熊欣，周敏，夏紅英，劉慧，鐘振華

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

萘普生鈉為非甾體抗炎藥，其片劑為甲類非處方藥，口服吸收迅速而完全。主要用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，對(duì)各種疾病引起的疼痛和發(fā)熱有良好緩解作用。各國(guó)藥典收載的萘普生鈉原料藥及片劑標(biāo)準(zhǔn)中，項(xiàng)目及試驗(yàn)方法不盡相同，存在同一品種不同檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)象。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)比各國(guó)藥典及國(guó)內(nèi)企業(yè)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，篩選并優(yōu)化檢驗(yàn)項(xiàng)目，完善具體檢測(cè)方法，進(jìn)一步整合標(biāo)準(zhǔn)，盡量統(tǒng)一萘普生鈉各標(biāo)準(zhǔn)中相同檢驗(yàn)項(xiàng)目的具體試驗(yàn)參數(shù)，節(jié)約人力物力成本，簡(jiǎn)化試驗(yàn)操作流程，減少環(huán)境污染，保證測(cè)定結(jié)果的真實(shí)可靠性，進(jìn)而確保臨床用藥的安全性。

《中國(guó)藥典》2020 年版二部（以下簡(jiǎn)稱“ChP2020”）、歐洲藥典（以下簡(jiǎn)稱“EP10.0”）、美國(guó)藥典（以下簡(jiǎn)稱“USP-NF2022”）均收載了萘普生鈉原料藥［1-3］，項(xiàng)目與方法均有差異。此外，國(guó)內(nèi)兩個(gè)原料藥生產(chǎn)企業(yè)均有注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)，甲企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為YBH05492017，乙企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為YBH02692015。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD 型液相色譜儀（日本島津公司）；Autopol Ⅳ-T/V 型旋光儀（美國(guó)魯?shù)婪蚬荆?；Waters 2695 型液相色譜儀（美國(guó)沃特世科技有限公司）；Agilent 7890B 型氣相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；MS105 型電子天平（精密度：十萬(wàn)分之一，METTLER TOLEDO）；ML204 型電子天平（精密度：萬(wàn)分之一，METTLER TOLEDO）。

1.2 試藥

萘普生鈉對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100330-201503，含量100%）；萘普生鈉雜質(zhì)I（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100140-201704，含量100%）；萘普生鈉雜質(zhì)D（甲企業(yè)提供，批號(hào)WS2017001，含量97.2%）；萘普生鈉雜質(zhì)K（乙企業(yè)提供，批號(hào)10198697）；萘普生鈉雜質(zhì)N（乙企業(yè)提供，批號(hào)10198687）；萘普生鈉（甲企業(yè)批號(hào)：196 304401；196 304402；196 304403；乙企業(yè)批號(hào)：NS170201Z；NS170202Z；NS140504Z；NS130312）。冰醋酸（賽默飛世爾科技有限公司，色譜純）；乙腈（北京百靈威科技有限公司，色譜純）；異丙醇（永華化學(xué)科技有限公司，色譜純）；正己烷（永華化學(xué)科技有限公司，色譜純）；磷酸二氫鉀（西隴科學(xué)股份有限公司，分析純）；甲醇（北京百靈威科技有限公司，色譜純）；磷酸（西隴科學(xué)股份有限公司，分析純）；鹽酸（西隴科學(xué)股份有限公司，分析純）；氫氧化鈉（西隴科學(xué)股份有限公司，分析純）；三氯甲烷（上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司，分析純）；甲苯（TEDIA，色譜純）；二甲亞砜（永華化學(xué)科技有限公司，色譜純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 有關(guān)物質(zhì)

通過(guò)比較萘普生鈉2 家企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、各國(guó)藥典中萘普生、萘普生鈉及萘普生鈉片有關(guān)物質(zhì)色譜條件可知：（1）ChP2020、USP-NF2022 萘普生鈉有關(guān)物質(zhì)方法為TLC 法，該方法在專屬性、靈敏度、準(zhǔn)確性等方面均較HPLC 法差，且使用的展開(kāi)劑對(duì)人體毒性大；結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［4-7］，萘普生鈉工藝雜質(zhì)與降解雜質(zhì)較多，且大部分雜質(zhì)均有紫外吸收，薄層色譜法在專屬性、靈敏度、準(zhǔn)確性等方面對(duì)雜質(zhì)的分離及量均較難控制。（2）萘普生鈉2 家企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、ChP2020 萘普生、EP10.0 萘普生鈉、USP-NF2022 萘普生鈉片有關(guān)物質(zhì)方法為HPLC 法，ChP2020 萘普生方法中雜質(zhì)I 為外標(biāo)法，無(wú)系統(tǒng)適用性的限定；雜質(zhì)I 濃度較小時(shí)，易被主成分峰包裹，很難判斷是否檢出。（3）2 家企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的色譜條件在EP10.0 萘普生鈉的基礎(chǔ)上進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整（流速，柱溫，進(jìn)樣量），調(diào)整的范圍均符合耐用性要求［8］；市場(chǎng)份額較大的甲企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)其獨(dú)有工藝雜質(zhì)D 進(jìn)行了單獨(dú)控制；乙企業(yè)雜質(zhì)O 與EP10.0 萘普生有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)雜質(zhì)O 相同，該雜質(zhì)已在萘普生標(biāo)準(zhǔn)中控制，萘普生鈉中如有也應(yīng)以鈉鹽存在，故不再對(duì)其進(jìn)行控制；其他雜質(zhì)與EP10.0 萘普生鈉相同甲企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)還控制了雜質(zhì)D、雜質(zhì)L（即為ChP2020 萘普生雜質(zhì)I）的校正因子，說(shuō)明各企業(yè)根據(jù)自身產(chǎn)品的合成工藝及雜質(zhì)特點(diǎn)，在系統(tǒng)適用性與雜質(zhì)限度方面進(jìn)行了更嚴(yán)格的控制。各標(biāo)準(zhǔn)HPLC 法涉及色譜條件比較情況詳見(jiàn)表1。

表1 各標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)色譜條件比較情況表

通過(guò)試驗(yàn)可知，ChP2020 萘普生有關(guān)物質(zhì)方法［1］系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中，主成分峰與雜質(zhì)I 保留時(shí)間接近，詳見(jiàn)圖1，雜質(zhì)I濃度較小時(shí)，易被主成分峰包裹，很難判斷是否檢出。故建議增加萘普生鈉系統(tǒng)適用性要求。EP10.0 萘普生鈉有關(guān)物質(zhì)的系統(tǒng)適用性溶液中，各雜質(zhì)濃度與主成分濃度相當(dāng)，分離較好。但在甲企業(yè)樣品供試品溶液中雜質(zhì)I 與主成分峰最為接近，易被高濃度的主成分峰包裹，因此，擬修訂系統(tǒng)適用性溶液的配制方法，在供試品溶液加入限度量濃度的雜質(zhì)混合溶液，調(diào)整色譜條件，以達(dá)到更好的分離效果。因擬定系統(tǒng)適用性溶液中采用了雜質(zhì)K、D、N，故擬修訂雜質(zhì)列表，增加說(shuō)明雜質(zhì)K、D、N 相關(guān)情況。同時(shí)結(jié)合ChP2020 萘普生有關(guān)物質(zhì)色譜條件，使用外標(biāo)法對(duì)雜質(zhì)I 的量進(jìn)行控制。詳見(jiàn)圖 2。

圖1 ChP2020方法對(duì)照溶液色譜圖

圖2 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖

2.1.1 色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6 mm×100 mm，3 μm）；以乙腈-1.36 g/L 磷酸二氫鉀（85%磷酸調(diào)pH 至2.0）（38∶62）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；流速2.0 mL/min；柱溫50 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 方法學(xué)驗(yàn)證新擬定的有關(guān)物質(zhì)方法能有效分離主成分峰與各雜質(zhì)峰，精密度（n=6）、重復(fù)性（n=6）、耐用性良好。室溫下供試品溶液中雜質(zhì)量24 h 內(nèi)基本不變，滿足測(cè)定要求，穩(wěn)定性良好。雜質(zhì)I 在0.020 7～1.035 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好線性，回歸方程為y=55 511x+62.068，r=0.999 9，雜質(zhì)I 的回收率均在99.8%～101.4%之間，RSD 均為0.5%，回收率良好。雜質(zhì)I 最低檢測(cè)限為0.4 ng，定量限為1.0 ng。

2.1.3 雜質(zhì)D 校正因子的確定經(jīng)計(jì)算，雜質(zhì)D 的校正因子不在0.9～1.1 的范圍內(nèi)，不可采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)D 的含量。雜質(zhì)D 校正因子為1.27，約為1.3，詳見(jiàn)表2。

表2 雜質(zhì)D與萘普生鈉線性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 限度擬定結(jié)合EP10.0 萘普生鈉、企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及樣品的實(shí)際測(cè)定結(jié)果，擬定限度為：供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，雜質(zhì)I 按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，不得過(guò)0.1%，雜質(zhì)D 按校正后的峰面積計(jì)算（乘以校正因子1.3）不得大于對(duì)照溶液主峰面積（0.1%），其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的2 倍（0.2%），各雜質(zhì)（除雜質(zhì)I）校正后峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的5 倍（0.5%）。

2.1.5 樣品測(cè)定結(jié)果采用擬修訂方法對(duì)企業(yè)提供7批次樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果詳見(jiàn)表3。結(jié)果表明，2家企業(yè)樣品均符合擬定方法規(guī)定。

表3 擬定方法測(cè)定樣品結(jié)果

2.2 比旋度

ChP2020 萘普生鈉與乙企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，比旋度采用的方法是將萘普生鈉與鹽酸反應(yīng)生成萘普生，對(duì)萘普生的比旋度進(jìn)行測(cè)定，規(guī)定同萘普生規(guī)定一致。該方法操作較煩瑣，采用的試劑為三氯甲烷，對(duì)人體毒性較大；EP10.0 萘普生鈉、USP-NF2022 萘普生鈉及甲企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)則將萘普生鈉溶解在氫氧化鈉溶液中，直接測(cè)定其旋光度，該方法操作簡(jiǎn)便，試劑毒性較低。因測(cè)定比旋度需要的溶液量較多，故將萘普生鈉比旋度測(cè)定方法修訂統(tǒng)一為甲企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法。各標(biāo)準(zhǔn)方法比對(duì)情況詳見(jiàn)表4。

2.2.1 擬定方法取樣品約1.0 g，精密稱定，用4.2 g/L 氫氧化鈉溶液溶解制成每1 毫升中約含20 mg 的溶液，測(cè)定旋光度。比旋度應(yīng)為-17.0°至-14.7°。

2.2.2 樣品測(cè)定結(jié)果因甲企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法為擬采用方法，故對(duì)乙企業(yè)4 批次樣品采用修訂后方法測(cè)定比旋度，與原標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果比較詳見(jiàn)表5。結(jié)果表明，4 批樣品采用擬定方法測(cè)得結(jié)果均符合規(guī)定。

表5 方法修訂前后比旋度結(jié)果比對(duì)

2.3 L-萘普生鈉

通過(guò)分析生產(chǎn)企業(yè)提供的合成工藝可知，萘普生鈉由D,L-萘普生原料粗品拆分得到D-萘普生后，再與氫氧化鈉溶液反應(yīng)生成萘普生鈉鹽而得。有必要增訂L-萘普生鈉檢查項(xiàng)，對(duì)萘普生鈉中殘留的L-萘普生鈉對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行限定。甲企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（HPLC 法）、EP10.0 萘普生鈉（HPLC 法）、USPNF2022 萘普生鈉（TLC 法）均收載有L-萘普生的檢查項(xiàng)。與TLC 法比較，HPLC 法專屬性強(qiáng)，定量準(zhǔn)確性高。故采用HPLC 法測(cè)定萘普生鈉中L-萘普生鈉，擬增訂L-萘普生鈉檢查項(xiàng)。

2.3.1 色譜條件色譜柱：REGIS（S,S）-Whelk-O1手性硅膠柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以冰醋酸-乙腈-異丙醇-正己烷（5∶50∶100∶845）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為263 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

2.3.2 方法驗(yàn)證專屬性破壞試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能有效分離降解雜質(zhì)與L-萘普生，且未產(chǎn)生對(duì)L-萘普生測(cè)定有干擾的雜質(zhì)峰。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中，L-萘普生與萘普生峰分離度大于8.0。已知雜質(zhì)O、雜質(zhì)K、雜質(zhì)N、雜質(zhì)I、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E 及葡辛安與L-萘普生分離度良好，對(duì)L-萘普生鈉測(cè)定無(wú)干擾。L-萘普生鈉檢出限為0.52 ng。系統(tǒng)適用性圖譜詳見(jiàn)圖3。

圖3 L-萘普生鈉系統(tǒng)適用性色譜圖

2.3.3 限度擬定EP10.0 萘普生鈉及甲企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)L-萘普生鈉限度均為“供試品溶液色譜圖中L-萘普生鈉峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積（2.5%）”，該限度能有效保證萘普生鈉原料藥的質(zhì)量控制。故將該限度作為擬定限度。

2.3.4 樣品測(cè)定結(jié)果采用擬修訂方法對(duì)企業(yè)提供7批次樣品進(jìn)行測(cè)定，均未檢出L-萘普生鈉。結(jié)果詳見(jiàn)表6。

表6 L-萘普生樣品測(cè)定結(jié)果 %

2.4 殘留溶劑

甲企業(yè)萘普生鈉粗品合成路線的后續(xù)工藝中使用甲苯作為溶劑，企業(yè)自身的拆分工藝中使用甲醇作為溶劑，故該企業(yè)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的殘留溶劑項(xiàng)中檢測(cè)了甲醇和甲苯的殘留量；乙企業(yè)購(gòu)買的萘普生粗品有四段合成路線，前兩段工藝使用石油醚及異丙醇作為溶劑，后兩段采用水作為溶劑，企業(yè)自身的拆分工藝中使用甲醇作為溶劑，故該企業(yè)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的殘留溶劑項(xiàng)中只檢測(cè)了甲醇，而石油醚及異丙醇作為內(nèi)控指標(biāo)。結(jié)合各企業(yè)生產(chǎn)情況，本試驗(yàn)對(duì)該兩家企業(yè)樣品中的甲醇與甲苯進(jìn)行測(cè)定。

2.4.1 色譜條件色譜柱：DB-WAX（Agilent，30 m× 0.53 μm×1.00 μm）；升溫程序：起始溫度為70 ℃，維持5 min，以每分鐘20 ℃的速率升溫至200℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度：180 ℃；檢測(cè)器溫度：250℃；頂空瓶平衡溫度80 ℃，平衡時(shí)間30 min；進(jìn)樣體積：1.0 mL。

2.4.2 方法驗(yàn)證系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中，甲醇峰與甲苯峰間分離度為13.4；甲醇在1.009 4～10.094 0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性，回歸方程為y=2.583 8x+0.666 4，R2=0.999 6，甲苯在0.955 6～9.556 0 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好線性，回歸方程為y=85.873 1x-15.905 8，r=0.999 6；精密度（n=6）、重復(fù)性（n=6）、溶液24 h穩(wěn)定性均良好；甲醇回收率均在100.7%～105.8%之間，RSD 均為2.1%，甲苯回收率均在92.0%～95.9%之間，RSD 均為1.3%，回收率良好；甲醇定量限為1.009 4 μg/ mL，檢出限為0.302 8 μg/mL；甲苯定量限為0.038 2 μg/mL，檢出限為0.011 5 μg/mL。系統(tǒng)適用性圖譜詳見(jiàn)圖4。

圖4 殘留溶劑系統(tǒng)適用性色譜圖

2.4.3 限度擬定ChP2020、甲企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、乙企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及國(guó)外藥典均未收載殘留溶劑項(xiàng)。將限度擬定為甲企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中殘留溶劑限度“供試品溶液中如有被測(cè)溶劑峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，甲醇的殘留量不得過(guò)0.005%，甲苯的殘留量不得過(guò)0.005%”。

2.4.4 樣品測(cè)定結(jié)果采用擬修訂方法對(duì)企業(yè)提供7批次樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果詳見(jiàn)表7。

3 討論

藥品標(biāo)準(zhǔn)理應(yīng)客觀反映出藥品相關(guān)特點(diǎn)，才能確保藥品標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施取得預(yù)期效果。在新藥品研發(fā)與臨床試驗(yàn)中，由于時(shí)間的緊迫性，部分藥品尚未完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)也處于探索階段。我國(guó)現(xiàn)行藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有著諸多種類，針對(duì)同一品種，有著不同檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，造成在藥品質(zhì)量檢驗(yàn)中，無(wú)法統(tǒng)一藥品標(biāo)準(zhǔn)，影響到藥品檢驗(yàn)效果［9-11］。因此，有必要進(jìn)一步規(guī)范萘普生鈉檢驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步完善具體檢驗(yàn)方法，保證檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)可靠性，進(jìn)而確保臨床用藥的質(zhì)量及安全性。本試驗(yàn)統(tǒng)一萘普生鈉有關(guān)物質(zhì)、比旋度、L-萘普生鈉、殘留溶劑測(cè)定方法，各項(xiàng)目方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，為萘普生鈉合理控制質(zhì)量提供檢驗(yàn)依據(jù)。