李桂花，符梅，羅文龍，駱善偉，郭巨先

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點實驗室，廣州 510640）

0 引言

菜心(Brassica rapassp.parachinensis)是起源于中國華南地區(qū)的特色葉菜，僅廣東省年種植面積就有20萬hm2（包括復(fù)種），紫菜薹(Brassica rapassp.chinensisvar.purpurea)是起源于中國長江流域的葉菜，具有悠久的栽培歷史和優(yōu)良品質(zhì)及獨特的形態(tài)特征[1]。菜心和紫菜薹均為十字花科蕓薹屬小白菜變種AA染色體組(2n=20)，菜薹為其食用的主要部分[2]。兩者在中國很受歡迎，并銷往亞洲、歐洲和美洲等國家。在菜薹的整個生長發(fā)育過程中，抽薹時間和開花時間影響著熟性早晚從而影響產(chǎn)量和品質(zhì)。因此開展抽薹時間、開花時間性狀的QTL 定位及候選基因分析具有十分重要的意義。抽薹時間和開花時間是由多個基因控制的數(shù)量性狀，與其相關(guān)的研究領(lǐng)域涉及的是BrFLC。Tadege 等[3]首先從甘藍型油菜中分離到了5 個序列與FLC 相似的基因，這些基因能顯著延遲開花時間。之后又有Schranz 等[4]在白菜中克隆到了與FLC 同源的BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3 和BrFLC5 等基因，分別位于A10、A02 和A03 染色體上。原玉香等[5]利用DH 群體定位到了BrFLC1。鄧杰等[6]利用由小白菜構(gòu)建的DH 群體定位到了BrFLC2。隨著蕓薹屬蔬菜抽薹開花時間研究的不斷深入，很多其他與開花相關(guān)的基因也被定位到。陳雪等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在油菜中存在6個與開花時間同源的基因，其中有4 個定位于A07 染色體和C06染色體上。而白菜中則發(fā)現(xiàn)了2個與開花時間同源的基因，分別為位于A02 染色體及A07 染色體。張學(xué)銘則定位到A07 染色體上一個開花時間同源基因[8]。本試驗以抽薹時間天數(shù)、開花時間天數(shù)差異大的2個材料為親本，進行雜交獲得F1，F(xiàn)1自交獲得F2群體共150株作為作圖群體，對菜心的抽薹時間、開花時間進行田間調(diào)查，利用北京百邁客生物科技有限公司簡化基因組測序技術(shù)構(gòu)建了包含4253 個標記的菜心分子遺傳圖譜[9]，用混合線性復(fù)合區(qū)間作圖法對菜心的抽薹時間、開花時間進行QTL 定位和候選基因分析，旨在為分子標記輔助選擇不同熟性的品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以‘湘紅薹1號’與‘義農(nóng)50天菜心’為雙親，構(gòu)建F2群體150個單株，于2016年11月16日播種于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所白云基地，為減少試驗中邊行優(yōu)勢帶來的誤差，每畦地種2行，田間種植為隨機區(qū)組設(shè)計?！婕t薹1號’為晚抽薹開花材料，‘義農(nóng)50天菜心’為早抽薹開花材料（圖1），雙親間的遺傳距離較大、一般配合力好，適合遺傳圖譜的構(gòu)建及相關(guān)農(nóng)藝性狀的分析。

圖1 作圖親本

1.2 試驗方法

1.2.1 抽薹開花性狀的調(diào)查每日觀察并統(tǒng)計各植株的抽薹時間和開花時間。抽薹時間的調(diào)查標準為從播種到花蕾肉眼可見所需時間。開花時間調(diào)查標準為從播種到第一朵花完全開放所需時間。

1.2.2 葉片總DNA 提取與檢測選取苗期的菜薹鮮嫩葉片，提取雙親及F2單株葉片總DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量，并用紫外分光光度計測其濃度。

1.2.3 分子遺傳連鎖圖譜及構(gòu)圖材料將雙親及F2群體150株的DNA送至北京百邁客生物科技有限公司進行簡化基因組測序(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing，SLAF-seq)[9]，在構(gòu)建菜心分子遺傳圖譜的基礎(chǔ)上，用混合線性復(fù)合區(qū)間作圖法對菜心的抽薹時間、開花時間進行QTL定位和候選基因分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜薹高密度遺傳圖譜的構(gòu)建

基于SLAF 文庫構(gòu)建和高通量測序，共獲得353.57 M長度為100 bp的reads。其GC含量及Q30筆者分別為42.47%和90.21%。母本獲得了10100084個reads，80935 個SLAFs，測序深度為39.4；父本獲得了10181878個reads，測序深度為40.75，87833個SLAFs；在F2群體中，共獲得2221944 條reads，77079 個SLAFs，平均深度為9.89（表1）[9]。對低深度SLAFs 標簽進行過濾后，共獲得130525 個高質(zhì)量SLAFs，多態(tài)SLAFs 百分率為20.3%(26557)，其中有10940 個SNP標記用于遺傳圖譜的構(gòu)建。一共構(gòu)建了10 個連鎖群（圖2），圖譜總長1030.04 cM，共有4253個標記分布在10 個連鎖群中，包含標記數(shù)最多的為LG2 連鎖群，有677個標記，最少的為LG5連鎖群，有235個標記；標記間的平均距離為0.27 cM，10 個連鎖群長度在73.12～140.03 cM之間，其中LG5最長為140.03 cM，LG8最短為73.12 cM（表2）。圖中標記的完整度為99.66%，發(fā)生雙交換的比例為0.02%。

表1 SLAF測序信息統(tǒng)計

表2 各連鎖群中標記數(shù)及遺傳距離

圖2 菜薹高密度遺傳圖譜

2.2 菜薹抽薹時間、開花時間次數(shù)分布圖

由表3、圖3可知，雙親性狀差異非常明顯，其中P1的抽薹時間、開花時間天數(shù)均明顯遲于親本P2。F1抽薹時間、開花時間天數(shù)在兩親本之間。F2抽薹時間、開花時間在群體中均發(fā)生明顯分離，表現(xiàn)為連續(xù)變化，單一峰值，屬于數(shù)量性狀。

表3 親本及F1和作圖群體F2的表型d

圖3 F2種群抽薹時間和開花時間表型分布圖

2.3 菜薹抽薹時間、開花時間性狀QTL定位

通過混合線性復(fù)合區(qū)間作圖法獲得抽薹時間QTL 為2 個，表型貢獻率在8.39%～57.55%之間；開花時間QTL 2個，表型貢獻率在9.76%～56.51%之間。其中，抽薹時間主效QTL 定位于A07 號染色體上（表4、圖4A），貢獻率57.55%；微效QTL 則位于A09 號染色體上，貢獻率8.39%（圖4A）。開花時間主效QTL位于A07 號染色體上，貢獻率56.51%（表4、圖4B），微效QTL 則位于A09 號染色體上，貢獻率9.75%（圖4B）?？刂瞥檗窌r間和開花時間主效QTL 均位于A07 染色體，總間距為0.33 cM，表明抽薹時間和開花時間這2個性狀是受基因的多效性或鄰近基因控制的。

表4 菜薹抽薹時間和開花時間性狀的QTL分析表

圖4 菜薹A07號染色體上抽薹時間(A)和開花時間(B)性狀的數(shù)量性狀定位

2.4 候選基因分析

利用白菜基因組數(shù)據(jù)庫，對主效QTL區(qū)域SNP標記的側(cè)翼序列進行同源性分析[10]。利用默認參數(shù)的Blastn函數(shù)，對Ensembl植物基因組數(shù)據(jù)庫中的參考基因組和已注釋的白菜基因組進行序列比對，對候選基因功能進行注釋。分析了位于A07 染色體抽薹時間、開花時間的主效QTL區(qū)域，以期找到參與抽薹時間與開花時間的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因。將獲得的數(shù)據(jù)與白菜的基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，優(yōu)先確定了與抽薹時間、開花時間性狀相關(guān)的12 個基因。這些候選基因在菜心抽薹、開花的過程中具有不同的調(diào)節(jié)作用。諸如Bra004159、Bra004101 和Bra004125 基因與花的分生組織的營養(yǎng)供給有關(guān)。而Bra004116 和Bra004125 在不同的花器官形成中發(fā)揮作用。同樣，基因Bra004101 和Bra004125 也參與到植物激素的生物合成或信號傳導(dǎo)途徑中。編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因Bra004149 也位于主效基因QTL 區(qū)域，其中一些基因可能與早期開花性狀有關(guān)。根據(jù)參考基因組，最終篩選到與抽薹時間和開花時間相關(guān)的3 個候選基因（表5、圖5）。其中，Bra004125 通常被稱為生長素應(yīng)答因子8(ARF8)，ARF8 在不同花器官的發(fā)育中起主要作用。第2 個候選基因Bra004162 是一種轉(zhuǎn)錄因子MYB92，主要調(diào)節(jié)植物的開花時間和次生細胞壁的形成。而第3個基因Bra004165則是編碼CML24的鈣結(jié)合蛋白，通過一氧化二氮(N2O)介導(dǎo)的途徑在開花過程中起作用。

表5 在A07染色體主效QTL區(qū)域篩選到與抽薹、開花時間相關(guān)的選候選基因

圖5 菜薹抽薹時間(A)和開花時間(B)LOD值和貢獻率分析

3 結(jié)論

本試驗對菜薹F2分離種群的抽薹時間、開花性狀進行了田間調(diào)查，利用北京百邁客生物科技有限公司構(gòu)建的包含4253個標記的分子遺傳圖譜，通過混合線性復(fù)合區(qū)間作圖法找到與抽薹時間、開花時間相關(guān)的QTL 4 個，其中2 個主效QTL 位于A07 號染色體的相鄰區(qū)域。試驗首次將主效QTL 區(qū)域與白菜參考基因組進行比對，篩選并推測ARF8、MYB92 和CML24 參與了菜心早期抽薹和開花性狀。該結(jié)果將為下一步的基因克隆和功能分析奠定基礎(chǔ)。

4 討論

分子遺傳圖譜是研究植物數(shù)量性狀QTL 定位必要條件。本研究利用抽薹時間、開花時間差異大的雙親雜交，獲得F2分離群體，利用150個單株構(gòu)建了一張菜薹高密度遺傳圖譜。與前人構(gòu)建的白菜類遺傳圖譜相比，本圖譜包含更多標記，且是利用菜薹變種內(nèi)雜交進行群體構(gòu)建，更有利于菜薹農(nóng)藝性狀的定位及候選基因分析。通過QTL 分析，鑒定篩選出4 個抽薹時間和開花時間的QTL，這些QTL定位在A09（微效基因）和A07（主效基因）染色體上（圖4～5）。控制抽薹時間QTL(QTL1.1)和開花時間QTL(QTL2.1)的主效基因位于A07 染色體上相鄰居位置，總間距為0.33 cM，表明抽薹時間和開花時間這2個性狀是受基因的多效性或鄰近基因控制的。參考注釋基因組數(shù)據(jù)庫對于縮小候選基因的選擇范圍非常重要，這些結(jié)果為基因分離和功能測試研究提供重要的參考價值。根據(jù)參考基因組和之前發(fā)表的文獻以及與其他植物相同性狀相關(guān)的同源基因，篩選到3 個與抽薹時間和開花時間性狀相關(guān)的候選基因。其中一個通常被稱為生長素應(yīng)答因子8的候選基因Bra004125，控制著雄蕊和雌蕊的成熟過程[11-12]。ARF8在花器官中表達，特別是在花發(fā)育過程中的花瓣中表達[13]。該基因的功能喪失會體現(xiàn)在雄蕊發(fā)育改變和花絲長度減少[13-14]。ARF8 與轉(zhuǎn)錄因子BIGPETAL 相互作用，控制發(fā)育花瓣中的細胞分裂和擴增[14]。ARF8還會促進茉莉酸的生物合成，并導(dǎo)致花的成熟[11]。第2個基因Bra004162是一種轉(zhuǎn)錄因子，被稱為MYB92。該轉(zhuǎn)錄因子幾乎在花的所有器官中都有表達[1]。MYB92 在擬南芥中過表達促進開花，并減少了莖纖維。該轉(zhuǎn)錄因子的過表達進一步影響了控制擬南芥開花過程的不同基因轉(zhuǎn)錄水平[1]。研究結(jié)果進一步暗示了植物中的開花過程也受赤霉素控制，而MYB92可能參與赤霉素介導(dǎo)的開花途徑。MYB92在赤霉素信號傳遞過程中起主要調(diào)控作用[15]。第3個候選基因Bra004165 則是編碼為CML24 的鈣結(jié)合蛋白[15]。CML24是潛在的鈣傳感器，可轉(zhuǎn)換鈣信號來調(diào)節(jié)一氧化二氮(N2O)的積累[16]。反過來說，N2O 水平可以通過光周期和自主調(diào)節(jié)途徑影響開花的過渡期。該蛋白在擬南芥植物中的功能喪失最終表現(xiàn)為開花較晚，而恢復(fù)其功能則開花較早[15]?？紤]到ARF8、MYB92和CML24在花器官發(fā)育中和調(diào)節(jié)誘導(dǎo)植物開花的某些途徑的信號傳導(dǎo)級聯(lián)的重要性，Bra004125、Bra004162 和Bra004165 都是影響菜心抽薹和開花時間的重要候選基因。