建CC中LOC285194相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò) 利用在線工具DIANA-LncBase v3預測與LOC285194具有靶向關(guān)系的miRNA[10],并將預測獲得的miRNA與計算獲得的高表達miRNA取交集。同時,利用TargetScan Human v8.0預測miRNA的靶基因,將靶基因與計算獲得的低表達mRNA取交集。軟件Cytoscape v3.7.1用于繪制ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖。此外,利用ENCORI數(shù)據(jù)庫計算獲取的miRNA與靶基因的相關(guān)性[11]。

1.4 統(tǒng)計學方法 獨立樣本t檢驗用于分析CC組織與正常對照之間LOC285194表達水平的差異。Pearson相關(guān)系數(shù)r用于評估m(xù)iRNA與靶基因之間的相關(guān)性。在本研究中,P<0.05提示結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LOC285194在CC組織與正常對照的表達差異 本研究納入的7個lncRNA數(shù)據(jù)集,經(jīng)合并同一平臺數(shù)據(jù)集后整理得到4個數(shù)據(jù)集。其中,2個數(shù)據(jù)集中檢測到LOC285194在CC組織中的表達水平低于正常宮頸組織,且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05;見圖1a、d);2個數(shù)據(jù)集中檢測到LOC285194在CC組與正常宮頸組織無統(tǒng)計學差異(P>0.05;見表1b、c)。ROC曲線提示LOC285194具有輕度到中度區(qū)分CC組織及正常對照組織的能力(AUC=0.581 4～0.777 8;見圖1e～h)。進一步整合分析得出總SMD=-0.43(95%CI=-0.61～-0.25,P<0.05;見圖2a),也支持LOC285194在CC組織中的表達顯著低于正常宮頸組織,且發(fā)表偏倚無統(tǒng)計學意義(P>0.05;見圖2b)。SROC曲線下面積為0.63,提示LOC285194具有輕度區(qū)分CC組織和正常宮頸組織的能力(見圖2c)。

圖1 LOC285194在CC組及其正常對照組的表達水平差異及LOC285194區(qū)分CC組織的能力a～d.LOC285194表達水平的散點圖;P值基于獨立樣本t檢驗 e～h.LOC285194在各個數(shù)據(jù)集中的ROC曲線

圖2 整合計算評估LOC285194在CC組織和正常對照組織中的表達水平差異及LOC285194區(qū)分CC組織的能力a.森林圖提示,與正常對照組相比,LOC285194在CC組中表達下調(diào) b.Egger’s檢驗提示結(jié)果無發(fā)表偏倚 c.SROC曲線提示LOC285194具有輕度區(qū)分CC組織的能力;SENS為敏感性;SPEC為特異性

2.2 LOC285194在CC中相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò) 通過將預測的miRNA與我們計算獲得的高表達miRNA取交集,得到3個CC中與LOC285194有潛在關(guān)系的miRNA:hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-141-5p和hsa-miR-200a-5p。通過將TargetScan Human v8.0預測的靶基因與整合計算的低表達mRNA取交集,最終獲得hsa-miR-130b-5p的17個靶基因、hsa-miR-141-5p的9個靶基因和hsa-miR-200a-5p的3個靶基因。將LOC285194和3個miRNA以及miRNA的靶基因一起繪制ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)。

圖3 CC中LOC285194及其相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)

2.3 CC中hsa-miR-141-5p與靶基因表達的相關(guān)性分析 選擇hsa-miR-141-5p探討其與靶基因表達的相關(guān)性。森林圖提示,hsa-miR-141-5p在CC組織中的表達水平顯著高于正常對照組織(SMD=1.95,95%CI=0.16～3.75,P<0.05;見圖4a)。通過使用ENCORI,獲得了hsa-miR-141-5p靶基因的Pearson相關(guān)系數(shù)(見表2)。挑選相關(guān)性最強的靶基因ZNF385D來探究其在CC組織與正常宮頸組織中表達水平的差異,森林圖提示總SMD=-1.13(95%CI=-1.96～-0.31,P<0.05;見圖4b),表明ZNF385D在CC組織中的表達水平顯著低于正常宮頸組織。同時,利用TargetScan Human v8.0,預測了hsa-miR-141-5p與靶基因ZNF385D的結(jié)合位點情況(見圖4c)。

圖4 hsa-miR-141-5p及其靶基因ZNF385D在CC與正常對照之間的表達差異及互補序列a.森林圖提示,與正常對照組相比,hsa-miR-141-5p在CC組中表達上調(diào) b.森林圖提示,與正常對照組相比,ZNF385D在CC組中表達下調(diào) c.hsa-miR-141-5p與靶基因ZNF385D的結(jié)合序列;3’UTR,3’-端非翻譯區(qū);7mer-A1,與成熟miRNA種子區(qū)域的2-7位完全匹配且后跟堿基“A”

表2 hsa-miR-141-5p與靶基因在宮頸癌中的表達相關(guān)性

3 討論

CC是女性生殖系統(tǒng)發(fā)病率較高的惡性腫瘤。除了眾所周知的HPV感染,還有許多分子層面的改變也會影響CC的發(fā)生[1,12-14]。近年來,許多報道都揭示了lncRNA在CC中的作用[11,15]。LOC285194作為一個與腫瘤相關(guān)的lncRNA分子,其在多種腫瘤中的表達及生物學作用已被相繼研究,但關(guān)于LOC285194在CC中的大樣本研究較少。為此,本研究開展了CC相關(guān)的多中心樣本分析。

LOC285194的低表達水平在多種惡性腫瘤組織或細胞系中被報道,如結(jié)直腸癌、胰腺癌、肺腺癌等[16-19]。對于女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,LOC285194的低表達也在卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌組織中被驗證[5-6],同時研究構(gòu)建lncRNA LOC285194/miR-616/SOCS4軸的調(diào)控機制,證明LOC285194在卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮抑癌作用。一項研究報道了LOC285194在CC的癌組織和患者血清中均呈低表達水平[7]。與傳統(tǒng)的研究方法不同,本研究收集了全球多中心與CC相關(guān)的數(shù)據(jù)集,通過618例樣本(CC樣本399例,正常宮頸樣本219例),對比正常女性和CC患者宮頸組織中LOC285194表達水平的差異。來自多中心的樣本(中國14例,美國448例,英國33例,德國28例)在一定程度上減少了人種對于研究結(jié)果的影響,同時整合計算SMD的方法減少了不同中心研究帶來的偏倚,整合計算的結(jié)果顯示與正常女性相比,CC患者宮頸組織的LOC285194呈低表達水平。結(jié)合已發(fā)表的研究,本研究推論LOC285194在女性生殖系統(tǒng)癌癥中起到抑癌作用。

近年來的研究表明,ceRNA在腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移中起到了重要的作用,甚至可能成為治療的靶點[20-23]。然而,還未有研究報道CC中LOC285194相關(guān)的ceRNA機制。本研究通過結(jié)合在線工具預測和大樣本量的計算,發(fā)現(xiàn)了三個與LOC285194可能有靶向關(guān)系的miRNA:hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-141-5p和hsa-miR-200a-5p,并構(gòu)建了相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。

此前,從未有研究探討hsa-miR-141-5p及其靶基因ZNF385D在CC組織及相應(yīng)正常對照中的表達水平差異。本研究通過收集多中心樣本,利用402例樣本(357例CC,45例正常宮頸組織)驗證了hsa-miR-141-5p在CC組織中表達上調(diào);同時利用1 098例樣本(753例CC,345例正常宮頸組織)驗證了ZNF385D在CC組織中的表達顯著低于正常宮頸組織。LOC285194可能通過hsa-miR-141-5p/ZNF385D軸在CC中發(fā)揮調(diào)控作用,有待體外細胞實驗驗證。

綜上所述,本研究首次利用全球多中心樣本揭示了lncRNA LOC285194在CC患者的宮頸組織中呈低表達狀態(tài),LOC285194在CC中可能起抑癌作用。然而,LOC285194在CC中的分子機制及其臨床病理意義仍需體內(nèi)外實驗探究。