吳江燕 程高升

福建省福州市第一醫(yī)院 350009

脊髓缺血再灌注損傷(SCIRI)是指在脊髓缺血所導(dǎo)致的原發(fā)性脊髓損傷后,恢復(fù)血流再灌注所導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,屬于繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損害和功能障礙,在脊柱損傷、胸腹主動(dòng)脈瘤、脊髓供血?jiǎng)用}疾患以及主動(dòng)脈手術(shù)后常見,可導(dǎo)致不可逆性脊髓神經(jīng)元遲發(fā)性死亡,嚴(yán)重時(shí)有潛在致殘、致死性[1]。因此探尋有效減輕SCIRI損傷的方法,對(duì)臨床上降低患者術(shù)后致殘和致死率具有重要意義。再灌注損傷發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜,原因較多,細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)是其中較為主要的兩個(gè)原因,脊髓缺血導(dǎo)致細(xì)胞缺血缺氧,再灌注發(fā)生導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)同時(shí)出現(xiàn)氧自由基和炎癥反應(yīng)爆發(fā),鈣超載等病理生理過程,最終加重?fù)p傷引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡、組織損傷并導(dǎo)致相關(guān)功能障礙[2-3]。右美托咪定(DEX)是一種具有高效選擇性的α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑,因其具有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用,在臨床麻醉和危重病例的治療中得到廣泛應(yīng)用。有研究證實(shí),除具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛效應(yīng)外,DEX還具有器官保護(hù)作用,DEX可以通過SIRT3介導(dǎo)的親環(huán)素D(CypD)去乙?；?通過抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放,保護(hù)線粒體減少損傷,從而減輕大鼠腎缺血再灌注損傷[4]。同時(shí)還有研究證實(shí),PGC-1α/SIRT3信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡相關(guān),作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,PGC-1α能夠調(diào)控線粒體代謝、局部炎癥反應(yīng)以及機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng),而SIRT3作為PGC-1α信號(hào)通路中的下游靶基因,SIRT3激活后能夠改善線粒體自噬和線粒體的合成,減輕氧化應(yīng)激損傷,抑制細(xì)胞凋亡[5-6]。共同提示DEX預(yù)處理減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷可能與PGC-1α/SIRT3信號(hào)通路相關(guān),但相關(guān)研究罕見報(bào)道?；诖吮尘?本研究通過觀察DEX是否能夠激活PGC-1α/SIRT3信號(hào)通路進(jìn)而減輕SCIRI,以更加全面深入的探討PGC-1α/SIRT3信號(hào)通路是否在DEX預(yù)處理減輕SCIRI中具有潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:96只10～11周齡的SD雄性大鼠,SPF環(huán)境室溫下自由飲水、標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,體重在220～250(236±18)g,四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場飼養(yǎng)。全程依照3R原則給予實(shí)驗(yàn)大鼠人道主義關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑與儀器:PGC-1α抑制劑SR-18292(MCE中國,生產(chǎn)批號(hào):20180219);鹽酸右美托咪定注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,生產(chǎn)批號(hào):國藥準(zhǔn)字H20090248);細(xì)胞TUNEL試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司);細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所);熒光定量PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol(日本TaKaRa 公司);Western blot 實(shí)驗(yàn)所用抗體(美國CST);蛋白定量試劑盒(自北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司);透射電子顯微鏡(日本Olympus公司);顯微鑷(型號(hào):15cm,直尖0.15mm)、顯微剪(浙江寧波醫(yī)用縫針廠); NikonTi-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡(日本三菱公司,型號(hào):H-7650);組織包埋機(jī)(德國Leica公司,型號(hào):LEICAEG1150)。

1.2 方法

1.2.1 SCIRI大鼠模型構(gòu)建和分組方式:大鼠麻醉后,常規(guī)消毒,右側(cè)臥位固定后肋緣行縱切口,逐層分離,于心包處分離胸主動(dòng)脈,弓鎖骨動(dòng)脈起始點(diǎn)無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉主動(dòng)脈15min,sham組開胸但不夾閉,0.2ml氨芐青霉素(100mg/L)靜脈注射預(yù)防感染。動(dòng)物模型構(gòu)建成功后,按照標(biāo)準(zhǔn)飲食進(jìn)行單獨(dú)喂養(yǎng)。分組:sham組、模型組、實(shí)驗(yàn)組以及DPA組,共四組,每組24只。其中:sham組(開胸但未進(jìn)行夾閉處理,于建模前3h注射與DPA組DEX等量的生理鹽水);模型組(開胸進(jìn)行夾閉前3h注射與鹽酸右美托咪定等量的生理鹽水);實(shí)驗(yàn)組(于建模前3h鞘內(nèi)注射與DPA組等量的鹽酸右美托咪定);DPA組(開胸進(jìn)行夾閉前3h鞘內(nèi)注射腹腔注射DEX 40μg/kg,同時(shí)注射20μmol/L PGC-1α抑制劑SR-18292)。

1.2.2 BBB評(píng)分:評(píng)估大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能,分別于再灌注6、8、12和24h時(shí)每組隨機(jī)抽取6只大鼠,進(jìn)行改良BBB評(píng)分法評(píng)分[7],最高分21分,分值越高大鼠后肢功能越好,連續(xù)測定3次計(jì)算平均值。

1.2.3 脊髓組織病理觀察:24h運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分結(jié)束后,每組取6只大鼠,斷頭處死后4%多聚甲醛400ml 將L4～6部位脊髓固定。經(jīng)常規(guī)脫水、透明浸蠟、標(biāo)記、石蠟包埋、切片(5μm)、HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察拍照,計(jì)算其正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)的平均數(shù)。

1.2.4 檢測大鼠脊髓組織細(xì)胞凋亡情況:再灌注12h完成BBB評(píng)分后,隨機(jī)處死6只大鼠,取各組大鼠L4～6脊髓節(jié)段,固定后常規(guī)制備冰凍切片,2次于二甲苯中浸洗,對(duì)切片沖洗后,于2%的蛋白激酶K中消化15min,重復(fù)沖洗1次,以緩慢滴加TUNEL反應(yīng)液于其中,37℃避光孵育1h,PBS沖洗液漂洗3次,2min/次,以20%濃度甘油緩沖液封片。于熒光顯微鏡下隨機(jī)對(duì)每組6個(gè)不同視野進(jìn)行觀察,凋亡細(xì)胞百分比=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5 PGC-1α和SIRT3 mRNA表達(dá):Trizol法抽提各組脊髓細(xì)胞中RNA,參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明合成cDNA,并以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。2-ΔΔCt相對(duì)定量分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

1.2.6 Western blot檢測PGC-1α和SIRT3蛋白表達(dá)量:Western blot在大鼠脊髓組織加入預(yù)冷裂解液,研磨裂解脊髓組織,離心獲得上清液。按照BCA試劑盒說明測定總蛋白濃度。取25μg總蛋白上樣,通過10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,分離蛋白轉(zhuǎn)移至PDVF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2h,加入一抗SIRT3(1∶500)、PGC-1α(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000),在4℃下培育1d,然后將膜與二抗一起培育2h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影,采集圖像獲得條帶,以GAPDH進(jìn)行標(biāo)定,ImageJ軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 四組BBB評(píng)分比較 與sham組相比,其余三組再灌注各時(shí)點(diǎn)BBB評(píng)分均顯著降低(P<0.05);與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組和DPA組再灌注各時(shí)點(diǎn)BBB評(píng)分顯著升高(P<0.05);與實(shí)驗(yàn)組比較,DPA組再灌注各時(shí)點(diǎn)BBB評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.2 四組大鼠脊髓組織細(xì)胞凋亡情況及正常神經(jīng)元計(jì)數(shù) sham 組脊髓神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較其余三組更佳,在光鏡下較為完整,正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元較多,未見出血、空泡或腫脹,細(xì)胞核形態(tài)正常,輪廓清楚,呈多極性,細(xì)胞漿勻質(zhì)紅染。模型組脊髓神經(jīng)元損傷嚴(yán)重,正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元較少,可見空泡形成,較多的神經(jīng)元壞死,細(xì)胞核大量溶解。實(shí)驗(yàn)組與DPA組脊髓神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較模型組稍好,其中實(shí)驗(yàn)組較DPA組稍好。與sham組比較,其余三組AI顯著升高,神經(jīng)元數(shù)量顯著降低,其中模型組AI最高,神經(jīng)元數(shù)最少(P<0.05);與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組和DPA組AI顯著降低,神經(jīng)元數(shù)量增加(P<0.05);與實(shí)驗(yàn)組比較,DPA組AI顯著升高,神經(jīng)元數(shù)量顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 四組大鼠脊髓組織細(xì)胞凋亡情況及正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)

2.3 四組大鼠PGC-1α和SIRT3 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá) 與sham組比較,模型組和DAP組PGC-1α和SIRT3 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著降低(P<0.05);實(shí)驗(yàn)組PGC-1α和SIRT3 mRNA表達(dá)量顯著升高,PGC-1α蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著降低(P<0.05),SIRT3蛋白質(zhì)的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組和DPA組PGC-1α和SIRT3 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著增加(P<0.05);與實(shí)驗(yàn)組比較,DPA組PGC-1α和SIRT3 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 四組大鼠PGC-1α和SIRT3 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)比較

3 討論

SCIRI主要是在大血管術(shù)后發(fā)生,因其導(dǎo)致的截癱是此類手術(shù)后嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,可發(fā)展成永久性截癱,嚴(yán)重時(shí)還可能導(dǎo)致手術(shù)患者死亡,然而目前仍無確切有效的防治措施[8]。盡管目前化學(xué)因子等輔助治療以及缺血性預(yù)處理措施的使用可在很大程度上減少SCIRI的發(fā)生,但術(shù)后仍然有一定的概率出現(xiàn)SCIRI,導(dǎo)致患者生命安全受到嚴(yán)重威脅。因此,進(jìn)一步探索SCIRI發(fā)病機(jī)制、開發(fā)有效治療方式和特殊治療藥物具有十分重要的意義。早期的研究認(rèn)為,當(dāng)SCIRI發(fā)生時(shí),缺血區(qū)域的神經(jīng)元表現(xiàn)為神經(jīng)元壞死病理癥狀,而周圍的神經(jīng)元表現(xiàn)為遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。但當(dāng)前研究證實(shí),SCIRI引起的神經(jīng)元壞死的主要原因是細(xì)胞凋亡。臨床研究發(fā)現(xiàn)[9],DEX除具有麻醉效果好、誘導(dǎo)蘇醒迅速和血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定等特點(diǎn)外,DEX預(yù)處理還能對(duì)包括心臟、肺臟、大腦等許多器官損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。也有研究表示DEX可通過激活JAK2/STAT3信號(hào)通路,抑制凋亡蛋白和炎癥因子表達(dá),減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)SCIRI產(chǎn)生保護(hù)作用[10],但是此類研究仍罕見。

在本研究中,筆者通過建立SCIRI大鼠模型觀察了大鼠體內(nèi)PGC-1α、SIRT3的表達(dá)變化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與sham組比較,模型組和DPA組PGC-1α和SIRT3 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著降低;實(shí)驗(yàn)組PGC-1α和SIRT3 mRNA表達(dá)量顯著升高,PGC-1α蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著降低。與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組和DPA組PGC-1α和SIRT3 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著增加;與實(shí)驗(yàn)組比較,DPA組PGC-1α和SIRT3 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著降低。表明當(dāng)DPA組加入 PGC-1α 抑制劑后,DEX對(duì)大鼠的SCIRI損傷不再起到保護(hù)作用,且 PGC-1α和SIRT3的 mRNA及蛋白表達(dá)均不再出現(xiàn)顯著升高。此外與sham組相比,其余三組再灌注各時(shí)點(diǎn)BBB評(píng)分均顯著降低,且sham組>實(shí)驗(yàn)組>DPA組>模型組;其余三組AI顯著升高,神經(jīng)元數(shù)量顯著降低,其中模型組AI最高,神經(jīng)元數(shù)最少;與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組和DPA組AI顯著降低,神經(jīng)元數(shù)量增加;與實(shí)驗(yàn)組比較,DPA組AI顯著升高,神經(jīng)元數(shù)量顯著降低。表明隨著PGC-1α和SIRT3的 mRNA及蛋白表達(dá)的降低,大鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重,脊髓組織的受損情況越嚴(yán)重,提示脊髓缺血再灌注損傷的發(fā)生與PGC-1α/SIRT3通路存在聯(lián)系,而DEX預(yù)處理能夠激活PGC-1α/SIRT3信號(hào)通路,達(dá)到抑制脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡,改善脊髓組織的受損情況的作用。

脊髓損傷的基礎(chǔ)研究表明[11-12],SCIRI作為原發(fā)性脊髓損傷的繼發(fā)性傷害,其發(fā)生與缺血缺氧、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、水通道蛋白異常表達(dá)、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、能量代謝紊亂等有關(guān),在誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)后致使細(xì)胞凋亡,造成患者出現(xiàn)以運(yùn)動(dòng)、感覺功能障礙以及急性或遲發(fā)性神經(jīng)功能缺失為主的臨床癥狀。SCIRI可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白反應(yīng)的發(fā)生,激活ERS,但持續(xù)ERS將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡出現(xiàn),最終加重SCIRI[13]。ERS激活造成線粒體損傷,進(jìn)而激活Caspase-3,誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[14]。PGC-1α是最早被鑒定出的過氧化物酶體增殖物激活受體γ的轉(zhuǎn)錄輔助激活因子,主要在含有豐富線粒體的神經(jīng)系統(tǒng)、心肌組織、骨骼肌組織等組織表達(dá),在多種與能量代謝有關(guān)的基因及轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控作用[15]。SIRT3是NAD+依賴的組蛋白去乙?；?主要存在于線粒體內(nèi),在線粒體呼吸、能量產(chǎn)生、脂肪酸β氧化和抗氧化等方面發(fā)揮重要作用,可以通過調(diào)節(jié)能量代謝及線粒體功能等阻止腦衰老和神經(jīng)變性[16]。馮剛、張松松等人的實(shí)驗(yàn)證實(shí)[17-18],SIRT3是PGC-1α的靶基因,PGC-1α可誘導(dǎo)SIRT3表達(dá),并增加SIRT3的去乙?；富钚?從而調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)在內(nèi)的線粒體活動(dòng),在線粒體生成過程中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步證實(shí)了筆者的猜想,即SCIR大鼠在DEX預(yù)處理后PGC-1α誘導(dǎo)SIRT3表達(dá)增加,在此通路的調(diào)控下,在減輕ERS的同時(shí),線粒體損傷減輕,不再激活Caspase-3誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

綜上所述,DEX預(yù)處理大鼠SCIRI能夠有效激活PGC-1α/SIRT3信號(hào)通路,抑制脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù),改善大鼠脊髓組織的受損情況。