明幫燕，黃 梅，付旭娟，楊青山，周 濃，郭冬琴

（重慶三峽學(xué)院，重慶萬(wàn)州 404020）

浙貝母（Fritillaria thunbergiiMiq.）別名浙貝、象貝、大貝、珠貝、元寶貝等，為百合科貝母屬多年生草本植物，通常以地下鱗莖入藥，具有清熱散結(jié)、化痰止咳等功效，是我國(guó)種植歷史悠久、生產(chǎn)集約化較高的中藥材[1-4]。葉綠素是葉片光合作用所需的色素，也是葉片葉綠體色素的主要組成成分，在光合作用中起著關(guān)鍵的作用，光照、水分、土壤等生態(tài)因子會(huì)影響植物生長(zhǎng)期對(duì)能量的獲取，從而影響植物的品質(zhì)和產(chǎn)量[5-6]。便攜式葉綠素儀可在田間實(shí)時(shí)檢測(cè)葉片，來(lái)確定葉綠素的相對(duì)含量，與復(fù)雜、費(fèi)時(shí)的傳統(tǒng)葉片檢測(cè)法相比較[7-8]，具有簡(jiǎn)便、無(wú)損檢測(cè)、實(shí)時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于檸檬[9]、沙棘[10]、桃樹[11]、茼蒿[12]等植物相關(guān)檢測(cè)中，但在中國(guó)藥用植物研究方面應(yīng)用較少，尤其是浙貝母葉片SPAD 值與葉綠素含量的相關(guān)性的研究報(bào)道極少。本試驗(yàn)對(duì)浙貝母葉片的SPAD 值和葉綠素含量進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)數(shù)據(jù)相關(guān)分析來(lái)確定便攜式葉綠素儀測(cè)定浙貝母葉片葉綠素含量的準(zhǔn)確性及最佳測(cè)定部位，為浙貝母生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料浙貝母鮮葉采自重慶市萬(wàn)州區(qū)龍駒鎮(zhèn)梧桐村種植基地。

1.2 試驗(yàn)方法

2021 年4 月在浙貝母種植基地隨機(jī)采5 組鮮葉，采葉部位為浙貝母健康植株的中部，每組選取3 株植株，每株采10 片葉片，共計(jì)150 片，從中隨機(jī)挑選30片葉片為測(cè)定分析樣葉，作為測(cè)定檢驗(yàn)建立回歸模型的樣葉。采摘的浙貝母葉片做好編號(hào)標(biāo)記，并低溫保存，立即拿回實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素含量。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

葉綠素含量分別采用SPAD 便攜式葉綠素儀和丙酮法[13]測(cè)定。采用的便攜式葉綠素儀型號(hào)為SPAD-502（日本Koni-Caminolta 公司生產(chǎn)），來(lái)測(cè)定浙貝母葉片的SPAD 值。因葉綠素含量在藥材葉片不同位置差異較大，故測(cè)定葉片前中后3個(gè)位置（葉尖、葉中、葉基）的SPAD 值，計(jì)算其平均值。測(cè)定時(shí)應(yīng)注意觀察葉片，避開其損傷部位，保持?jǐn)?shù)據(jù)精確性。測(cè)定后，取對(duì)應(yīng)葉片去掉葉脈，并精確稱取鮮葉1.0 g，用80%丙酮溶液提取葉片的葉綠素，并在避光條件下浸泡24 h，然后用紫外—可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)）進(jìn)行測(cè)定。以80%丙酮提取液為對(duì)照，測(cè)定645、663 nm 波長(zhǎng)下的吸光度值，按照下列公式計(jì)算葉綠素含量：

式中：Ca為葉綠素a 含量（mg·g-1），Cb為葉綠素b 含量（mg·g-1），Ct為總?cè)~綠素含量（mg·g-1），D663和D645表示在663 nm 和645 nm 波長(zhǎng)下的吸光度值，V為定容體積（mL），W為稱樣重量（g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

采用Excel 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 26 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析和相關(guān)性分析，Origin 2018 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 同一植株不同葉片SPAD 值與葉綠素含量的相關(guān)性分析

選擇浙貝母同一植株上長(zhǎng)勢(shì)相近的10片葉片，采用SPAD 便攜式葉綠素儀測(cè)定相同葉片葉綠素相對(duì)含量，分光光度法測(cè)定浙貝母葉片葉綠素絕對(duì)含量，并分析葉綠素含量與SPAD 值之間是否存在相關(guān)性，結(jié)果詳見表1。可知，同一植株不同葉片的SPAD 值與葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量之間均呈極顯著相關(guān)關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)依次為0.939、0.932、0.933，這說(shuō)明SPAD值可間接反映浙貝母葉片中葉綠素含量情況。

表1 同一植株不同葉片間SPAD值與葉綠素含量的相關(guān)性

浙貝母葉片的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量與SPAD 值之間的線性回歸關(guān)系見表2?？芍?，同株浙貝母葉片間的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量與SPAD值之間呈線性函數(shù)（y=ax+b）關(guān)系，并且兩者之間呈極顯著水平，函數(shù)關(guān)系中a表示y隨x的變化速率。結(jié)果表明葉綠素b的變化速率最大，其次為總?cè)~綠素，而葉綠素a的速率系數(shù)最小。以上數(shù)據(jù)表明浙貝母葉片能夠使用便攜式葉綠素儀測(cè)定其葉綠素含量。

表2 同一植株不同葉片間SPAD值與葉綠素含量的回歸方程

2.2 同一葉片不同部位的SPAD 值與葉綠素含量的相關(guān)性分析

浙貝母同一葉片各部位（葉尖、葉中、葉基）的葉綠素含量和SPAD 值之間的線性函數(shù)圖如圖1 所示，浙貝母葉片的葉尖部位、葉中部位的葉綠素含量與SPAD 值均呈顯著相關(guān)性（p<0.05），葉基部位的葉綠素含量與SPAD 值均呈極顯著相關(guān)性（p<0.01），但其變化速率不盡相同，具體表現(xiàn)為葉中（0.834 4）>葉基（0.702 4）>葉尖（0.457 7）。這說(shuō)明對(duì)于浙貝母葉片來(lái)說(shuō)，葉中部位為葉綠素儀測(cè)定的最佳葉片位置，且根據(jù)數(shù)據(jù)圖可知，最佳SPAD值在3.8～4.2。

圖1 葉片不同部位的SPAD值與葉綠素含量的相關(guān)性

2.3 不同植株間葉片葉綠素含量實(shí)測(cè)值與回歸方程預(yù)測(cè)值分析

為研究SPAD 便攜式葉綠素儀測(cè)得的葉片SPAD 值是否能代替分光光度法測(cè)定值，將測(cè)得浙貝母不同植株葉片SPAD值分別代入表2線性函數(shù)方程中，計(jì)算對(duì)應(yīng)葉片的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量的預(yù)測(cè)值（見表3）。由表3 可知，不同浙貝母植株對(duì)應(yīng)的SPAD值與葉綠素含量實(shí)測(cè)值均在一定區(qū)間內(nèi)的波動(dòng)，且葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量的波動(dòng)程度不同。其總?cè)~綠素含量波動(dòng)較大，為1.293～1.943 mg·g-1；葉綠素a含量波動(dòng)幅度較小，為0.127～0.189 mg·g-1；葉綠素b 含量波動(dòng)居中，為1.165～1.754 mg·g-1，SPAD值波動(dòng)范圍為1.589～3.956。

表3 不同植株葉片SPAD值與葉綠素含量的實(shí)測(cè)值及預(yù)測(cè)值

將浙貝母不同植株葉片的葉綠素實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見表4。由表4可知，浙貝母的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的數(shù)據(jù)分析，p值分別為0.344、0.132、0.152，均大于0.05，這說(shuō)明通過(guò)線性函數(shù)y=0.036 2x+0.052 4、y=0.367 6x+0.390 8、y=0.326 6x+0.660 6 分別得到的浙貝母不同植株葉片葉綠素a 含量、葉綠素b 含量、總?cè)~綠素含量的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值間差異不顯著。因此，可以通過(guò)線性函數(shù)方程預(yù)測(cè)浙貝母葉片中的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的絕對(duì)含量。

表4 葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值間方差分析

3 小結(jié)

通過(guò)將葉綠素儀測(cè)得葉綠素相對(duì)含量和丙酮法測(cè)定的各部位葉綠素絕對(duì)含量進(jìn)行線性函數(shù)與數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)浙貝母葉片的葉綠素含量與SPAD 值呈極顯著正相關(guān)，且葉綠素儀測(cè)定浙貝母葉片的最佳部位為葉中，試驗(yàn)結(jié)果為浙貝母葉綠素含量相關(guān)研究提供了理論基礎(chǔ)。SPAD 值作為一個(gè)無(wú)量綱比值，可以在自然環(huán)境下無(wú)損地測(cè)定植物葉片當(dāng)前的葉綠素相對(duì)含量[14]。葉片SPAD 值采用的測(cè)定儀器是便攜式SPAD 葉綠素儀，主要利用了葉綠素光譜吸收峰在藍(lán)光和紅光區(qū)域的特性，通過(guò)發(fā)射650 nm 和940 nm 的光波，計(jì)算葉片在這兩處波長(zhǎng)處的光透過(guò)率之比來(lái)表示葉綠素含量相對(duì)應(yīng)的參數(shù)SPAD值[15]。

本文研究表明浙貝母葉片的SPAD 值與葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量之間均呈極顯著正相關(guān)，這說(shuō)明使用葉綠素儀能夠較好地反映浙貝母葉片的實(shí)際葉綠素含量，該結(jié)果與前人在紅楓[16]、葡萄[17]、桃樹[11]等上的研究結(jié)果一致。王林學(xué)等認(rèn)為葉片中部為葉綠素儀測(cè)定玉米最佳部位[18]，而焦穎[19]與潘義宏[20]研究結(jié)論表明葉片葉基部位為葉綠素儀測(cè)定的最佳部位。本研究發(fā)現(xiàn)葉片中部為使用葉綠素儀的測(cè)定最佳部位。因本次試驗(yàn)僅采用同一品種的浙貝母，對(duì)于不同浙貝母品種葉片各部位（葉尖、葉中、葉基）的葉綠素儀測(cè)定SPAD 值和葉綠素含量間的規(guī)律是否與本研究存在差異，還需進(jìn)一步深入研究。研究中的浙貝母葉片均來(lái)自重慶市萬(wàn)州區(qū)龍駒鎮(zhèn)梧桐村種植基地，生長(zhǎng)條件均一致，對(duì)于不同產(chǎn)地的浙貝母的葉綠素儀測(cè)定SPAD 值與葉綠素含量間規(guī)律是否與本試驗(yàn)一致，也需進(jìn)一步研究。