彭 雪，邵洪江，候春梅，趙 永，陳 鶴

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150081

損傷時間推斷是法醫(yī)病理檢驗過程中需要解決的一個關(guān)鍵問題，準(zhǔn)確的損傷時間不僅能夠重建案件過程，并且有助于判斷損傷與死因之間的關(guān)系。在很多刑事案件中，骨骼肌挫傷出現(xiàn)的頻率非常高。然而，目前大多數(shù)關(guān)于法醫(yī)損傷時間推斷的研究都集中在人和小鼠皮膚損傷愈合過程中，有關(guān)骨骼肌挫傷時間的推斷研究相對較少［1］。

鈣敏感受體（calcium sensing receptor，CaSR）作為G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，已證實其能夠通過感應(yīng)細(xì)胞外Ca2+濃度變化來調(diào)控胞漿內(nèi)Ca2+濃度，從而影響細(xì)胞增殖、凋亡等。CaSR最主要的生理功能是參與體內(nèi)Ca2+及其他金屬離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，同時還參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、離子通道活化、基因表達(dá)以及炎癥反應(yīng)等過程［2］。當(dāng)前，CaSR 的研究主要集中在腫瘤、心血管系統(tǒng)疾病、肺動脈高壓、缺血性腦卒中以及甲狀旁腺功能亢進等，很少有研究涉及CaSR 與骨骼肌挫傷修復(fù)。已有研究［3］證實，骨骼肌再生與Ca2+關(guān)系密切。據(jù)此，研究者推測CaSR可能參與了骨骼肌挫傷修復(fù)。

因此，本實驗建立大鼠骨骼肌挫傷修復(fù)模型，采用HE 染色方法觀察大鼠骨骼肌損傷后的形態(tài)學(xué)變化，檢測骨骼肌挫傷后鈣離子濃度變化，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測各組CaSR 的表達(dá)變化，為法醫(yī)學(xué)損傷時間的推斷提供新的思路和證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組

取SD 大鼠（180～220 g）50 只，動物等級：SPF 級，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，SYXK （黑）2019-001。隨機分為10組：對照組1組、實驗組9組，每組又分為3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d時間段，每個時間段使用5只大鼠。每個時間段的大鼠以消毒飼料及蒸餾水分籠飼養(yǎng)，保持墊料清潔及空氣通暢。

1.2 大鼠骨骼肌挫傷模型的制作

用10%水合氯醛（25 mL/kg）腹腔注射麻醉后，將大鼠后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，用重500 g的自制打擊器，從54 cm高處自由垂直落下打擊動物右側(cè)腓腸肌，重力為4.9 N，動能為2.646 J，打擊面積約0.785 cm2。按時在損傷后不同時間將大鼠脫頸椎致死，取損傷處骨骼肌，迅速放入4%多聚甲醛/PBS 中固定12 h 后用石蠟包埋，切片。余下骨骼肌4 ℃蒸餾水中洗凈，液氮凍干，-80 ℃保存用于實時熒光定量PCR檢測。

1.3 HE染色

二甲苯、梯度酒精對組織切片脫蠟至水；蘇木素染色、鹽酸酒精分化、自來水返藍(lán)、伊紅染色、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

組織切片后，脫蠟，透明。切片分別加入兔抗大鼠CaSR 多克隆抗體（1∶100，PB9924，武漢博士德公司），4 ℃過夜孵育后，沖洗。滴加生物素化羊抗兔二抗，室溫孵育，沖洗；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-堿性磷酸酶，室溫，沖洗。DAB顯色。在×400倍鏡下，每張切片分別于挫傷中心區(qū)及周邊區(qū)各隨機選擇10個視野進行CaSR陽性細(xì)胞計數(shù)。挫傷周邊區(qū)限定范圍為挫傷中心區(qū)邊界至其外200 μm 內(nèi)。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件進行形態(tài)學(xué)觀察和分析，計算各挫傷組陽性細(xì)胞數(shù)平均值。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

肌肉組織低溫充分勻漿后，按照PrimeScriptTM RT 試劑盒［DRR037S，寶生物工程（大連）有限公司］操作說明書，抽提總RNA，取總RNA 5 μL，在20 μL 逆轉(zhuǎn)錄體系中合成cDNA，以5 μL cDNA 為模板加入靶基因上下游引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。使用ABI 7500 Real-Time PCR System PCR 儀進行擴增。最后，用2-ΔΔCT統(tǒng)計學(xué)方法分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨骼肌挫傷后形態(tài)學(xué)變化

骨骼肌經(jīng)HE 染色后在100 倍光鏡下觀察，評估肌肉損傷后的形態(tài)變化。對照組大鼠骨骼肌細(xì)胞胞質(zhì)呈粉紅色，肌細(xì)胞核呈卵圓形、藍(lán)色，多個細(xì)胞核位于骨骼肌細(xì)胞邊緣。骨骼肌挫傷后6 h 可見骨骼肌肌纖維間大量出血；12 h 可見出血伴炎細(xì)胞浸潤；挫傷后1 d 炎細(xì)胞繼續(xù)增多；挫傷3 d 可見壞死肌纖維伴逐漸增多的炎性細(xì)胞浸潤；挫傷后5 d，少量新生肌細(xì)胞出現(xiàn)，肌細(xì)胞核位于細(xì)胞中央；挫傷后第7～10 d，新生肌細(xì)胞增多，炎性細(xì)胞逐漸減少；挫傷后第14 d，肌細(xì)胞大都位于肌纖維的邊緣，肌細(xì)胞境界分明，排列規(guī)則，中央成核肌細(xì)胞幾乎消失，見圖1。

圖1 各組大鼠骨骼肌HE染色結(jié)果（×400，標(biāo)尺=50 μm）

2.2 正常對照組與挫傷組大鼠骨骼肌CaSR 的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

CaSR 在骨骼肌挫傷后1 d 表達(dá)增加，挫傷后3 d 表達(dá)進一步增加，挫傷后5 d 表達(dá)至頂峰，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。隨后CaSR表達(dá)開始減少，挫傷后14 d恢復(fù)至正常對照組水平（圖2、圖3）。

圖2 各組大鼠骨骼肌不同時間點CaSR的表達(dá)（×400，標(biāo)尺=50 μm）

圖3 挫傷骨骼肌CaSR蛋白水平檢測

2.3 正常對照組與挫傷組大鼠骨骼肌CaSR mRNA的表達(dá)

CaSR mRNA 在骨骼肌挫傷后6 h 開始呈規(guī)律性增加，挫傷后5 d 至高峰，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。隨后表達(dá)減少，挫傷后14 d恢復(fù)至正常對照組水平，見表1。

表1 肌肉挫傷后不同時間點CaSR mRNA表達(dá)量（±s）

表1 肌肉挫傷后不同時間點CaSR mRNA表達(dá)量（±s）

組別對照組挫傷后3 h組挫傷后6 h組挫傷后12 h組挫傷后24 h組挫傷后3 d組挫傷后5 d組挫傷后7 d組挫傷后10 d組挫傷后14 d組CaSR mRNA 1.000±0.235 1.211±0.145 2.402±0.423 3.766±0.045 4.523±0.409 6.298±0.321 9.586±0.576 7.020±0.214 3.562±0.478 1.298±0.607

3 討論

損傷時間推斷是法醫(yī)病理工作者實踐中重要的工作內(nèi)容之一。在法醫(yī)學(xué)實踐中，損傷時間推斷涉及不同器官組織，但現(xiàn)有研究主要集中在皮膚和腦，其他器官組織的研究較少，部分器官組織甚至為空白。由于不同器官組織結(jié)構(gòu)不同，損傷修復(fù)機制存在顯著差別，不能將某種器官組織損傷時間推斷的研究成果用于其他器官組織［1］。而本研究報道了大鼠骨骼肌挫傷后不同時間點的形態(tài)學(xué)變化以及骨骼肌中CaSR 蛋白和mRNA 水平動態(tài)變化趨勢，為法醫(yī)學(xué)損傷時間推斷的研究提供了全新的依據(jù)。

骨骼肌挫傷后肌肉纖維因為受損，處于靜止的衛(wèi)星細(xì)胞被激活并形成新的成肌細(xì)胞。隨后，成肌細(xì)胞與現(xiàn)有的損傷肌纖維融合，最終形成新的肌管或者修復(fù)受損肌纖維。HE 染色結(jié)果顯示：骨骼肌挫傷后的早期可見明顯出血及以中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等為主的炎細(xì)胞浸潤；挫傷后3 d，可見明顯壞死肌纖維伴逐漸增多的炎性細(xì)胞浸潤；挫傷后5 d，少量新生肌細(xì)胞出現(xiàn)，肌細(xì)胞核位于細(xì)胞中央；挫傷后第7～10 d，新生肌細(xì)胞增多，炎性細(xì)胞逐漸減少；挫傷后第14 d，肌細(xì)胞大都位于肌纖維的邊緣，肌細(xì)胞境界分明，排列規(guī)則，中央成核肌細(xì)胞幾乎消失。該結(jié)果與相關(guān)文獻報道具有一致性［4-5］，且規(guī)律呈現(xiàn)骨骼肌損傷后修復(fù)的3 個病理進程，即急性損傷炎癥期、修復(fù)期和組織塑形期［6-7］。

鈣敏感受體是鈣穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑［8］，作為細(xì)胞外Ca2+濃度的調(diào)節(jié)劑，已被證明是生理學(xué)和病理學(xué)中的重要分子［9］。它屬于G蛋白偶聯(lián)受體，可感知細(xì)胞外的分子并激活內(nèi)部信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并最終激活細(xì)胞反應(yīng)［10］。

CaSR 主要在甲狀旁腺內(nèi)表達(dá)，并調(diào)節(jié)甲狀旁腺激素的分泌，從而通過作用于腎臟、骨骼和腸道來將Ca2+濃度維持在生理范圍內(nèi)，進而控制鈣穩(wěn)態(tài)［8］。最初，CaSR 的研究集中在促鈣組織，如甲狀旁腺、腎臟和骨骼，這些組織在維持鈣穩(wěn)態(tài)方面具有明顯的作用。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，CaSR 在許多其他細(xì)胞和器官（如神經(jīng)元、肺、皮膚、胎盤、乳房和血管）中表達(dá)，在維持鈣穩(wěn)態(tài)方面沒有任何明顯作用［2］。此外，最近的一些研究［11-14］已經(jīng)觀察到CaSR在細(xì)胞（如角質(zhì)形成細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)元）的生理分化以及平滑肌收縮和增殖中發(fā)揮重要作用。

最近，在一項探索健康人類骨骼肌中CaSR 的研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CaSR不參與肌纖維的生成［15］。然而，本研究免疫組織化學(xué)染色結(jié)果以及實時熒光定量PCR檢測結(jié)果均證實，挫傷后CaSR呈規(guī)律性表達(dá)。挫傷早期CaSR表達(dá)開始增加，挫傷修復(fù)期CaSR 表達(dá)達(dá)到頂峰，隨后開始下降至正常水平。還有一項最近的研究報道，運動所致的局部肌肉損傷會激活一種不依賴于肌肉干細(xì)胞的肌纖維自我修復(fù)機制，小鼠的肌肉損傷觸發(fā)了涉及鈣離子和磷酸激酶C的信號級聯(lián)反應(yīng)［16］。

同時，通過免疫組化染色結(jié)果，研究者還發(fā)現(xiàn)在挫傷后的炎癥期內(nèi)，CaSR 主要定位于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。挫傷進入修復(fù)期后，在成纖維細(xì)胞以及新形成的成肌細(xì)胞中均可見CaSR 蛋白大量表達(dá)。同時，諸多研究已證實，CaSR 能夠參與炎癥細(xì)胞的調(diào)控［17］。而骨骼肌挫傷修復(fù)與炎癥細(xì)胞關(guān)系密切，因此，CaSR 參與的骨骼肌挫傷修復(fù)，很可能有多條途徑，可能通過調(diào)控炎癥細(xì)胞進而促進肌纖維再生，或者直接作用于肌纖維，這需要進一步的研究證實。

綜上所述，研究者認(rèn)為CaSR 參與了骨骼肌挫傷后修復(fù)愈合的過程，并在挫傷后的不同階段發(fā)揮了不同作用。同時，CaSR 的表達(dá)與骨骼肌損傷時間具有一定的相關(guān)性，可以為骨骼肌損傷時間推斷提供參考依據(jù)。